Name: Mikrofluidik-Strömungskammern Mit Rekonstituierte Blut Hämostaseologie und Transfusions Platelet zu Modell In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Erfahren Sie, wie Mikrofluidik-Strömungskammern mit rekonstituiertem Blut die Hämostase und Thrombozytenfunktion in vitro modellieren. Diese Methode ermöglicht die Bewertung gelagerter Thrombozytenkonzentrate unter hydrodynamischem Fluss.

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Die Autoren haben keine Danksagungen.

Dieses Protokoll folgt die institutionellen ethischen Richtlinien für die Forschung an menschlichen Proben und informierte Zustimmung wurde von allen Spendern beteiligt erhalten. Zulassung für den hier beschriebenen Experimenten wurde von der Institutional Review Board der Universitätsklinik Antwerpen erhalten. Hinweis: Temperaturangaben sind immer Raumtemperatur, sofern nicht anders angegeben. 1. Vorbereitung Flusskammer-Setup <ol><li> Vorbereiten Lanes, Schläuche und Pins <ol><li> Vortex die Kollagensuspension kräftig und verdünnt 1/20 in der isotonischen Glucoselösung vom Anbieter zu einer Endkonzentration von 50 &amp; mgr; g / ml geliefert. Hinweis: Wir verwenden Kollagen Pferde-Sehne, hauptsächlich bestehend aus Typ-I-Fibrillen. Die Pferde-Kollagen Typ I wird oft bezeichnet als &quot;Horm&quot; Kollagen und ist der goldene Standard für diese Art von Test 9 für sowohl historische als auch biologische Gründe. Menschliche Kollagen Typ III kann auch verwendet werden, aber the Fibrillen weniger gut beschichten und die Blutplättchenantwort ist nicht so stark. Andere Beschichtungsflächen , können ebenfalls verwendet werden, beispielsweise von Willebrand - Faktor (vWF), Fibrinogen, Fibronectin, Laminin, Vitronektin, Thrombospondin-1 oder Kombinationen dieser 16. </li><li> Nehmen Sie eine neue Einweg-Biochips aus dem Behälter des Anbieters. Die Abmessungen der Biochips hier verwendeten 0.4W x 0,1H x 20L in mm 3. </li><li> Pipettieren 0,8 ul in die Spur (en) des mikrofluidischen Biochip an einem Ende des Chips und Marke als Auslass. Stellen Sie sicher, dass die Spur gefüllt ist 5 / 6. mit der kollagenhaltigen Beschichtungslösung in 1.1.1 bereit. Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen. Anmerkung: Die Kanäle sind teilweise zu vermeiden Anhäufung von Kollagenfasern am Eingang des Kanals (siehe Diskussion) beschichtet. </li><li> Inkubieren bei 4 ° C für 4 Stunden oder über Nacht in einer befeuchteten und geschlossenen Behälter. </li><li> Blockieren die beschichteten Kanäle durch Pipettieren Blockierungspuffer (1,0% (w / v) Rinderserumalbumin eind 0,1% (w / v) Glucose in 10 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) gepufferten Salzlösung (HBS; 0,9% (w / v) NaCl, pH 7,4) am anderen Ende und Mark als Einlass. Stellen Sie sicher, dass die Spur vollständig mit dem Blockierungspuffer unter Vermeidung von Luftblasen gefüllt ist. </li><li> Schneiden Sie Schlauch bei gleicher Länge (12 cm). Verwenden Sie eine pro Spur und verbinden jeden Schlauch mit einem Stift. Zum Beispiel kann ein Experiment zwei Bedingungen, führen in doppelter Vergleich wird vier Rohrstrecken und vier Stifte erfordern vorbereitet werden. </li><li> Spülen Sie den Schlauch mit destilliertem Wasser unter Verwendung einer Spritze und einer 26 G-Nadel oder die zugehörigen Anschlüsse. </li><li> Tränken Sie den Schlauch mit Blocking-Puffer. Speicher in einer geschlossenen und befeuchteten Behälter für mindestens 1 Stunde. </li></ol></li><li> Vorbereiten Pumpe und Verteiler <ol><li> Spülen Sie die Pumpe und Verteiler mit destilliertem Wasser, Luftblasen zu entfernen. </li><li> Saugen Sie das Blockierungspuffer aus der Biochip-Spur (n) am Ausgang des Fest 10 ul Spitze verwenden. Reinigen Sie die Oberfläche vonfrei wischen und denaturierten Alkohol Drucke und Staub entfernen der Biochip mit einer Genauigkeit Staub. </li><li> Befestigen Sie den Biochip auf einem automatisierten Mikroskoptisch. Wenn mehr als eine Spur gleichzeitig in einem Durchlauf verwendet wird, schließen Sie den Achtweg Verteiler Splitter zum Biochip Steckdose. Hinweis: Die achtspurige