Name: Gradient Stamm Chip für anregende zellulären Verhaltensweisen in Zelle beladenen Hydrogel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Erfahren Sie, wie ein Gradient-Stamm-Chip nicht-kontinuierliche statische Dehnungen auf zellbeladenem Hydrogel erzeugt, um Zellverhalten und Ausrichtung im Tissue Engineering zu untersuchen.

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Dieses Projekt wurde durch die Graduate Student Studium im Ausland Programm (NSC-101-2917-I-007-010) unterstützt; die biomedizinische Technik-Programm (NSC-101-2221-E-007-032-MY3); und die Nanotechnologie National Program (NSC-101-2120-M-007-001-), National Science Council der r.o.c., Taiwan. Die Autoren möchten Prof. Ali Khademhosseini, Gulden Camci-Ünal, Arghya Paul und Ronglih Liao an der Harvard Medical School danken für die gemeinsame Nutzung der Hydrogel und Zelle Kapselung-Technologie.

1. GelMA-Synthese
<ol>
	<li>Wiegen Sie 10 g Gelatinepulver und geben Sie es in einen Glaskolben mit 100 ml Dulbecco-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (DPBS). Legen Sie einen magnetischen Rührstab in den Kolben und stellen Sie den Kolben auf eine Rührplatte.</li>
	<li>Decken Sie den Kolben mit Alufolie ab, um Wasserverdunstung zu vermeiden. Stellen Sie die Temperatur der Heizplatte auf 50-60 °C und den Rührer auf 100 U/min für 1 h ein, um das Gelatinepulver gut aufzulösen.</li>
	<li>Nachdem sich die Gelatine aufgelöst hat, fügen Sie sehr langsam (ein Tropfen pro Sekunde) mit einer Pipette 8 ml Methacrylanhydrid hinzu. Lassen Sie es bei 60 °C 3 h lang reagieren.</li>
	<li>Vorgewärmtes DPBS (40 °C) bis zu einem Endvolumen von 500 mL in den Kolben geben und 15 Minuten lang gut mischen lassen, um die Reaktion zu stoppen.</li>
	<li>Schneiden Sie in der Zwischenzeit eine Dialysemembran (14 kDa Cut-off-Molekulargewicht) in mehrere 25 cm lange Röhrchen. Tauchen Sie sie 15 Minuten lang in entionisiertes (DI) Wasser und machen Sie einen Knoten, um ein Ende der Dialyseschläuche zu schließen.</li>
	<li>Laden Sie die entsprechende Menge (30 - 60 ml) der Polymerlösung in die Dialyseröhrchen und schließen Sie das andere Ende. Legen Sie sie eine Woche lang in ein 5-Liter-Plastikbecherglas mit DI-Wasser. Erneuern Sie das DI-Wasser zweimal täglich und halten Sie die Lösung während des Dialyseprozesses auf 40 - 50 °C.</li>
	<li>Sammeln Sie die Lösung aus dem Röhrchen in einer 500-ml-Glasflasche. Gießen Sie ~450 - 500 ml Lösung in einen 500-ml-Filterbecher (Porengröße von 0,22 μm) und üben Sie ein Vakuum auf den Filterbecher aus, um die Lösung zur Sterilisation durch die Filtermembran zu zwingen.</li>
	<li>Füllen Sie das sterilisierte Polymer in mehrere sterilisierte 50-ml-Röhrchen um und lagern Sie diese 3 - 5 Tage in einem -80 °C-Gefrierschrank.</li>
	<li>Trocknen Sie das Polymer bei -80 °C 1 Woche lang mit einem Gefriertrockner, um GelMA zu bilden. Lagern Sie das GelMA in einem -80 °C Gefrierschrank.</li>
</ol>
2. 3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat (TMSPMA) Modifikation
<ol>
	<li> Schneiden Sie handelsübliche Objektträger in zwei kleine Stücke (25 mm x 37,5 mm) und tauchen Sie sie 4 h lang in 0,5 M NaOH-Lösung. Waschen Sie die Objektträger mit einer großen Menge DI-Wasser.</li>
	<li>Legen Sie den Objektträger auf ein Gestell in einem Glasbehälter mit 95 % Ethanol und reinigen Sie ihn 15 Minuten lang mit einem Ultraschallgerät bei 43 kHz. Trocknen Sie den Objektträger an der Luft.</li>
