Name: Methoden Alternative Promoter Verwendung und Transkriptions-Verordnung von Murine Bcrp1 zu entdecken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Lernen Sie alternative Promotornutzung und Transkriptionsregulation von murinem Bcrp1 mit In-silico-Methoden und Luciferase-Reporter-Assays. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung funktionaler Promotoren in verschiedenen Geweben.

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Diese Arbeit wurde von Merit Review Awards Douglas D. Ross und Arif Hussain aus dem Department of Veterans &#39;Affairs unterstützt.

1. In Silico Vorhersage von alternativen ersten Exons von Bcrp1 Mit BLAST - Analyse von Maus - EST - Datenbank Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt, wie die Maus ausgedrückt Sequenz-Tag (EST) Datenbank für ESTs mit Sequenzähnlichkeit zu suchen, um Exon 2 von Bcrp1 (die die Translationsstartstelle enthält) und dann, wie die passenden EST-Sequenzen zu genomischen Sequenzen auszurichten ihre zu ermitteln Lage in der Maus Bcrp1 Gen in Bezug auf das 5&#39;-Ende von Bcrp1 Exon 2. <ol><li> Erhalten Sie die Sequenz für Maus Bcrp1 Exon 2 durch die mRNA Referenzsequenz ID Eingeben (NM_011920.3) in das Suchfenster des Ensembl Genome Browser 17, klicken Sie auf &quot;GO&quot; . Im nächsten Fenster wählen Sie eine Sequenz in voller Länge (enthält 16 Exons): <ol><li> Im nächsten Bildschirm ( &quot;Transcript-basierte Display&quot;), wählen Sie &quot;16 Exons.&quot; Dadurch wird ein Fenster, das die Sequenz aller Exons von Bcrp1 anzuzeigen. Exon 2 von Bcrp1 erscheint &quot;59; -AAAGGC ... TATCAA-3 &#39; &quot;Die Ergebnisse werden in ähnlichen Bezugszeichen 18 gezeigt , solche , die erhalten.. </li><li> Klicken Sie auf den &quot;Download-Sequenz&quot; -Option. Im nächsten Fenster wählen Sie das FASTA-Format, und klicken Sie dann auf &quot;Vorschau&quot;. Im nächsten Fenster kopieren Sie die Vorschau-Sequenz von Exon 2 in die Zwischenablage. </li></ol></li><li> Navigieren Sie zu dem BLAST - Homepage 19 am National Center for Biotechnology Information (NCBI) Webseite 20. <ol><li> Wählen Sie &quot;Maus&quot; Genom. Fügen Sie den Exon-2-Sequenz aus der Zwischenablage in das Suchfeld eingeben. </li><li> Wählen Sie &quot;ESTs&quot; aus der Datenbank Dropdown-Liste optimieren für &quot;sehr ähnliche Sequenzen&quot;, und wählen Sie dann &quot;BLAST&quot;. Laufzeit wird ein paar Minuten dauern. Wenn der BLAST Lauf abgeschlossen ist, wird die &quot;Ergebnisse&quot; Seite angezeigt werden. </li><li> Im Rahmen der &quot;Beschreibungen&quot; Hierher der Seite &quot;Ergebnisse&quot;, wählen Sie &quot;ALL&quot;, dann &quot;Download&quot; und dann &quot;FASTA (komplettSequenz) &quot;in der Dropdown-Liste, und wählen Sie dann&quot; Weiter &quot;eine .txt-Datei erscheint,. geöffnet und die gesamte Datei in die Zwischenablage kopieren Die TXT-Datei mit der Maus Bcrp1 exon2 die Sequenzen aller ESTs mit hoher Sequenzähnlichkeit enthält. aber nicht in Bezug