Einkapseln Cytochrome

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Cytochrom c in Silical-Sol-Gelen einzuschließen. Diese Gele anschließend superkritisch zu bearbeiten, um Bioaerogele zu bilden, und diese Bioaerogele nutzen, um Stickstoffmonoxid über eine Reaktion in der Gasphase schnell nachzuweisen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Biosensorik und bioanalytische Forschung zu beantworten, beispielsweise welche Bedingungen notwendig sind, damit Cytochrom c aktiv bleibt, wenn es in einem hochporösen Aerogel eingeschlossen ist.

Die Bedeutung dieser Technik liegt darin, dass sie ein einfaches Verfahren zur Einschließung eines Proteins in eine Matrix darstellt, in der Proteine bisher selten erfolgreich eingeschlossen wurden. Obwohl diese Methode Erkenntnisse über Cytochrom c liefern kann, könnte sie auch zu Verfahrensentwicklungen für die Einschließung anderer Proteine in Aerogelen führen, was für zukünftige bioanalytische Geräte von Bedeutung sein könnte. Stellen Sie eine Lösung mit einer Cytochrom-c-Konzentration im Bereich von 0,7 bis millimolar her.

Sowie eine verdünnte 0,105 Millimolar-Lösung von Cytochrom c, wie im Textprotokoll beschrieben. Beschriften Sie dann einen Einweg-50-Milliliter-Polypropylen-Becher als Becher A. Stellen Sie den Becher auf die Waagschale einer Analysenwaage und geben Sie mithilfe einer Glas-Pasteur-Pipette 1,88 Gramm Tetramethoxysilan in den Becher. Taren Sie die Waage.

Und dann pipettieren Sie 2,88 Gramm Methanol in Becherglas A. Decken Sie Becherglas A mit Parafilm ab. Fügen Sie anschließend einen magnetischen Rührstab in ein Einweg-Polypropylen-Becherglas mit 50 Milliliter Fassungsvermögen, das als Becherglas B beschriftet ist, und stellen Sie es auf die Waagschale einer Analysenwaage. Geben Sie mithilfe einer Glaspipette 0,75 Gramm Wasser und 3,00 Gramm Methanol hinzu, bevor Sie Becherglas B mit Parafilm abdecken.

Beginnen Sie damit, den Inhalt des Bechers B auf einer Rührplatte in einem Abzug unter Rühren zu mischen. Anschließend geben Sie mithilfe einer Spritze 5 µL einer 28,0 bis 30,0 %igen Ammoniumhydroxid-Lösung durch die Parafilm-Abdeckung in die Mischung, während weiterhin gerührt wird. Unmittelbar nach Abschluss dieses Schritts geben Sie den Inhalt des Bechers A in den Becher B. Rühren Sie die Mischung 20 Minuten lang, wobei sie mit Parafilm abgedeckt bleibt.

Während die Silica-Sol-Mischung gerührt wird, beschaffen Sie acht bis neun Polypropylen-Scintillationsgefäße und die dazugehörigen Verschlüsse. Legen Sie eine Plastikfolie über das Verschlussende des Gefäßes, um eine ebene Oberfläche zu schaffen, auf der das Gel gebildet werden kann. Setzen Sie anschließend den Verschluss darauf auf.

Darauf achten, dass die Plastikfolie im Inneren der Kappe intakt bleibt. Stellen Sie die Gefäße mit der Kappe nach unten auf die Arbeitsfläche, sodass die offenen Enden nach oben zeigen. Schneiden Sie dann Parafilm-Stücke zurecht, mit denen jedes Gefäß abgedeckt wird.

Nach Abschluss des Lösungsmittelvermischens 3 Milliliter der Sol-Mischung in einen sauberen, wegwerfbaren 50-Milliliter-Polypropylen-Becher geben. Mit einer Glas-Pasteur-Pipette langsam über einen Zeitraum von etwa einer Minute 500 Mikroliter der 0,105 Millimolar verdünnten Cytochrom-c-Lösung die Wand des Bechers entlang in die 3-Milliliter-Sol-Mischung tropfen lassen. Während des Hinzufügens des Cytochroms die Mischung vorsichtig wirbeln, um die Bildung großer roter Klumpen zu vermeiden.

Pipettieren Sie 0,5 Milliliter des resultierenden Cytochrom-c-Silica-Sols in jede vorbereitete Form. Pipettieren Sie außerdem 0,5 Milliliter des verbleibenden reinen Silica-Sols in ein oder zwei Formen, um diese als Kontrollproben während des überkritischen Trocknungsprozesses zu verwenden. Bedecken Sie die nach oben offenen Öffnungen der Formen mit Parafilm und stellen Sie sie über Nacht oder mindestens 12 Stunden in den Kühlschrank, um Sol-Gele zu erzeugen.

Nehmen Sie die Formen aus dem Kühlschrank. Entfernen Sie die Parafilm-Abdeckung von der Oberseite einer Form mit einem Cytochrom-c-Sol-Gel und nehmen Sie außerdem die Kappe und die Plastikfolie von der Unterseite ab. Geben Sie etwas Ethanol aus einer Waschflasche in die Form und verwenden Sie dann das runde Scheibenende eines Spritzenstempels, um das Gel vorsichtig aus der Form in ein sauberes 20-Milliliter-Glaskernzählergefäß zu drücken, das etwa 5 Milliliter Ethanol enthält.

Wiederholen Sie diesen Gel-Entfernungsprozess, bis alle Cytochrom-c-Gele dem Vial hinzugefügt wurden und alle Kieselgel-Proben einem separaten Vial hinzugefügt wurden. Danach füllen Sie die Vials bis zum Rand mit Ethanol auf. Verschließen und lagern Sie sie bei 2 bis 8 Grad Celsius.