	<li>Tauchen Sie die Objektträger 1 h lang in 5 % TMSPMA in 99,5 % Ethanol.</li>
	<li>Waschen Sie die Objektträger in 95%igem Ethanol, trocknen Sie die Objektträger an der Luft und glühen Sie die TMSPMA-Beschichtung 2 Stunden lang bei 80 °C im Ofen.</li>
</ol>
3. Chip-Herstellung
<ol>
	<li>Nehmen Sie eine 2 mm und eine 0,3 mm dicke Platte aus Polymethylmethacrylat (PMMA), kleben Sie doppelseitiges Klebeband auf eine Seite der PMMA-Oberfläche und lösen Sie die Folie auf einer Seite. Lassen Sie zwei 2 mm dicke PMMA-Platten und eine 1 mm dicke Platte ohne doppelseitiges Klebeband.</li>
	<li>Laserschneiden Sie eine 2 mm dicke PMMA-Platte ohne doppelseitiges Klebeband auf 42 mm x 30 mm, um die Bodenplatte herzustellen. Schneiden Sie eine 2 mm dicke PMMA-Platte mit doppelseitigem Klebeband zu, um den Begrenzungsrahmen mit den Außenmaßen 42 mm x 30 mm und den Innenmaßen 37,5 mm x 25 mm herzustellen.</li>
	<li>Schneiden Sie die 0,3 mm dicke PMMA-Platte mit doppelseitigem Klebeband zu einem 12 mm großen Mittelkreis mit zwei 2 mm breiten und 8 mm langen Strömungskanälen auf gegenüberliegenden Seiten des Kreises (Abbildung 1a).</li>
	<li>Um die PMMA-Form für das Gießen der PDMS-Abdeckung vorzubereiten, montieren Sie die drei Teile der PMMA-Komponenten aus den Schritten 3.2-3.3 (Abbildung 1b) mit doppelseitigem Klebeband.</li>
	<li>Laserschneiden Sie eine 2 mm dicke PMMA-Platte mit doppelseitigem Klebeband in ein 5 cm x 5 cm großes Stück mit einem 3 x 3 Array von 8,5 mm x 8,5 mm hohlen Rechtecken. Schneiden Sie ein weiteres 5 cm x 5 cm großes Stück mit einer 3 x 3 Reihe von 4 mm Hohlkreisen aus. Laserschneiden Sie eine 1 mm dicke PMMA-Platte ohne doppelseitiges Klebeband in eine 5 cm x 5 cm große PMMA-Bodenplatte.</li>
	<li>Bereiten Sie die PMMA-Form für das Gießen des PDMS-Steckers vor, indem Sie die drei Teile der PMMA-Komponenten aus Schritt 3.5 (Abbildung 1c) mit doppelseitigem Klebeband zusammenfügen.</li>
	<li>Bereiten Sie die PDMS-Abdeckung und den PDMS-Stopfen vor, indem Sie 30 g PDMS-Elastomer und 3 g PDMS-Härter ordnungsgemäß mischen und das Gemisch 1 h lang in einer Vakuumkammer entgasen.</li>
	<li>Gießen Sie 1,8-2,0 g der Mischung in die PMMA-Form für die PDMS-Abdeckung und verwenden Sie die entsprechende Menge, um jeden Hohlraum der PMMA-Form für den PDMS-Stopfen zu füllen. 10 g der nicht ausgehärteten PDMS-Mischung in eine leere 10 cm dicke Kunststoffplatte gießen. Stellen Sie diese Formen in eine Vakuumkammer, um sie 30 Minuten lang zu entgasen.</li>
	<li>Härten Sie das PDMS 2 h lang bei 80 °C aus. Nach dem Abkühlen des ausgehärteten PDMS auf der Form lösen Sie die PDMS-Abdeckungen und die PDMS-Stecker von den PMMA-Formen.</li>
	<li>Stanzen Sie zwei Löcher mit einem Durchmesser von ca. 3 mm an den Enden der Strömungskanäle der PDMS-Abdeckungen.</li>
	<li>Schneiden Sie die aus der 10 cm Kunststoffplatte geformte PDMS-Platte in viele 1 cm x 1 cm große Würfel und stanzen Sie in jeden PDMS-Würfel ein 3 mm Loch. Kleben Sie zwei nicht ausgehärtete PDMS-Würfel von 1 cm x 1 cm auf die Öffnungen der PDMS-Abdeckung (um als mittlere Reservoire zu dienen und den Aushärtungsprozess der kreisförmigen Hydrogelmuster zu unterstützen) und härten Sie 1 h bei 80 °C aus.</li>
	<li>Verkleben Sie die PDMS-Abdeckungen mit den beiden PDMS-Reservoiren auf einen TMSPMA-beschichteten Objektträger, indem Sie die Klebeseite der PDMS-Abdeckung und den TMSPMA-beschichteten Objektträger unter einem Sauerstoffplasmagerät (30 W HF-Leistung (High-Mode) und 600 mTorr Druckluft) oder einem elektronischen Hochfrequenz-Koronagenerator (115 V, 50/60 Hz, 0,35 A) für eine 90 sO2-Plasmabehandlung vorbehandeln.</li>
