Gradient Stamm Chip für anregende zellulären Verhaltensweisen in Zelle beladenen Hydrogel

Das übergeordnete Ziel dieses Gradientendehnungschips ist es, einen einfachen Ansatz zur Erzeugung von nicht-kontinuierlichen gradienten statischen Dehnungen auf einem 3D-Hydrogel für die Untersuchung des Zellverhaltens unter einer Reihe von Dehnungsbedingungen bereitzustellen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich des Bioengineerings zu beantworten, wie z.B. die Stimulation einer Stammzelldifferenzierung und die Regulation der zellulären Ausrichtung für die Entwicklung künstlicher Gewebeorgane. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass verschiedene Stämme auf die Zellschicht und Hydrogele in derselben Mikroumgebung aufgebracht werden können, um das Zellverhalten zu vergleichen.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Chipvorbereitung schwer zu erlernen sind, da das Licht für die Versuchsbasis in drei bis vier Stunden abgeschlossen sein sollte, um eine hohe Zellvariabilität zu gewährleisten. Wiegen Sie 10 Gramm Gelatinepulver und geben Sie es in einen Glaskolben mit 100 Millilitern Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder DPBS. Legen Sie einen magnetischen Rührstab in den Kolben und stellen Sie den Kolben auf eine Rührplatte.

Decken Sie den Kolben mit Alufolie ab, um Wasserverdunstung zu vermeiden. Stellen Sie die Temperatur der Heizplatte auf 50 bis 60 Grad und den Rührer eine Stunde lang auf 100 U/min ein, um das Gelatinepulver aufzulösen. Nachdem sich die Gelatine aufgelöst hat, fügen Sie sehr langsam mit einer Pipette acht Milliliter Methacrylanhydrid hinzu.

Lassen Sie es drei Stunden lang bei 60 Grad Celsius reagieren. Anschließend wird vorgewärmtes DPBS bis zu einem Endvolumen von 500 Millilitern in den Kolben gegeben. Lassen Sie die Lösung 15 Minuten lang gut mischen, um die Reaktion zu stoppen.

Schneiden Sie währenddessen eine Dialysemembran in mehrere 25 Millimeter lange Röhren. Tauchen Sie sie 15 Minuten lang in entionisiertes Wasser. Und machen Sie einen Knoten, um ein Ende der Dialyseschläuche zu verschließen.

Laden Sie die entsprechende Menge der Polymerlösung in die Dialyseröhrchen und schließen Sie das andere Ende. Legen Sie dann die gefüllten Röhrchen für eine Woche in ein Fünf-Liter-Plastikbecherglas mit entionisiertem Wasser. Erneuern Sie das deionisierte Wasser zweimal täglich und halten Sie die Lösung während des Dialyseprozesses auf 40 bis 50 Grad Celsius.

Nach der Dialyse die Lösung aus den Röhrchen in eine 500-Milliliter-Glasflasche geben. Gießen Sie etwa 450 bis 500 Milliliter Lösung in einen 500-Milliliter-Filterbecher. Und wenden Sie ein Vakuum an, um die Lösung zur Sterilisation durch die Filtermembran zu strömen.

Übertragen Sie dann das sterilisierte Polymer in mehrere sterilisierte 50-Milliliter-Röhrchen. Füllen Sie das sterilisierte Polymer in mehrere 50 Milliliter sterilisierte Röhrchen um und lagern Sie diese drei bis fünf Tage in einem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius. Trocknen Sie das bei minus 80 Grad Celsius heiße Polymer eine Woche lang mit einem Gefriertrockner zu GelMA, das dann in einem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden kann.

Für die Chipherstellung bereiten Sie zunächst das Polymethacrylat oder PMMA vor, das wie im Textprotokoll beschrieben abgespielt und geformt wird. Bereiten Sie dann die PTMS-Abdeckung und den PTMS-Stopfen vor, indem Sie 30 Gramm PTMS-Elastomer und drei Gramm PTMS-Härter richtig mischen. Entgasen Sie das Gemisch eine Stunde lang unter einer Vakuumkammer.