Entfernen Sie die Gele im Abstand von jeweils vier Stunden über den gesamten Tag aus dem Kühlschrank. Dekantieren Sie das Ethanol von den Gele und ersetzen Sie es durch frisches Ethanol. Während weiterer drei Tage tauchen Sie die nassen Sol-Gele in Aceton ein und dekantieren dreimal täglich, wobei Sie jeweils frisches Aceton hinzufügen.

Kühlen Sie eine Kritische-Punkt-Trocknungsapparatur auf 10 Grad Celsius, indem Sie die Temperatur eines angeschlossenen Thermostaten auf acht Grad Celsius einstellen. Sobald die Apparatur 10 Grad Celsius erreicht hat, führen Sie einen Dichtheitstest an der Apparatur gemäß dem schriftlichen Protokoll durch. Nachdem sichergestellt wurde, dass die Apparatur dicht ist, gießen Sie die nassen Gele vorsichtig aus den Szintillationsgefäßen zusammen mit dem größten Teil des Acetons in die drei langen Abschnitte des Transferboots.

Falls erforderlich, weiteres Aceton hinzufügen, um sicherzustellen, dass alle Gele vollständig in Aceton eingetaucht sind, bevor das Gefäß im Apparat verschlossen wird. Das Füllventil des Apparats öffnen, um Kohlendioxid zuzuführen. Sobald man beobachtet, wie das Kohlendioxid durch das Sichtfenster des Apparats am Boden des Apparats ansetzt, das Ablassventil öffnen, um das Aceton fünf Minuten lang abzulassen.

Dieses Durchsickern des Acetons nach unten tritt auf, bevor die Apparatur vollständig mit Kohlendioxid gefüllt ist. Halten Sie daher das Füllventil während des Ablassens geöffnet, damit die Apparatur weiterhin gefüllt wird. Schließen Sie anschließend das Ablaufventil.

Halten Sie das Füllventil leicht geöffnet. Zu Beginn enthält die abfließende Mischung Wasser, da das Aceton nicht wasserfrei ist. Es kann zu Vereisung, Verstopfung und Druckaufbau im Abflussrohr kommen.

Wenn ein Verstopfung erkannt wird, schließen Sie das Ablaufventil, bis die Verstopfung geschmolzen ist. Fünf Minuten später öffnen Sie das Ablaufventil für weitere fünf Minuten und stellen das Füllventil so weit offen, dass die Apparatur während der gesamten Entleerungszeit gefüllt bleibt. Nach fünf Minuten schließen Sie das Ablaufventil und lassen das Füllventil leicht geöffnet.

Danach diesen Entleerungsschritt noch einmal fünf Minuten später wiederholen. Sobald die Entleerungsschritte abgeschlossen sind, schließen Sie das Füllventil und leiten Sie das flüssige Kohlendioxid ab, sodass der Füllstand durch das Sichtfenster des Geräts gerade über den Zinken des Bootes sichtbar bleibt. Stellen Sie anschließend die Temperatur des am Gerät angeschlossenen Thermostaten auf 40 Grad Celsius ein, um sicherzustellen, dass das flüssige Kohlendioxid über seine kritische Temperatur und den kritischen Druck ansteigt.

Beobachten Sie nach etwa 15 Minuten durch das Sichtfenster des Geräts den Übergang von der Flüssigkeit zum überkritischen Fluid, während der Flüssigkeitsmeniskus oberhalb der Zinken des Bootes verschwindet. Nach mindestens 15 Minuten Anlaufzeit öffnen Sie das Entlüftungsventil leicht, um die Freisetzung des überkritischen Fluids einzuleiten. Öffnen Sie im Verlauf von ungefähr 45 Minuten das Entlüftungsventil schrittweise weiter und weiter, sodass ein gleichmäßiges, jedoch sehr leises Zischen des austretenden Fluids zu hören ist und am Druckmessgerät ein langsames Absinken des Drucks auf null beobachtet werden kann.

Nachdem der Druck der Apparatur auf null abgefallen ist, öffnen Sie die Tür der Apparatur. Entfernen Sie das Boot und verwenden Sie eine Pinzette, um die neu getrockneten Aerogele in saubere Glas-Scintillationsgefäße zu legen.

Die Cytochrom-c-Kieselgelaerogele sind nun bereit, um nach der in der Textanleitung beschriebenen Charakterisierung auf das Vorhandensein von Stickoxid-Gas zu prüfen. Dargestellt sind Aerogele mit eingeschlossenem 15 µM Cytochrom c in 4,4 mM, 40 mM und 70 mM Kaliumphosphatpuffer im Vergleich zu einer Münze. Gezeigt ist hier ein repräsentatives Spektrum von Cytochrom c im Puffer im Vergleich zu Cytochrom c, das in Aerogele unter verschiedenen Bedingungen eingebettet ist.

Das Soret-Band von Cytochrom c bei 409 Nanometern bleibt innerhalb der Aerogele im Wesentlichen unverschoben und zeigt eine charakteristische Rotverschiebung, wenn die Bioaerogele Gasphase-Stickstoffmonoxid ausgesetzt werden. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Silica-Sol-Gele synthetisiert, Cytochrom c in diese Sol-Gele einkapselt und diese kompositen Sol-Gele zu Aerogelen trocknet. Weitere Informationen finden Sie im Textprotokoll zur Charakterisierung der Bioaerogele und zur Verwendung der Bioaerogele zum Nachweis von gasförmigem Stickstoffmonoxid.