	<li>Berühren Sie die plasmabehandelte Oberfläche der PDMS-Abdeckungen und des TMSPMA-Objektträgers und drücken Sie sie eng an, um eine dauerhafte Verbindung durch Bildung einer SI-O-SI-Bindung zu erreichen. 
	HINWEIS: Wenn Sie den Chip 1 h lang bei 80 °C in den Ofen stellen, kann die Haftfestigkeit weiter verbessert werden.</li>
	<li>Nach dem Abkühlen die Chips 15 min in 95%iges Ethanol tauchen und an der Luft trocknen. Anschließend sterilisieren Sie die Chips 1 h unter UV-Bestrahlung und lagern sie in einer in Alufolie eingewickelten Schachtel in der Laminarhaube.</li>
</ol>
4. Statische Gradientendehnung auf das zellbeladene Hydrogel
<ol>
	<li>Drucken und schneiden Sie ein Stück Fotomaske mit einer Größe von 25 mm x 37,5 mm aus, indem Sie das Layout in Abbildung 2b auf eine transparente Folie drucken. Passen Sie die gedruckte Größe von Abbildung 2b an die Dimension in Abbildung 2a an.</li>
	<li>Bereiten Sie 100 ml DMEM-Medium mit 10 % FBS, 1 % Pen-Strep und 250 ml DPBS in einem 37 °C warmen Wasserbad vor, um es als Zellkulturmedium zu verwenden.</li>
	<li>Wiegen Sie 25 mg gefriergetrocknetes GelMA in 0,3 ml vorgewärmtes (37 °C) Zellkulturmedium in einem schwarzen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Legen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen auf einen Laborrührer/eine Heizplatte, bis sich das GelMA im Medium aufgelöst hat.</li>
	<li>50 mg Photoinitiator in 1 ml DPBS in ein Mikrozentrifugenröhrchen wiegen und für 15 min in einen 80 °C Ofen stellen oder bis sich der Photoinitiator aufgelöst hat.</li>
	<li>Nehmen Sie 25 μl des 10%igen Photoinitiators aus Schritt 4.4 und geben Sie es in das Mikrozentrifugenröhrchen aus Schritt 4.3. Mehrmals pipettieren, um gut zu vermischen.</li>
	<li>Zählen Sie 3 x 106 NIH 3T3-Zellen mit einem automatisierten Zellzähler. Die Suspension wird 5 Minuten lang bei 200 x g zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Zellen in 175 μl Zellkulturmedium erneut suspendiert.</li>
	<li>Geben Sie die Zelllösung aus Schritt 4.6 in das Mikrozentrifugenröhrchen aus Schritt 4.5, um eine Prepolymer-Zelllösung aus 5 % GelMA, 0,5 % Photoinitiator und ~6 x 106 3T3 Zellen/ml zu erhalten. Nach dem Mischen 100 μl Zellpräpolymer in eine 100-μl-Mikrospritze geben.</li>
	<li>Richten Sie manuell (siehe Abbildung 3a) ein Stück der Fotomaske auf dem unteren Objektträger des sterilisierten Gradientendehnungschips aus und fixieren Sie die Position einfach mit einem kleinen Tropfen DI-Wasser dazwischen. Verbinden Sie die mit Prepolymer-Zelllösung beladene 100-μl-Mikrospritze mit dem Einlass des Chips.</li>
	<li>Geben Sie (siehe Abbildung 3b) Sie mit der Mikrospritze 50 μl Prepolymer-Zelllösung in den Durchflusskanal und verschließen Sie dann den Auslass mit einem PDMS-Stecker. Injizieren Sie zusätzlich 40 μl Lösung, um eine konvexe Ausbuchtung in der zirkulären PDMS-Membran zu erzeugen.</li>
	<li>Bewegen Sie den Chip mit der Fotomaske (unten), der Mikrospritze (Einlass) und dem PDMS-Stecker (Ausgang) aus Schritt 4.9 unter eine UV-Lampe (365 nm, 9 mW/cm2) und belichten Sie ihn für 30 - 45 s, um das konzentrische kreisförmige Hydrogel in der Fluidikkammer zu vernetzen.</li>