Verteiler Splitter ein Stück Hardware (Abbildung S1) ist mit der Pumpe und dem Biochip verbunden. Es ermöglicht den Betrieb aller verfügbaren (acht) Spuren auf einem Biochip oder eine Kombination von Spuren, die vom Bediener definiert in der zugehörigen Software sein kann. </li><li> Verwenden Sie die Stifte in den Schlauch sie in dem Biochip Einlass zu beheben. Legen Sie das andere Ende des Schlauchs (ohne Stift) in einem 1,5 ml konischen Röhrchen mit HBS gefüllt. Spülen Sie alle Schläuche und ihre angeschlossenen Bahnen mit 1 ml HBS mit der Pumpe, um Rest-Blockpuffer zu entfernen und schlecht Kollagen haften. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von Blutproben <ol><li> Sammlung und Trennung vonfrisches Vollblut aus einem gesunden Freiwilligen. 17 <ol><li> Sammeln Sie die ersten Milliliter Blut in einem evakuierten Rohr (EDTA) als Antikoagulans enthält, und verwenden Sie ausschließlich diese Probe für die komplette Blutbild (CBC) mit einem automatisierten Hämatologie-Analysegerät. </li><li> Sammeln Sie ein Volumen von Blut in einem geeigneten Antikoagulans Vakuumröhren. Standard Antikoagulantien zur Strömungskammer Experimente sind Heparin oder Hirudin, wenn die Bildung Fibrin nicht Bestandteil des Studienprotokolls und Natriumcitrat, wenn es ist. Hinweis: Heparin wurde als Antikoagulans für alle Experimente verwendet in den Ergebnissen beschrieben. Anmerkung: Die Menge an Blut auf die Anzahl der Experimente abhängig durchgeführt werden. Etwa 1 Rohr (7 ml) für 3 Spuren. </li><li> Die Röhrchen auf einem Rotator anhängige Blut Rekonstitution. Hinweis: Der Test sollte innerhalb von 3 Stunden von Aderlass abgeschlossen sein. </li><li> Zentrifuge für 15 Minuten bei 250 g plättchenreiches Plasma herzustellen (PRP). Verwenden Sie die Zentrifuge nicht brechen Störung des lose gepackten Pellets zu verhindern. <ol><li> Wenn mehr als ein Röhrchen gesammelt wurde, bündeln das Blut in einem einzigen konischen Zentrifugationsröhrchen. Hinweis: Zentrifugierung langsamer oder weniger lange durchgeführt werden kann, abhängig von der PRP-Ausbeute und Differentialzelle &quot;Kontamination&quot; bevorzugt. </li></ol></li><li> Entfernen und entsorgen Sie die PRP und Leukozytenmanschette gepackten roten Blutkörperchen mit wenigen Thrombozyten führt. Hinweis: Die Thrombozytenzahl in der gepackten roten Blutkörperchen Fraktion 13 ± 5 x 10 3 pro ul (Mittelwert ± SD, n = 12) im Durchschnitt in unseren Händen. </li></ol></li><li> Blut Rekonstitution <ol><li> Thaw Blutgruppe AB (Rhesus-D-negativ) Plasma bei 37 ° C für 5 Minuten und 20 Sekunden pro 4 ml. </li><li> Bestimmen Sie den Hämatokritwert der gepackten roten Blutkörperchen hergestellt in 2.1.5 eine automatisierte Hämatologie-Analysegerät verwendet wird. </li><li> Bestimmen Sie die Blutplättchenkonzentration in der Blutbank vorbereitet Blutplättchenkonzentrat that wird verwendet, um den roten Zellfraktion oben zu rekonstituieren. </li><li> Berechnen Sie das Volumen der gepackten roten Blutkörperchen und Thrombozyten-Konzentrat, das 40% Hämatokrit und 250 x 10³ Blutplättchen / ul in einer 1-ml-Probe ergibt. Anmerkung: Weitere Ziel Titer von Zellen kann beliebig eingestellt werden, abhängig von der Studienprotokoll. </li><li> Transfer der roten Blutzellen und Plasma in ein frisches Röhrchen verpackt ein abgeschnittenes Pipettenspitze verwendet und Plättchenkonzentrat hinzufügen, bis ein Probenvolumen von 1 ml erreicht ist. Hinweis: In Abhängigkeit von den untersuchten Variablen sollte die Plasmafraktion in allen rekonstituierten Proben gleich sein, weil Plasma einen signifikanten Einfluß auf die Thrombusbildung Rate hat. Zum Beispiel, wiederholte Einfrieren und Auftauen oder Plasma von verschiedenen Spendern oder auf verschiedenen Antikoagulantien genommen kann das Ergebnis beeinflussen. </li><li> Mischen Sie das aufgelöste Blut sanft durch Umdrehen und führen Sie einen CBC. </li><li> Bereiten Sie eine &quot;leere&quot; Kontrollprobe, in der das Volumen der Thrombozytenfraktion ersetzt wirddurch das gleiche Volumen von 0,9% (m / v) Natriumchlorid in Wasser , um die Konzentration