Mikrofluidik-Strömungskammern Mit Rekonstituierte Blut Hämostaseologie und Transfusions Platelet zu Modell In Vitro

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Thrombozytentransfusion in vitro nachzuahmen und sie mittels Blutstillung an Kollagen, mit hydrodynamischer Strömung und Echtzeitmikroskopie zu testen. Patienten mit Thrombozytopenie werden mit gelagerten Thrombozytenkonzentraten behandelt. Unsere Methode soll helfen, zentrale Fragen im Bereich der Thrombose und Blutstillung zu beantworten, wobei der Schwerpunkt auf der Qualität und Funktion solcher gelagerten Thrombozytenkonzentrate liegt.

Der Mehrwert dieser Technik besteht darin, dass sie den Blutfluss nachahmt und somit rheologische Einflüsse auf die beteiligten Zellen und Biomoleküle berücksichtigt. Die derzeitige Methode bewertet die Bindung von Blutplättchen an Kollagen. Es kann jedoch auch auf anderes adhäsives Gewebe angewendet werden, einschließlich atherosklerotischer Plaque, Endothelzellen oder spezifischer Matrixproteine wie dem Von-Willebrand-Faktor und Fibrinogen.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Biochips. Einen Kollagenfond eins bis 20 in der isotonischen Glukoselösung des Herstellers auf eine Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter vortexen und verdünnen. Pipettieren Sie dann 0,8 Mikroliter in die Bahnen eines neuen Einweg-Biochips.

Füllen Sie alle Bahnen an einem Ende des Chips und markieren Sie dies als Auslassende. Überprüfen Sie dann den Chip, um sicherzustellen, dass jede Bahn zu 5/6 mit der Lösung gefüllt ist und keine Luftblasen vorhanden sind. Inkubieren Sie den Chip dann vier Stunden lang bei vier Grad Celsius oder über Nacht in einem befeuchteten und geschlossenen Behälter.

Blockieren Sie später die codierten Kanäle, indem Sie den Blockierungspuffer in das andere Ende der Fahrspuren pipettieren. Schneiden Sie dann für jede Bahn 12 Zentimeter lange Schläuche ab und befestigen Sie einen Stift an jedem Schlauchstück, um sie am Biochip befestigen zu können. Spülen Sie die Schlauchlängen mit destilliertem Wasser aus einer Spritze und einem Konnektor.

Tränken Sie sie dann mit Blockierungspuffer und verschließen Sie sie mindestens eine Stunde lang in einem befeuchteten Behälter. Bereiten Sie als nächstes die Pumpe und den Verteiler vor. Spülen Sie zuerst die Pumpe und den Verteiler mit destilliertem Wasser, um Luftblasen zu entfernen.

Befestigen Sie anschließend den Biochip an dem automatisierten Mikroskoptisch. Legen Sie ein Ende der Längen in ein mit HBS gefülltes 1,5-Milliliter-Röhrchen und befestigen Sie sie dann mit dem anderen Ende an den Biochip-Einlässen. Stecken Sie die Verteilerstifte in die Auslässe des Biochips.

Spülen Sie dann das System mit HBS mit der Pumpe. Eventuell verbleibende Blockierungspuffer oder schlecht haftendes Kollagen werden so entfernt. Damit sind die Vorbereitungen für die Durchflusskammer abgeschlossen.

Beginnen Sie damit, die jüngsten Blutentnahmen von gesunden Freiwilligen in einem konischen Zentrifugenröhrchen zu bündeln. Drehen Sie die Probe etwa 15 Minuten lang bei 250 Gs.Do betätigen Sie die Bremse nicht, da dies die locker gepackte untere Phase stört. Entfernen und entsorgen Sie das plättchenreiche Plasma und den Buffy Coat.

Bewahren Sie die verpackten roten Blutkörperchen auf, die so wenig Blutplättchen wie möglich enthalten, um das rekonstituierte Blut herzustellen. Beginnen Sie nun mit dem Auftauen von vier Millilitern Plasma vom Typ AB bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten und 20 Sekunden. In der Zwischenzeit bestimmen Sie den Hämatokrit der vorbereiteten verpackten roten Blutkörperchen mit einem automatisierten Hämatologie-Analysegerät.

Bestimmen Sie dann die Thrombozytenkonzentration eines von der Blutbank vorbereiteten Thrombozytenkonzentrats, das für die Rekonstitution des Vollbluts verwendet werden soll. Berechnen Sie die erforderlichen Volumina für einen Milliliter rekonstituiertes Blut mit 40 % Hämatokrit und 250.000 Blutplättchen pro Mikroliter. Übertragen Sie nun mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze das erforderliche Volumen an roten Blutkörperchen, Plasma und Thrombozytenkonzentrat auf die gewünschte Konzentration und ein Endvolumen von einem Milliliter.

Mischen Sie das rekonstituierte Blut mit sanften Inversionen und führen Sie ein vollständiges Blutbild durch. Besorgen Sie sich dann ein vorbereitetes Mikrozentrifugenröhrchen mit Calcein AM und fügen Sie einen Milliliter rekonstituiertes Blut hinzu. Mischen Sie das Blut mit Farbstoff durch sanfte Umkehrhaltungen.