	<li>Entfernen Sie den PDMS-Stecker und die Mikrospritze, um den Flüssigkeitsdruck abzulassen (siehe Abbildung 3c). Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze, die mit vorgewärmtem DPBS beladen ist, um unvernetzte Harze 3 Mal auszuwaschen, indem Sie vom Einlass zum Auslass spülen.</li>
	<li>Füllen Sie den Durchflusskanal mit ca. 100 μl Zellkulturmedium.</li>
	<li>Legen Sie den Chip in eine sterilisierte Kulturschale und züchten Sie ihn eine Woche lang in einer Atmosphäre von 5 % CO2 bei 37 °C. Frischen Sie das Medium jeden Tag auf.</li>
	<li>Nehmen Sie Bilder von drei Chips am Tag 0 nach 4 Stunden Inkubation als Kontrollgruppe und von drei Chips an Tag 3 als Versuchssatz mit einem Mikroskop mit einem 20-fachen Objektiv auf. Messen Sie die Linienbreite jedes Hydrogels von Linie 1 bis Linie 12 mit Hilfe einer Software (z. B. ImageJ), um die Kompressionsdehnungen zu berechnen ( Abbildung 4). 
	HINWEIS: Der Dehnungsprozentsatz wird berechnet, indem der Wert der Linienbreitendifferenz zwischen 40 μL und 0 μL durch die Linienbreite bei 40 μL dividiert wird.</li>
</ol>
5. Zellfärbung für die Alignment-Analyse
<ol>
	<li>Verwenden Sie eine Spritze, um 4% Paraformaldehyd (PFA) in DPBS bei RT für 15 min in den Flow-Chip zu injizieren, um das zellbeladene Hydrogel zu fixieren. 
	HINWEIS: Vorsicht. PFA ist giftig und sollte mit Vorsicht behandelt werden.</li>
	<li>Ersetzen Sie die Lösung 10 Minuten lang durch 0,5%ige Zellmembran-Permeatierungslösung in DPBS, um die Zellmembran bei RT zu permeabilisieren.</li>
	<li>PBS wascht die Proben 3 Mal im Abstand von 5 bis 10 Minuten zwischen den Waschgängen (mit einer geladenen Spritze, wie in Schritt 5.1).</li>
	<li>Laden Sie 1%ige BSA-Lösung für 45-60 min bei RT in den Fluidikkanal (mit einer geladenen Spritze durch die Einlassöffnung).</li>
	<li>Geben Sie 1,5 ml Methanol mit Alexa Fluor 488 Phalloidin in die Durchstechflasche, um eine Endkonzentration von 6,6 μM Stammlösung zu erhalten.</li>
	<li>Nehmen Sie 5 μl Alexa Fluor 488 Phalloidin aus Schritt 5.5 und verdünnen Sie es in 200 μl DPBS mit 0,1 % BSA, um eine Endkonzentration von 0,165 μM Alexa Fluor 488 Phalloidin zu bilden.</li>
	<li>Geben Sie 200 μl der Mischungslösung mit einer Mikropipette in den Fluidikkanal und inkubieren Sie den Chip bei 37 °C für 45 - 60 min für die Aktinfärbung. PBS Waschen Sie die Proben 3 Mal (wie oben).</li>
	<li>Bereiten Sie 1 μg/ml DAPI in PBS vor, lassen Sie es durch den Chip fließen und färben Sie die Zellkerne 5 Minuten lang bei 37 °C.</li>
	<li>Pipettieren Sie DPBS in den Fluidikkanal, um die Färbelösung auszuwaschen, und füllen Sie die Fluidikkammer wieder mit PBS-Lösung, um Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop aufzunehmen.</li>
	<li>Nehmen Sie die Fluoreszenzbilder der 3T3-Zellen in den Hydrogelen mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop unter 40-facher Vergrößerung mit einem CCD-Detektor und Filtersätzen von ex/em bei 488/520 nm bzw. 358/461 nm für Alexa Fluor 488 Phalloidin (Aktin) bzw. DAPI (Zellkern) auf.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Beitrag berichten wir über einen einfachen Ansatz, Zelle Ausrichtung Verhalten nach Hydrogel Form Führung und Bruchdehnung zu vergleichen. Eine flexible Membran PDMS schafft eine kuppelförmige Wölbung zur Generierung von unterschiedlichen Höhen der konzentrische kreisförmige Hydrogele. Nach der Veröffentlichung des Drucks, gilt die PDMS-Membran automatisch Kraft für die Mikro-gemusterten Hydrogele gradient Belastung/Dehnung, mit einem Maximum in der Mitte und einem Minimum an der äußeren Grenze bilden. Da die B...