von endogenen Thrombozyten (dh nicht-Blutbank - Blutplättchen) in dem rekonstituierten Blut unter Verwendung eines CBC zu bestimmen. </li></ol></li><li> Beschriftung <ol><li> Pipette 1 ml rekonstituiert Blut in einem Teströhrchen, enthaltend 1 &amp; mgr; l 5 mM Calcein AM (5 &amp; mgr; M Endkonzentration). Hinweis: Andere Zellfarbstoffe 14 verwendet werden kann. </li><li> Vorsichtig mischen durch Umdrehen. </li><li> Inkubieren Sie für 5 min bei 37 ° C vor der Verwendung. </li></ol></li></ol> 3. Perfusions-Assay <ol><li> Konzentrieren Sie das Ziel auf den Kollagenfasern an der Unterseite der Bahnen verklebt. Idealerweise verwenden Phasenkontrast oder Differentialinterferenzkontrast (DIC) Einstellungen für diese Fokussierungsstrategie. Wählen Sie &#39;Set aktuellen Z für ausgewählte Fliese Regionen &quot;in der Experiment-Software digital die ausgewählten Z-Positionen fixieren. </li><li> Wählen Sie eine Region of Interest (ROI) in der Spur (xy) in der Experiment-Software des microscope, die während des Versuchs aufgezeichnet. Hinweis: Der ROI jeder Oberfläche beliebig innerhalb eines Perfusions-Spur gewählt werden kann. Es ist ratsam, nicht Thrombusbildung nahe dem Ein- und Ausgang einer Spur zu analysieren, um Nebenwirkungen des variablen Strömungsprofil in diesem Bereich zu vermeiden, auch wenn diese relativ klein ist. Die ROI-Oberfläche sollte eine beträchtliche Anzahl von Blutplättchen enthalten oder Nivellierung des Signals zu ermöglichen Thromben. In diesem Protokoll ist die ROI ein digital vernäht Aggregat von drei gleich große Seite-an-Seite - Bilder , was zu 0,62 mm 2 in der Mitte der 2 cm lange Spur. </li><li> Mischen Sie die Proben vorsichtig durch Umdrehen und positionieren diese neben dem Biochip auf der automatisierten Bühne. </li><li> Platzieren Sie den Schlauch, der mit dem Einlass des Biochips in den Teströhrchen mit den rekonstituierten Blutproben verbunden ist. </li><li> Starten Sie die Pumpe bei 50 dyn / cm 2 (oder eine andere Scherspannungen wie gewünscht) für diese Kanäle verbunden Röhren zu testenenthaltend die rekonstituierte Blutproben die Software der Pumpe. Hinweis: Andere Scherspannungen verwendet werden können. </li><li> Nehmen Sie Bilder alle 15 Sekunden für 5 Minuten in Echtzeit den Erwerb und Experiment-Software des Mikroskop. Hinweis: Andere Zeitreihen verwendet werden können, auf dem Versuchsaufbau abhängig. Anmerkung: Wir verwenden im allgemeinen eine 100-facher Vergrößerung (10X-Objektiv und 10X-Linsen), aber höher (oder niedriger) Vergrößerung einfach als Alternative verwendet werden kann. </li></ol> 4. Waschen Out <ol><li> Auswaschen alle Schläuche mit dem Auslass angebracht ist und mit dem Mehrkanal-Verteilerpumpe oder mit destilliertem Wasser, gefolgt von Natriumhypochlorit (Bleichmittel) 0,5% (v / v) und schließlich 0,1 M NaOH in Wasser. Entsorgen Sie den Schlauch an den Biochip Einlass als gefährlicher Abfall zu merken. </li></ol> 5. Datenanalyse <ol><li> Bestimmen Sie Thrombus Wachstumskinetik mit der Bildanalyse-Software. Die folgenden Befehle sind spezifisch für ZEN2012. <ol&gt; <li> Öffnen Sie das Plugin Bildanalyse der Oberflächenabdeckung der Blutplättchen zu bestimmen. </li><li> Stellen Sie die Fluoreszenzschwelle in der Interactive Registerkarte Analysieren Sie die Pixelintensität zu definieren , die mit einem positiven Signal korreliert, dh einem anhaftenden Blutplättchen oder anhaftenden Blutplättchen. </li><li> Verwenden Sie Tabellen erstellen , um automatisch eine Tabelle erstellen , die die einzelnen Oberflächenbereiche (in &amp; mgr; m 2) dieser &quot;Objekte&quot; Pixel enthält , mit einem Signal zwischen den ausgewählten Schwellenwerten enthalten. Dies wird für jeden Zeitpunkt durchgeführt. Hinweis: Sobald Fluoreszenz Schwellen gewählt haben, automatisch die Analysesoftware &quot;Objekte&quot; im Sichtfeld, die die Kriterien erfüllen, erkennt. Diese Objekte sind Thromben, kleine Blutplättchenaggregaten oder einzelne Plättchen und umfassen eine Anzahl von Pixeln. Jedes Objekt wird in der Tabelle gesondert aufgeführt. </li><li> Speichern Sie diese Tabellen im XML-Format und öffnen Sie sie in einem Tabellenkalkulationsprogrammfür weitere Berechnungen. </li><li> Insgesamt die Oberflächenbereiche der ausgewählten Objekte durch Summierung und teilt das Ergebnis durch die Gesamtfläche des Meßfeldes (&amp; mgr; m 2). Dadurch wird die relative Flächendeckung (%) ergeben. Tun Sie dies für jeden Zeitpunkt. </li><li> Plotten diese Flächenbedeckungen in Funktion der Perfusionszeit und berechnen die Steigung durch lineare Regression, den Thrombus Wachstums kinetischer dieser bestimmten Bedingung erhalten wird. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Mikrofluidik - Strömungskammer Experimente sind ein hervorragendes Instrument Thrombozytenfunktion im fließenden Blut zu untersuchen und verwendet werden , die Hämostase in vitro in verschiedenen experimentellen Kontexten zu bewerten. Trotz schlechter Ring Standardisierung 9 zeigen wir , dass in unserem Labor die experimentelle Variation akzeptabel ist. Dies ermöglicht es, zuverlässig zu vergleichen (gepaart) Proben innerhalb einer gegebenen Studie. Dies wurde mit der gut dokumentierten Phänomen der ...

Hämostase erfordert die kombinierte Aktivität und regulierte von Zellen, Proteinen, Ionen und Gewebe in einem eingeschränkten Raum - Zeit - Rahmen 1. Unkontrollierte Aktivität kann in einem Spektrum von Erkrankungen zu Blutungen oder Thrombosen und Morbidität oder Mortalität führen zu Blutgerinnung im Zusammenhang. Ein mikrofluidischen Strömungskammer Experiment ist eine anspruchsvolle Technik , die Hämostase in vitro nachahmt. Dieser Ansatz ermöglicht Untersuchung des komplexen Zusammenspiel von Prozessen, die Teil der Hämostase mit einer führenden Rolle für Blutplättchen nehmen. Gefäßverletzung folgenden haften Blutplättchen an den exponierten subendothelialen Matrix (Glyko) Proteine ​​Blutverlust zu verhindern. Folgende Adhäsion, Blutplättchen zu aktivieren und zu aggregieren in Reaktion auf auto- und parakrine Signalisierung , die schließlich zur Bildung eines Plättchens Netzwerk führt, durch Fibrin stabilisiert , und was zu einer festen, gewickelten Thrombus 2 abdichtet. Im Gegensatz zu den meisten anderen Thrombozytenfunktionstests, Erfahgen mit Strömungskammern , um die physikalischen Parameter des Blutflusses und damit den Einfluss der Rheologie auf den beteiligten Zellen und Biomolekülen Berücksichtigung 3,4. Strömungskammer Experimente durch Variation Schlüsselparameter Grenzstein Einblicke in Hämostase und Thrombose erzeugt, die hämostatische (sub) beeinflussen Prozesse, einschließlich der Klebstoffmatrix, Rheologie und Strömungsprofile, zellulären Zusammensetzung, die Anwesenheit von Toxinen oder Medikamente, die Ionenstärke und viele mehr. In den vergangenen zwei Jahrzehnten geringen Durchsatz Flusskammer Experimente erfordern große Probenvolumina (10-100 ml) wurden zu mikrofluidischen Kammern oft entwickelt , bestehend aus kleinen Parallelplattenkammern und moderne Technologie auch für die Perfusion von Vollblut bei kontrollierter Wandscherbedingungen 5. Microscaling hat sich deutlich Assay Durchsatz meist erhöht, weil die Hardware-Setup vereinfacht und weniger (Blut) Volumen benötigt wird, wodurch das Experiment zugänglicher und Versatile. Zum Beispiel Blut von kleinen Labortieren kann nun ohne die Notwendigkeit verwendet werden, um Tiere zu opfern. Blutproben von gentechnisch veränderten Mäusen haben damit in der Identifizierung von Schlüsselmoleküle Förderung oder Hemmung Hämostase und in neue basische Erkenntnisse 6 unterstützt. Spezialisierte Forschungslaboratorien noch oft nach Maß Strömungskammern zum Beispiel aus Polydimethylsiloxan (PDMS) 7 verwenden , die auf lithogr Formen polymerisieren , die durch Software blueprinted werden kann. Die resultierende Kammer ist billig, Einweg und kann leicht für die Post-hoc-Analyse zerlegt werden. Darüber hinaus grundsätzlich jede Konstruktion von Schiffen, einschließlich Abzweigungen oder scharfe Kurven kann auf Befehl gebaut werden. Dieser Vorteil ist auch seine Nachteile, da die Standardisierung war bereits das primäre Problem mit Strömungskammer Experimente und