Inkubieren Sie dann das rekonstituierte Blut fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Wählen Sie in der Software den interessierenden Bereich in der Perfusionsspur aus. Konzentrieren Sie sich auf die Kollagenfasern, die am unteren Ende der Bahnen bei 100-facher Vergrößerung haften.

Idealerweise verwenden Sie Phasenkontrast oder differentiellen Interferenzkontrast. Wählen Sie die Option Aktuelles Z für ausgewählte Kachelbereiche festlegen, um die ausgewählten Z-Positionen digital zu fixieren. Der optische Fokus vor der Perfusion sollte auf Ameloblastenkollagen liegen, aber das kann schwierig sein.

Eine Alternative besteht darin, den Fokus des Mikroskops auf die anfänglich anhaftenden Blutplättchen zu setzen. Mischen Sie nun die Proben vorsichtig und positionieren Sie sie neben dem Biochip. Führen Sie dann den Schlauch, der mit der beobachteten Spur verbunden ist, in das rekonstituierte Blut ein.

Wenden Sie anschließend mit der Software, die die Pumpe steuert, einen Druck von 50 dyn pro Quadratzentimeter an, um die Blutprobe in die Fahrspur zu bewegen und das Experiment zu starten. Nehmen Sie während des Experiments fünf Minuten lang alle 15 Sekunden Bilder auf. Bestimmen Sie die Kinetik des Thrombuswachstums mit Hilfe einer Bildanalysesoftware.

In diesem Fall kommt Zen 2012 zum Einsatz. Beginnen Sie mit dem Öffnen des Plugins für die Bildanalyse, um die Oberflächenabdeckung der Blutplättchen zu bestimmen. Legen Sie den Fluoreszenzschwellenwert auf der Registerkarte "Interaktive Analyse" fest, um die Pixelintensität zu definieren, die mit einem positiven Signal korreliert, das von anhaftenden Blutplättchen ausgehen würde.

Verwenden Sie dann Tabellen erstellen, um automatisch eine Tabelle mit einer Liste der Oberflächen der positiven Signale für jeden Zeitpunkt zu erstellen. Speichern Sie diese Tabellenkalkulationen im XML-Format und öffnen Sie sie in einem Tabellenkalkulationsprogramm für weitere Berechnungen. Berechnen Sie zu jedem Zeitpunkt die Gesamtoberfläche der ausgewählten Objekte, und drücken Sie diesen Wert als Prozentsatz der abgedeckten Oberfläche aus.

Stellen Sie dann die Daten als Funktion der Perfusionszeit dar, und berechnen Sie die Steigung durch lineare Regression. Dies modelliert die Thrombuswachstumskinetik der jeweiligen experimentellen Bedingung. Drei identische rekonstituierte Vollblutproben wurden gleichzeitig über kollagenbeschichtete Oberflächen perfundiert.

Dies führte zu einem Variationskoeffizienten von 8,7 %, was auf eine akzeptable Variation innerhalb des Assays und innerhalb des Labors für den Testvergleich hindeutet. Die Transfusion wurde simuliert, indem das Blut mit der mangelhaften Komponente rekonstituiert wurde. Es wurden mehrere Rekonstitutionen mit abnehmenden Thrombozytenkonzentrationen durchgeführt.

Erwartungsgemäß führte eine niedrigere Thrombozytenzahl zu einer geringeren Adhäsion in Abhängigkeit von der Perfusionszeit. Anschließend wurde der Effekt von erniedrigten Temperaturen nach der Blutentnahme und während der Perfusion untersucht. Es wurde festgestellt, dass sich Thromben langsamer bilden, wenn das Blut auf Raumtemperatur abgekühlt wird.

Im Vergleich zu einer Probe, die während der gesamten Studie bei 37 Grad Celsius gehalten wurde. Während der Zirkulation binden Blutplättchen an Gefäßverletzungsstellen bei erhöhter Wandbelastung. Wie erwartet veränderte sich durch Variation der Schergeschwindigkeit in den mikrofluidischen Durchflusskammern die Gesamtadhäsion der Blutplättchen.

Diese Bedingungen verändern auch die Kinetik des Thrombuswachstums. Nach dem Anschauen dieses Videos sollte man ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mikrofluidische Durchflusskammerexperimente mit rekonstituiertem Blut durchführt, um die Qualität und Funktion von gelagerten Thrombozytenkonzentraten zu testen. Diese Technik kann in etwa sieben Stunden durchgeführt werden.

Experimente mit mikrofluidischen Durchflusskammern ebneten den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Thrombozytentransfusion, um den Einfluss von Spende-, Vorbereitungs- und Lagerungsvariablen zu untersuchen. Ein relevantes Beispiel ist die Inaktivierung von Krankheitserregern. Wir haben nur ein Beispiel für ein Versuchsobjekt gegeben.

Schwankungen in der Kalziumkonzentration, der Scherspannung und den Oberflächenbeschichtungen können jedoch zur Beantwortung unterschiedlicher Forschungsfragen herangezogen werden. Ähnlich wie bei diesem Verfahren können weitere Messungen in mikrofluidischen Durchflusskammern durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten. Zum Beispiel die Leistung der gelagerten Blutplättchen bei der Gerinnung im Fluss.