Gießen Sie 1,8 bis zwei Gramm der Mischung in die PMMA-Form für die PTMS-Abdeckung. Verwenden Sie auch die entsprechende Menge, um jeden Hohlraum für die PMMA-Form für den PTMS-Stopfen zu füllen. Gießen Sie zusätzlich 10 Gramm ungehärtete PTMS-Mischung in eine leere 10 Zentimeter große Kunststoffplatte.

Stellen Sie diese Formen in eine Vakuumkammer, um sie 30 Minuten lang zu entgasen. Härten Sie das PTMS zwei Stunden lang bei 80 Grad Celsius aus. Nach dem Abkühlen des ausgehärteten PTMS auf der Form lösen Sie die PTMS-Abdeckungen und die PTMS-Stopfen von den PMMA-Formen.

Stanzen Sie anschließend zwei Löcher mit einem Durchmesser von etwa drei Millimetern an den Enden der Strömungskanäle der PTMS-Abdeckungen. Schneiden Sie das aus der 10 Zentimeter großen Kunststoffplatte geformte PTMS-Blech in viele Würfel von einem Zentimeter mal einem Zentimeter. Und stanzen Sie ein drei Millimeter großes Loch in jeden PTMS-Würfel.

Kleben Sie zwei nicht ausgehärtete PTMS-Würfel von einem Zentimeter mal einem Zentimeter auf die Öffnungen der PTMS-Abdeckung, um als mittlere Reservoire zu dienen und den Aushärtungsprozess der kreisförmigen Hydrogelmuster zu unterstützen. Anschließend eine Stunde bei 80 Grad Celsius aushärten. Als nächstes kleben Sie die PTMS-Abdeckungen mit den beiden PTMS-Reservoiren auf einen TMSPMA-beschichteten Objektträger.

Behandeln Sie dazu die Klebeseite der PTMS-Abdeckung und des TMSPMA-beschichteten Objektträgers unter einem Sauerstoffplasmagerät für eine 90-sekündige Sauerstoffplasmabehandlung vor. Berühren Sie die plasmabehandelte Oberfläche der PTMS-Abdeckungen und des TMSPMA-Objektträgers und drücken Sie sie eng an, um eine dauerhafte Verbindung durch die Bildung der Silizium-Sauerstoff-Silizium-Bindung zu erreichen. Drucken Sie eine Fotomaske, indem Sie das festgelegte Layout auf eine transparente Folie drucken.

Schneiden Sie dann die gedruckte Fotomaske auf eine Größe von 25 Millimetern x 37,5 Millimetern zu. Wiegen Sie 25 Milligramm gefriergetrocknetes GelMA in 0,3 Milliliter vorgewärmtes Zellkulturmedium in einem schwarzen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Legen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen auf eine Laborrührer-Heizplatte, bis sich das GelMA im Medium aufgelöst hat.

Geben Sie 50 Milligramm Photoinitiator zu einem Milliliter DPBS in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Und legen Sie es für 15 Minuten in einen 80 Grad Celsius heißen Ofen oder bis sich der Photoinitiator aufgelöst hat. Geben Sie 25 Mikroliter des 10%-Photoinitiators in das Mikrozentrifugenröhrchen.

Mehrmals pipettieren, um gut zu vermischen. Zählen Sie als Nächstes drei Millionen NIH3T3-Zellen mit einem automatisierten Zellzähler. Nachdem die Suspension fünf Minuten lang bei 200 g zentrifugiert wurde, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 175 Mikrolitern Zellkulturmedium.

Geben Sie die Zelllösung in das Mikrozentrifugenröhrchen, um eine Präpolymer-Zelllösung von 5 % GelMA, 0,5 % Photoinitiator und etwa sechs Millionen 3T3-Zellen pro Milliliter zu erhalten. Nach dem Mischen 100 Mikroliter Zellprepolymer in eine 100 Mikroliter Mikrospritze geben. Richten Sie ein Stück der Fotomaske manuell auf dem unteren Objektträger des sterilisierten Gradientendehnungschips aus.