PDMS Maß Kammern haben dies nicht unterstützt. Am Anfang dieser speziellen Frage, Beschichtung (Bedingungen), Fluoreszenzsonden, Antikoagulans, Temperatur und Zeit zwischen Probenahme und Analyse sind alle schlecht 8 standardisiert. Die Standardisierung dieser Variablen ist eine Herausforderung, aber dennoch den Vergleich der Ergebnisse zwischen den Laboratorien erforderlich zu ermöglichen. Dieses Thema ist das Hauptthema der Internationalen Gesellschaft für Thrombose und Hämostase in Wissenschaft und Standardisierung Unterausschuss für Biorheology 9,10. Thrombozytenkonzentrate (PC) sind bei Patienten mit verschiedenen Erkrankungen, die transfused Thrombozytopenie und / oder Blutungen verursachen. Aber Blutplättchen in PC sind bekannt zu desensibilisieren, insbesondere in Funktion der Lagerzeit 11 verbunden eine Verschlechterung Verfahren alterungs- und allgemein als Plättchenspeicher Läsion. Es wird manchmal behauptet , dass solche Thrombozyten bei Zirkulation wiederherzustellen einmal 12 transfused, aber Beweise dafür ist knapp. Ferner ist ein PC die Funktionalität von Plättchen bilden nicht routinemäßig getestet, weil die Beziehung zwischen solchen Assays undtherapeutische oder prophylaktische Wirksamkeit ist unklar , 13. Mikrofluidik-Strömungskammern bieten ein Mittel der Thrombozytenfunktion in PC zu untersuchen, um die Kette von Manipulationen zwischen Sammlung und die Ausstellung zu optimieren. Es ist ein leistungsfähiges Forschungswerkzeug für die direkte (gepaart) Vergleiche von PC , wie wir zuvor 14,15 veröffentlicht und wird hier beschrieben.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer-Röhrchen mit EDTA&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368856</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer-Röhrchen mit Heparin</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368480</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer-Röhrchen mit Natriumcitrat</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>366575</td><td></td></tr><tr><td>Hirudin Blutröhrchen</td><td>Roche</td><td>6675751 001</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Eclipse</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368650</td><td>Blutentnahmenadel mit vormontierter Halterung</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen 100-1.000</td><td>Greiner bio-one</td><td>740290</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen 2-200</td><td>Greiner bio-one</td><td>739280</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen 1-10</td><td>Eppendorf</td><td>A08928</td><td></td></tr><tr><td>Röhrchen 5</td><td>ml Simport</td><td>11691380</td><td></td></tr><tr><td>Konisches Röhrchen 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>1888271</td><td></td></tr><tr><td>Konisches Röhrchen 50 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Spritze</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Präzisionstücher</td><td>Kimtech</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>Vena8 Fluoro+ Biochips</td><td>Cellix</td><td>188V8CF-400-100-02P10</td><td>Benannt in Figur S1 A als 'Biochip'Vena8</td></tr> <tr><td>Schlauch</td><td>Cellix</td><td>TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F</td><td>Benannt in Figur S1 B als 'Einwegschlauch'Vena8</td></tr> <tr><td>Nadeln</td><td>Cellix</td><td>SS-P-B1IC-B1OC-PACK200</td><td>Benannt in Figur S1 B als 'Pin'Steckverbinder</td></tr> <tr><td>für Einzeleinlasskabel von Biochips</td><td>Cellix</td><td>CONNECTORS-B1IC-PACK100</td><td></td></tr><tr><td>Multiflow8 connect</td><td>Cellix</td><td>MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS</td><td>Benannt in Abbildung S1 B als 'Wiederverwendbarer Schlauch' und '</td></tr><tr><td>Splitter'Befeuchtete Box</td><td>Cellix</td><td>HUMID-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Software Mikrofluidikpumpe</td><td>Cellix</td><td>N/A</td><td>Venaflux Assay</td></tr><tr><td>Horm Collagen</td><td>Takeda/Nycomed</td><td>1130630</td><td>Natives Kollagen der Pferdesehne (Typ I) Isotonische Glukoselösung zur Verdünnung von Kollagen wird ergänzt</td></tr><tr><td>HEPES