Dienen als ein Blockmaterial, das eine native Mikroumgebung imitiert, kann ein Hydrogel, die extrazellulären Matrix (ECM) enthalten biomimetische Gewebe Gerüste um Zellwachstum zu unterstützen wieder aufzubauen. Um die Funktionen eines Gewebes besitzen, ist organisierte Zellenausrichtung eine wesentliche Voraussetzung. Verschiedene 2D (d. h. Zellen kultiviert auf einer Oberfläche) und 3D (d. h. Zellen in einem Hydrogel gekapselt) Zelle Achsen durch Kultivierung oder Zellen in oder auf flexiblen Substraten mit Micro Kapseln erreicht wurden- oder Nano-Muster1. 3D Zellausrichtung in Mikroarchitektur ist attraktiver, da die Mikroumgebung näher an der Heimat Gewebe Konstrukt2,3,4. Ein gemeinsames Konzept für 3D Zellenausrichtung ist die geometrische Cue von Hydrogel Form2,3. Aufgrund der Platzverhältnisse für die Zellproliferation in Richtung der kurzen Achse sollen Zellen entlang der langen Achse Richtung in eine Mikro-gemusterten Hydrogel ausrichten. Ein weiterer Ansatz ist die Hydrogele zu Ausrichtung der Zellen parallel zur Strecke Richtung4,5Bruchdehnung zuweisen.
Biophysikalische Stimulation auf ECM Hydrogele, z. B. Druckspannung oder ein elektrisches Feld kann regulieren Zellfunktionen für richtige Gewebeintegration, Proliferation und Differenzierung1,2,3. Viel Forschung wurde durchgeführt, um zelluläre Verhalten zu untersuchen, durch die Anwendung einer Sorte Zustand zu einem Zeitpunkt über mehrere mechanische Steuerung Einheiten4,6,7,8,9. Zum Beispiel die Verwendung von mechanischen Schrittmotoren gequetscht oder gestreckt auf eine 3D Zelle verkapselt Kollagen Hydrogel wurde einen gemeinsamen Ansatz7,10. Jedoch solche Steuerungsvorrichtung erfordert zusätzlichen Platz und sieht sich das Problem der Kontamination in den Inkubator7,9,11,12. Darüber hinaus kann nicht das große Instrument eine präzise Steuerungsumgebung ermöglichen hohe Reproduzierbarkeit13geben.
Da die Zelle beladenen Hydrogele in der Regel auf der Mikro-Skala für biomedizinische Anwendungen beschäftigt sind, ist es vorteilhaft, MEMS Techniken um eine Reihe von Belastung/dehnen Stimulation zur Zelle Verhalten in 3D biomimetische Konstrukte in-vitro-2,14,15,16,17,18gleichzeitig untersuchen zu generieren zu kombinieren. Beispielsweise kann mit Gasdruck um zu verformen die PDMS-Membran in mikrofluidischen Chips zu verschiedenen Stämmen, fahren-Zell-Differenzierung auf verschiedenen Linien9,16führen. Allerdings gibt es viele technische Herausforderungen, wie kompliziert Chip Fertigungsprozesse in ein sauberes Zimmer und die Softwareintegration Steuerung von Motoren, Pumpen, Ventile und komprimierte Gase.
In dieser Arbeit zeigen wir Ihnen eine einfache Methode um eine autarke gradient statische Belastung mikrofluidischen Chip zu erhalten durch den Einsatz einer konzentrische kreisförmige Hydrogel-Muster und einer flexiblen Membran PDMS. Anders als die meisten der vorhandenen Ansätze ist unsere Plattform ein tragbar und Einweg-Miniatur-Gerät, vor einem gelben Zimmer hergestellt werden können und, besitzt selbst generierenden gradient Stämme auf konzentrischen Zelle verkapselt Hydrogele, ohne externe mechanische Ausrüstung während der Inkubation. 3 t 3 Fibroblast Zellen Verhalten beeinflusst durch eine Kombination von Hydrogel-Form und eine Vielzahl von Zug-Stretch Anleitung Hinweise wurden während der Beobachtung der Ausrichtung der Zellen innerhalb von ECM-mimetischen 3D-Umgebungen im Farbverlauf Stamm Chip für 3 Tage gezeigt.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL schwarzes Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Argos Technologies</td><td>03-391-161</td><td>Dieser kann durch ein neutrales 1,5-ml-Röhrchen ersetzt werden, das mit Aluminiumfolie bedeckt</td></tr> ist <tr><td>10x DPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56064C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A12379&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1595</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Molekulare Sonde</td><td>C1430</td><td>Zur Markierung lebensfähiger Zellen</td></tr><tr><td>CCD</td><td>PCO. Imaging</td><td>Pixelfly qe</td><td></td></tr><tr><td>Zellmembran-Permeationslösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>0,5 % Triton X-100 zur Permeation der Zellmembran</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>Zellkernfärbung</td></tr><tr><td>Dialysemembran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9527</td><td>Molekulargewichts-Cut-off = 14.000</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Doppelseitiges Klebeband</td><td>3M</td><td>8003</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td>Gel Stärke 300, Typ A, aus Schweinehaut</td></tr><tr><td>Elektronischer Hochfrequenz-Koronagenerator</td><td>Elektrotechnische Produkte</td><td>MODELL BD-20</td><td></td></tr><tr><td>Methacrylanhydrid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276685</td><td></td></tr><tr><td>Mikrospritze</td><td>Hamilton</td><td>80501</td><td>50 &mu; L&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Enthält zwei Filtersätze: LF405 / LP-B-000 und LF488 / LP-C-000 von Semrock</td></tr><tr><td>Oxygen Plasmamaschine</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Zum Fixieren der Zelle</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>DOW CORNING</td><td>Sylgard 184</td><td>Mischung für PDMS-Chip-Gussformherstellung</td></tr><tr><td>Stift-Strep</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>Penicillin/Streptomycin</td></tr><tr><td>Photoinitiator</td><td>CIBA</td><td>Irgacure 2959</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Zur Markierung toter Zellen</td></tr><tr><td>Steriler Filtrationsbecher</td><td>Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>TMSPMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td>Zur Hydrogel-Immobilisierung</td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>Delta</td><td>D150H</td><td>150W, 43kHz</td></tr><tr><td>UV-Licht</td><td>DAIHAN</td><td>WUV-L10</td><td></td></tr><tr><td>Gefriertrockner</td><td>FIRSTEK</td><td>150311025</td><td></td></tr><tr><td>NIH3T3 (Fibroblasten)</td><td>Forschungs- und Entwicklungsinstitut für die Lebensmittelindustrie (FIRDI)</td><td>08C0011</td><td></td></tr><tr><td>MOXI Z Mini Automatisierter Zellzähler</td><td>ORFLO</td><td>MXZ001</td><td></td></tr></tbody></table>