Und fixieren Sie die Position einfach mit einem kleinen Tropfen deionisiertem Wasser dazwischen. Verbinden Sie die 100-Mikroliter-Mikrospritze, die mit Prepolymer-Zelllösung beladen ist, mit dem Einlass des Chips. Geben Sie dann 50 Mikroliter Prepolymer-Zelllösung mit der Mikrospritze in den Strömungskanal und verschließen Sie den Auslass mit einem PTMS-Stecker.

Injizieren Sie zusätzlich 40 Mikroliter Lösung, um eine konvexe Ausbuchtung in der kreisförmigen PTMS-Membran zu erzeugen. Bewegen Sie den Chip mit der Fotomaske, der Mikrospritze und dem PTMS-Stecker unter eine UV-Lampe. Und belichten Sie es für 30 bis 45 Sekunden, um das konzentrische kreisförmige Hydrogel in der Fluidikkammer zu vernetzen.

Entfernen Sie nach dem Quervernetzen den PTMS-Stopfen und die Mikrospritze, um den Flüssigkeitsdruck abzulassen. Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit vorgewärmtem DPBS beladen ist, um unvernetzte Harze dreimal auszuwaschen, indem Sie vom Einlass zum Auslass spülen. Füllen Sie anschließend den Durchflusskanal mit ca. 100 Mikrolitern Zellkulturmedium.

Legen Sie den Chip in eine sterilisierte Kulturschale und züchten Sie ihn eine Woche lang in einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius. Frischen Sie das Medium jeden Tag auf. Nehmen Sie Bilder von drei Chips am Tag Null nach vier Stunden Inkubation als Kontrollgruppe auf.

Und drei Chips am dritten Tag als Versuchsaufbau mit einem Mikroskop mit einem 20-fachen Objektiv. Messen Sie die Linienbreite jedes Hydrogels von Linie eins bis Zeile 12 mit einer Software, um die Kompressenflecken zu berechnen. Hier sind repräsentative Ergebnisse von Hydrogelmustern mit null Mikrolitern und 40 Mikrolitern über der Injektion, nach UV-Vernetzung und vierstündiger Inkubation gezeigt.

Die Linienbreite des 3D-Hydrogels in der Steuerung ohne Überinjektion sieht erwartungsgemäß gleichmäßig aus. Die Hydrogelmuster mit 40 Mikrolitern über der Injektion ergeben jedoch einen Gradienten der Linienbreite von Hydrogelen, der von Linie eins bis Linie 12 abnimmt. Nach dreitägiger Inkubation dehnen sich die Zellen im Hydrogel in verschiedene Richtungen aus.

Die Zellen in Linie eins richten sich aufgrund der Stimulation der Hydrogel-Elongation entlang der radialen Richtung aus. Im Gegensatz dazu richten sich die Zellen in Linie 12 entlang der Hydrogelform aus, wobei der Geometriehinweis die zelluläre Ausrichtung dominiert. Es gibt keine spezifische Zellausrichtung in Zeile 7, bei der sich die beiden zellulären Ausrichtungshinweise von Zeile eins und Zeile 12 ausgleichen.

Sobald die Messung der Mikroumgebung von Gradientendehnungen auf 3D-Hydrogel mit dem Gradientendehnungschip in zwei Stunden durchgeführt werden kann, kann dies bei richtiger Durchführung erfolgen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, den Gradientenstamm-Chip zu sterilisieren, bevor die Zell-Prepolymer-Lösung geladen wird. Wischen Sie auch die Oberfläche des Chips gründlich mit 75%igem Ethanol ab, bevor Sie die Chips in den Zellkultur-Inkubator legen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein sehr gutes Verständnis dafür haben, wie man einen Gradienten-Dehnungschip generiert, um das Zellverhalten unter verschiedenen imperialen Stämmen zu untersuchen.