gepufferte Kochsalzlösung (HBS)</td><td>Inhouse-Präparation</td><td>Inhouse-Präparation</td><td>10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES) gepufferte Kochsalzlösung (0,9 % (w/v) NaCl, pH 7,4)</td></tr><tr><td>Blockierungspuffer</td><td>in der Hausaufbereitung</td><td>in der Hausvorbereitung</td><td>1,0 % (w/v) Rinderserumalbumin und 0,1 % (w/v) Glukose in HBS</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Molekulare Sonden</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>Bleiche 10 %</td> <td>im Haus Aufbereitung</td><td>im Haus Aufbereitung</td><td></td></tr><tr><td>0,1 M NaOH</td><td>im Haus Aufbereitung</td><td>im Haus</td><td></td>Aufbereitung</tr><tr><td>Denaturierter Alkohol</td><td>Fiers</td><td>T0011.5</td><td></td></tr><tr><td>Mirus Evo Nanopump</td><td>Cellix</td><td>188-MIRUS-PUMP-EVO</td><td>mit Multiflow8. Benannt in Figure S1 A als 'Pump' und 'Manifold'Mikroskop</td></tr> <tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td><td>ausgestattet mit einer colibri-LED und hochauflösender CCD-Kamera</td></tr><tr><td>Software Mikroskop&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>ZEN 2012</td></tr><tr><td>Hämatologie-Analysator</td><td>Sysmex</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>521-0095</td><td></td></tr><tr><td>Thrombozyten-Inkubator</td><td>Helmer</td><td>PF-48i</td><td></td></tr><tr><td>Inkubationswasserbad</td><td>GFL</td><td>1013</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Marke</td><td>A03429</td><td></td></tr><tr><td>Röhrchenrolle</td><td>Ratek</td><td>BTR5-12V</td><td></td></tr><tr><td>Steriles Andockgerät</td><td>Terumo BCT</td><td>TSCD</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchversiegelung</td><td>Terumo BCT</td><td>AC-155</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr></tbody></table>

mikrofluidik-strömungskammern mit rekonstituierte blut hämostaseologie und transfusions platelet zu modell<em&gt; in vitro</em

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blutplättchen, die für die Transfusion vorbereitet wurden, verlieren während der Lagerung allmählich ihre hämostatische Funktion. Die Thrombozytenfunktion kann mit einer Vielzahl von (indirekten) in vitro-Experimenten untersucht werden, aber keines davon ist so umfassend wie mikrofluidische Strömungskammern. In diesem Protokoll wird die Rekonstitution von thrombozytopenischem Frischblut mit gelagerten Blutbank-Blutplättchen verwendet, um eine Thrombozytentransfusion zu simulieren. Als nächstes wird die rekonstituierte Probe in mikrofluidischen Strömungskammern perfundiert, die die Blutstillung an exponierten subendothelialen Matrixproteinen nachahmen. Die Auswirkungen von Blutspende, Transport, Komponententrennung, Lagerung und Erregerinaktivierung können in gepaarten Versuchsdesigns gemessen werden. Dies ermöglicht einen zuverlässigen Vergleich, welche Auswirkungen jede Manipulation bei der Aufbereitung von Blutbestandteilen auf die Blutstillung hat. Unsere Ergebnisse zeigen den Einfluss von Temperaturzyklen, Scherraten, Thrombozytenkonzentration und Lagerdauer auf die Thrombozytenfunktion. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll die Funktion der Blutbank-Thrombozyten analysiert und letztendlich zur Optimierung der Verarbeitungskette beiträgt, einschließlich Phlebotomie, Transport, Komponentenvorbereitung, Lagerung und Transfusion.

Um zu zeigen , Variation intra-assay, drei identische rekonstituierten Vollblutproben wurden gleichzeitig über Kollagen - beschichteten Oberflächen (Abbildung 1) perfundiert. Dies führte zu einem Variationskoeffizienten von 8,7%. Diese Statistik deutet darauf hin, akzeptabel Intra-Assay und labor Variation zuverlässigen Vergleich zwischen verwandten Proben ermöglicht. Der Einlass der kommerziellen Strömungskam...

Die Thrombozytentransfusion und Hämostase wurde unter Verwendung von Blutrekonstitution und mikrofluidischen Flusskammern modelliert, um die Funktion von Blutbankplättchen zu untersuchen. Die Daten zeigen die Auswirkungen einer Thrombozytenspeicherung auf die Blutstillung in vitro.