gradient stamm chip für anregende zellulären verhaltensweisen in zelle beladenen hydrogel

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Künstliche Anleitung für zelluläre Ausrichtung ist ein heißes Thema im Bereich des Tissue Engineering. Die meisten der bisherigen Forschung untersuchte einzelne Stamm-induzierte zellulären Ausrichtung auf eine Zelle beladenen Hydrogel mithilfe von komplexen Versuchsabläufe und Masse Controllingsystemen, die in der Regel verbunden mit Verunreinigung Probleme sind. Daher schlagen wir in diesem Artikel einen einfachen Ansatz zum Aufbau einer Gradienten statische Belastung mit einem fluidische Chip mit einer Kunststoffabdeckung PDMS und ein UV-transparentem Glas-Substrat für die Stimulation der zellulären Verhalten in einem 3D Hydrogel. Überlastung Foto-patternable Zelle Prepolymer in der fluidische Kammer erzeugen eine konvexe gekrümmte PDMS-Membran auf dem Cover. Nach UV-Vernetzung durch eine konzentrische kreisförmige Micropattern unter dem geschwungenen PDMS-Membran und Puffer waschen, eine Mikroumgebung für Ermittlungsbehörden Zelle Verhalten unter einer Vielzahl von gradient Stämme ist selbst in einem einzigen fluidische Chip, ohne externe Instrumente etabliert. NIH3T3 Zellen wurden demonstriert, nachdem er beobachtet die Veränderung der zellulären Ausrichtung Trend unter Leitung der Geometrie, in Zusammenarbeit mit Belastung Stimulation, die von 15-65 % auf Hydrogele variiert. Nach einer 3-tägigen Inkubation dominiert die Hydrogel-Geometrie die Zellausrichtung unter niedrigen Druckspannung, wo Zellen entlang Richtung Hydrogel Dehnung unter hoher Druckspannung ausgerichtet. Zwischen diesen zeigten die Zellen zufällige Ausrichtung durch die Dissipation der radikalen Leitlinien Hydrogel Dehnung und die Geometrie-Führung der gemusterten Hydrogel.