Mikrofluidik-Strömungskammern Mit Rekonstituierte Blut Hämostaseologie und Transfusions Platelet zu Modell<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, eine Thrombozyten-Transfusion in vitro nachzuahmen und mittels Hämostase auf Kollagen unter hydrodynamischem Fluss und Echtzeit-Mikroskopie zu überprüfen. Patienten mit Thrombozytopenie werden mit gelagerten Thrombozytenkonzentraten behandelt. Unsere Methode soll helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Thrombose und Hämostase zu beantworten, wobei der Schwerpunkt insbesondere auf der Qualität und Funktion solcher gelagerten Thrombozytenkonzentrate liegt.Der zusätzliche Nutzen dieser Technik liegt darin, dass sie den Blutfluss nachahmt und somit rheologische Einflüsse auf beteiligte Zellen und Biomoleküle berücksichtigt. Die vorliegende Methode bewertet die Bindung von Thrombozyten an Kollagen. Sie kann jedoch auch auf anderes adhäsives Gewebe angewendet werden, einschließlich atherosklerotischer Plaques, endothelialer Zellen oder spezifischer Matrixproteine wie dem von-Willebrand-Faktor und Fibrinogen.Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Biochips. Vortexen und verdünnen Sie einen Kollagen-Stammlösung im Verhältnis 1 zu 20 in der vom Hersteller bereitgestellten isotonischen Glucoselösung auf eine Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter. Geben Sie anschließend 0,8 Mikroliter in die Kanäle eines neuen Einweg-Biochips pipettierend hinein.Füllen Sie alle Kanäle an einem Ende des Chips und markieren Sie dieses als Auslassende. Überprüfen Sie anschließend den Chip, um sicherzustellen, dass sich jede Spur zu fünf Sechsteln mit der Lösung gefüllt hat und keine Luftblasen vorhanden sind. Inkubieren Sie den Chip dann vier Stunden lang oder über Nacht bei vier Grad Celsius in einem befeuchteten und geschlossenen Behälter.Später verschließen Sie die codierten Kanäle, indem Sie Sperrpuffer in das jeweils andere Ende der Kanäle pipettieren. Schneiden Sie anschließend für jeden Kanal Schläuche mit einer Länge von 12 Zentimetern zu und befestigen Sie an jedes Schlauchstück eine Nadel, um sie am Biochip befestigen zu können. Spülen Sie die Schläuche mit destilliertem Wasser aus einer Spritze und einem Verbinder.Dann sättigen Sie sie mit Blockierpuffer und verschließen Sie sie in einem befeuchteten Behälter für mindestens eine Stunde. Bereiten Sie anschließend die Pumpe und das Verteilerrohr vor. Spülen Sie zuerst die Pumpe und das Verteilerrohr mit destilliertem Wasser, um eventuelle Luftblasen zu entfernen.Befestigen Sie als Nächstes den Biochip auf der automatisierten Mikroskopbühne. Stecken Sie ein Ende der Leitungen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, das mit HBS gefüllt ist, und verbinden Sie das andere Ende mit den Zulauföffnungen des Biochips. Stecken Sie die Verteilerstifte in die Auslassöffnungen des Biochips.Anschließend spülen Sie das System mit HBS unter Verwendung der Pumpe. Jeglicher verbliebene Blockierpuffer oder schlecht angehefteter Kollagen wird auf diese Weise entfernt. Damit sind die Vorbereitungen der Durchflusskammer abgeschlossen.Beginnen Sie mit dem Zusammenführen neuerer Blutentnahmen von gesunden Freiwilligen in einem kegelförmigen Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Probe etwa 15 Minuten bei 250 G. Verwenden Sie nicht die Bremse, da diese die locker gepackte untere Phase stören würde. Entfernen und verwerfen Sie das thrombozytenreiche Plasma sowie die Büffelhaut (Buffy Coat).Speichern Sie die gepackten roten Blutkörperchen mit möglichst wenigen Thrombozyten, um das rekonstituierte Blut herzustellen. Beginnen Sie nun damit, vier Milliliter Typ-AB-Plasma bei 37 Grad Celsius fünf Minuten und 20 Sekunden lang aufzutauen. Bestimmen Sie währenddessen den Hämatokrit der hergestellten gepackten roten Blutkörperchen mithilfe eines automatisierten Hämatologie-Analysators.Bestimmen Sie anschließend die Thrombozytenkonzentration eines aus dem Blutspendedienst stammenden Thrombozytenkonzentrats, das zur Rekonstitution des Vollbluts verwendet werden soll. Berechnen Sie die erforderlichen Volumina für ein Milliliter rekonstituiertes Blut mit einem Hämatokrit von 40 % und 250.000 Thrombozyten pro Mikroliter. Überführen Sie nun mithilfe einer abgeschnittenen Pipettenspitze die erforderlichen Volumina an roten Blutkörperchen, Plasma und Thrombozytenkonzentrat in die gewünschte Endkonzentration und ein Endvolumen von einem Milliliter.Mischen Sie das rekonstituierte Blut durch vorsichtiges Umstülpen und führen Sie eine vollständige Blutbildanalyse durch. Danach nehmen Sie ein vorbereitetes Mikrozentrifugenröhrchen, das Calcein AM enthält, und geben ein Milliliter des rekonstituierten Blutes hinzu. Mischen Sie das Blut mit dem Farbstoff durch vorsichtiges Umstülpen.Anschießend das rekonstituierte Blut fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. In der Software den interessierenden Bereich in der Perfusionsbahn auswählen. Bei 100-facher Vergrößerung auf die am Boden der Bahnen haftenden Kollagenfasern fokussieren.Verwenden Sie idealerweise Phasenkontrast oder differentiellen Interferenzkontrast. Wählen Sie die Option „Aktuellen Z-Wert für ausgewählte Kachelbereiche festlegen“, um die ausgewählten Z-Positionen digital zu fixieren. Der optische Fokus vor der Perfusion sollte auf dem Ameloblastenkollagen liegen, dies kann jedoch schwierig sein.Eine Alternative besteht darin, den Mikroskopfokus auf die anfänglich haftenden Thrombozyten einzustellen. Mischen Sie die Proben nun vorsichtig und platzieren Sie sie neben dem Biochip. Anschließend führen Sie den Schlauch, der mit der beobachteten Spur verbunden ist, in das rekonstituierte Blut ein.Als Nächstes wird mithilfe der Software, die die Pumpe steuert, ein Druck von 50 dyn pro Quadratzentimeter aufgebracht, um die Blutprobe in die Spur zu bewegen und das Experiment zu starten. Während des Experiments werden alle 15 Sekunden für fünf Minuten Bilder aufgezeichnet. Die Kinetik des Thrombuswachstums wird anschließend mittels Bildanalyse-Software bestimmt.In diesem Fall wird Zen 2012 verwendet. Öffnen Sie zunächst das Plugin zur Bildanalyse, um die Oberflächenbedeckung der Thrombozyten zu bestimmen. Stellen Sie in der Registerkarte „Analyze Interactive“ die Fluoreszenzschwelle ein, um die Pixelintensität festzulegen, die mit einem positiven Signal korreliert, das von anhaftenden Thrombozyten stammt.Verwenden Sie anschließend „create tables“, um automatisch eine Tabelle mit einer Liste der Oberflächenbereiche der positiven Signale für jeden Zeitpunkt zu generieren. Speichern Sie diese Tabellen im XML-Format und öffnen Sie sie zur weiteren Berechnung in einem Tabellenkalkulationsprogramm. Berechnen Sie für jeden Zeitpunkt die gesamten Oberflächenbereiche der ausgewählten Objekte und geben Sie diesen Wert als Prozentsatz der bedeckten Oberfläche an.Anschließend werden die Daten in Abhängigkeit von der Perfusionszeit aufgetragen und die Steigung mittels linearer Regression berechnet. Dies modelliert die Thrombuswachstumskinetik für diese spezielle experimentelle Bedingung. Drei identische rekonstituierte Vollblutproben wurden gleichzeitig über kollagenbeschichtete Oberflächen perfundiert.Dies führte zu einem Variationskoeffizienten von 8,7 %, was auf eine akzeptable Intra-Assay- und Intra-Labor-Variation für den Testvergleich hindeutet. Die Transfusion wurde durch Rekonstitution des Blutes mit der fehlenden Komponente simuliert. Es wurden mehrere Rekonstitutionen mit abnehmenden Thrombozytenkonzentrationen durchgeführt.Wie erwartet führten niedrigere Thrombozytenzahlen zu einer geringeren Adhäsion in Abhängigkeit von der Perfusionszeit. Anschließend wurde der Einfluss verringerten Temperaturen nach der Blutentnahme und während der Perfusion untersucht. Es zeigte sich, dass Thromben langsamer entstehen, wenn das Blut auf Raumtemperatur abgekühlt wird.Im Vergleich zu einer Probe, die während der gesamten Studie bei 37 Grad Celsius gehalten wurde. Während des Zirkulationsvorgangs binden Thrombozyten unter Bedingungen erhöhter Wandschubspannung an Gefäßverletzungsstellen. Wie erwartet führte die Variation der Scherrate in den mikrofluidischen Durchflusskammern zu einer Veränderung der gesamten Thrombozytenadhäsion.Unter diesen Bedingungen ändert sich auch die Kinetik des Thrombuswachstums. Nach dem Anschauen dieses Videos sollte man ein gutes Verständnis dafür haben, wie mikrofluidische Durchflusskammerexperimente mit rekonstituiertem Blut durchgeführt werden, um die Qualität und Funktion gelagerter Thrombozytenkonzentrate zu testen. Diese Technik kann in etwa sieben Stunden durchgeführt werden.Experimente mit mikrofluidischen Flusskammern ebneten Forschern auf dem Gebiet der Thrombozytentransfusion den Weg, um die Auswirkungen von Spende-, Herstellungs- und Lagerungsvariablen zu untersuchen. Ein relevantes Beispiel ist die Pathogeninaktivierung. Wir haben ein Beispiel für ein einziges experimentelles Thema gegeben.Jedoch können Variationen der Kalziumkonzentration, Scherbelastung und Oberflächenbeschichtungen genutzt werden, um unterschiedliche Forschungsfragen zu adressieren. Ähnlich wie bei diesem Verfahren können andere Messungen in mikrofluidischen Durchflusskammern durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten. Beispielsweise die Leistungsfähigkeit gelagerter Thrombozyten bei der Gerinnung unter Durchflussbedingungen.

microfluidic-flow-chambers-using-reconstituted-blood-to-model

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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