Um die mechanischen Unterschiede zwischen jeder Runde Hydrogel im abgeschlossenen gradient Belastung Stimulation Chip zu vergleichen, haben wir die Linienstärken jede Runde Hydrogel in zwei die gleichen Chips, Einspritzmengen von 0 µL (Abb. 4a) mit 40 µL (Abbildung 4 b), bzw. gemessen. Prozent Dehnungen in jedem Kreis waren die Dehnungen in der 40 µL injiziert Chip durch dividiert die Linienbreiten der entsprechenden Hydrogele in...

Dieser Artikel stellt eine einfache Methode zur Bereitstellung von nicht-kontinuierlichen gradienter statische Belastungen auf eine konzentrische Zelle beladenen Hydrogel, Ausrichtung der Zellen für das Tissue Engineering zu regulieren.

Gradient Stamm Chip für anregende zellulären Verhaltensweisen in Zelle beladenen Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Das übergeordnete Ziel dieses Gradientendehnungschips ist es, einen einfachen Ansatz zur Erzeugung von nicht-kontinuierlichen gradienten statischen Dehnungen auf einem 3D-Hydrogel für die Untersuchung des Zellverhaltens unter einer Reihe von Dehnungsbedingungen bereitzustellen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich des Bioengineerings zu beantworten, wie z.B. die Stimulation einer Stammzelldifferenzierung und die Regulation der zellulären Ausrichtung für die Entwicklung künstlicher Gewebeorgane. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass verschiedene Stämme auf die Zellschicht und Hydrogele in derselben Mikroumgebung aufgebracht werden können, um das Zellverhalten zu vergleichen.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Chipvorbereitung schwer zu erlernen sind, da das Licht für die Versuchsbasis in drei bis vier Stunden abgeschlossen sein sollte, um eine hohe Zellvariabilität zu gewährleisten. Wiegen Sie 10 Gramm Gelatinepulver und geben Sie es in einen Glaskolben mit 100 Millilitern Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder DPBS. Legen Sie einen magnetischen Rührstab in den Kolben und stellen Si

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Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir beschreiben ein Protokoll für die Mikrofabrikation der Gradienten-erzeugenden Mikrofluidik-Gerät, das räumliche und zeitliche Verläufe in klar definierten Mikroumgebung erzeugen können. Bei diesem Ansatz kann der Gradient-Erzeugung mikrofluidischen Gerät verwendet, um gerichtete Wanderung, Embryogenese, Wundheilung und Krebs Metastasen zu untersuchen.

Ein Gradient-Erzeugung Mikrofluidikvorrichtung für Zellbiologie

In diesem Protokoll, zeigen wir die Herstellung eines Mikroaktor Reihe von vertikal versetzt zum Thema, die die Technologie basiert, und wie diese Basistechnologie können modifiziert werden, um High-Throughput-mechanisch dynamischen Zellkultur in beiden zweidimensionalen und dreidimensionalen Kultur durchzuführen Paradigmen.

Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

Die Biosynthese von knorpeligen extrazellulären Matrix durch Chondrocyten können durch Einwirkung mechanischer Reize beeinflußt werden. Diese Methode beschreibt die Technik der Anwendung dynamisch Druckspannungen zu Chondrozyten in 3D-Konstrukte und die Auswertung der induzierten Veränderungen in Chondrozytenmetabolismus verkapselt.

Mechanische Stimulation der Chondrozyten-Agarose Hydrogele

Mikrofabrizierte Bauelemente, die mit fluidischen Komponenten integriert sind, bieten eine in vitro Plattform für Zellstudien, die die in vivo Mikroumgebung nachahmen. Wir haben Mikrofluidik-Chips auf Polymethylmethacrylat-Basis entwickelt, um zelluläre Reaktionen unter einzelnen oder koexistierenden chemischen/elektrischen/scheren Stressreizen zu untersuchen.

Entwerfen Mikrofluidiksysteme für ein Studium zellulären Reaktionen Unter Einzel- oder Coexisting Chemie / Elektro / Schubspannung Stimuli

Mechanische Kräfte sind wichtig für die Steuerung der Zellmigration. Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung von elastischen Hydrogelen, die mit einer Glasmikropipette und einem Mikromanipulator verformt werden können, um Zellen mit einem lokalen Steifigkeitsgradienten zu stimulieren, um Veränderungen in der Zellstruktur und Migration hervorzurufen.

Einzelzelle Durotaxis Assay zur Beurteilung der mechanischen Steuerung der zellulären Bewegung und verwandter Signalereignisse

Die vorgestellte Methode beinhaltet das einachsige Dehnen von 3D-Weichhydrogelen, die in Silikonkautschuk eingebettet sind, während eine konfokale Live-Mikroskopie ermöglicht wird. Die Charakterisierung der externen und internen Hydrogelstämme sowie die Faserausrichtung werden demonstriert. Das entwickelte Gerät und Protokoll kann die Reaktion von Zellen auf verschiedene Belastungsregime beurteilen.

Kontrollierte Dehnung von 3D-Hydrogelen unter Live-Mikroskopie-Bildgebung

Hier bieten wir einen mikrofluidischen Chip und ein automatisch gesteuertes, hocheffizientes Kreislauf-Mikrofluidsystem, das die anfängliche Mikroumgebung der Neovaskularisation rekapituliert und es ermöglicht, Endothelzellen (ECs) durch hohe Luminalscherspannung, physiologischen Transendothelfluss und verschiedene vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) gleichzeitig zu stimulieren.

Mikrofluidisches Modell zur Nachahmung des ersten Ereignisses der Neovaskularisation

Wir beschreiben Verbesserungen an einer Standardmethode zur Messung zellulärer Zugkräfte, die auf dem Mikrokontaktdruck mit einem einzigen subtraktiven Musterungsschritt von Punktarrays extrazellulärer Matrixproteine auf weichen Hydrogelen basiert. Diese Methode ermöglicht eine einfachere und konsistentere Herstellung von Inselmustern, die für die Steuerung der Zellgruppenform unerlässlich sind.

Mustergenerierung für die Mikromuster-Traktionsmikroskopie

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine experimentelle Plattform zur Bewertung der Auswirkungen mechanischer und biochemischer Hinweise auf chemotherapeutische Reaktionen von patientenabgeleiteten Glioblastomzellen in 3D-matrixmimetischen Kulturen unter Verwendung eines maßgeschneiderten UV-Beleuchtungsgeräts, das die Hochdurchsatz-Photovernetzung von Hydrogelen mit abstimmbaren mechanischen Eigenschaften ermöglicht.

Hydrogel-Arrays ermöglichen erhöhten Durchsatz für Screening-Effekte von Matrixkomponenten und Therapeutika in 3D-Tumormodellen

Wir beschreiben die Isolierung von neonatalen Kardiomyozyten und die Vorbereitung der Zellen für die Verkapselung in Fibrin-Hydrogel-Konstrukte für das Tissue Engineering. Wir beschreiben Methoden zur Analyse der Gewebezüchtung Myokard nach der Kultur Zeitraum einschließlich der aktiven Kraft auf elektrische Stimulation und die Lebensfähigkeit der Zellen und immunhistologische Färbung erzeugt.

Verkapselung von Kardiomyozyten in einer Fibrin-Hydrogel für Cardiac Tissue Engineering

Erfahren Sie, wie ein Gradient-Stamm-Chip nicht-kontinuierliche statische Dehnungen auf zellbeladenem Hydrogel erzeugt, um Zellverhalten und Ausrichtung im Tissue Engineering zu untersuchen.

Gradient Stamm Chip für anregende zellulären Verhaltensweisen in Zelle beladenen Hydrogel

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