ihre Position 2 in dem Bcrp1 Gen Exon. Hinweis: Eine Analyse durchgeführt , am 15. April 2015 14 Maus - ESTs identifiziert , die ausgerichtet mit Bcrp1 Exon 2. Diese sind in Tabelle 1 aufgeführt sind. </li></ol></li><li> Identifizieren die Position der EST-Sequenz, die 5 &#39;2 in der Bcrp1 Gen Exon. Die Maus Bcrp1 Gen in dem Chromosom 6 contig NC_000072.6 (: 372.099.104 GI) befindet. <ol><li> Auf der BLAST-Homepage unter der &quot;Specialized Explosion&quot; Hierher, wählen Sie &quot;Richten Sie zwei (oder mehr) Sequenzen unter Verwendung von BLAST (bl2seq).&quot; </li><li> Fügen Sie die Textdatei aus der Zwischenablage in das Suchfeld eingeben und geben Sie 372099104 in der Betreff-Sequenz-Box. Optimieren Sie für &quot;sehr ähnliche Sequenzen&quot; unter ProgrammAuswahl und führen BLAST. </li><li> Sobald das Ergebnisfenster erscheint, sehen Sie grafisch die Ausrichtungen durch einen Klick auf &quot;Grafik&quot; in der &quot;Alignments&quot; Fenster. Verwenden Sie die rechte und linke Pfeile und Zoom auf Bcrp1 / ABCG2 und die Sequenz-Alignments zu konzentrieren. </li><li> Speichern Sie die Sequenz-Alignments: Wählen Sie &quot;ALL&quot; in der &quot;Beschreibungen&quot; Box, dann unter dem &quot;Download&quot; Drop-Down wählen Sie &quot;Hit-Tabelle (CSV)&quot; und klicken Sie dann auf &quot;Weiter&quot;. Diese Datei enthält die Sequenz-Alignment von Bcrp1 Exon 2 und die Ausrichtung aller EST-Sequenzen mit Sequenz-Ähnlichkeit zu Bcrp1 Exon2 bezogen auf die Numerierung der Nukleotide in dem Maus-Chromosom 6 Contig. Jede vollständige EST-Sequenz möglicherweise mehrere Ausrichtungen Spanning Regionen 5 &#39;und 3&#39; zu generieren 2 einschließlich der Sequenzen, Exon Überlappung mit Bcrp1 Exon 2. </li><li> Da die Position des 5&#39;-Ende von Exon 2 58.655.638 bis Nukleotid in dem Chromosom 6 contig entsprechen wird, bezeichnen dies als+1 Und dann berechnen die Position der Teilsequenzen jedes EST 5 &#39;bis 58.655.638. Die Ergebnisse für die 14 ESTs sind in Tabelle 1 angegeben. Hinweis: Seien Sie vorsichtig EST - Sequenzen zu analysieren , die 5 &#39;zu 1 (dh einen negativen Nukleotid - Wert) als mögliche erste Exons. In zwei der ESTs beispielsweise, das war mit Bcrp1 Exon 2 gezeigt in Tabelle 1 (AI647825 und AI664571) die verbleibende Sequenz 2 bis Exon 3 &#39;ausgerichtet ist . </li></ol></li></ol> 2. Bewertung von Bcrp1 Alternative Promotorfunktion <ol><li> Gestaltung von Reporterkonstrukte für Bcrp1 E1U, E1A, E1B und E1C Veranstalter <ol><li> Mit der Folge von E1U erhalten von der EST-Datenbank suchen, bezeichnen die ersten 5&#39;-Nukleotid von E1U als +1. </li><li> Besorgen Sie sich eine bakterielle künstliche Chromosom (BAC) Klon von Maus-Chromosom 6, die die Bcrp1 / ABCG2 Gensequenz und die Sequenz mindestens 100 kb stromaufwärts von der enthältBcrp1 / ABCG2-Gen (siehe Liste der Materialien und Geräte). <ol><li> Identifizieren eines geeigneten Reportervektor wie die Luciferasereporterplasmid pGL3-Basic. </li><li> Bestimmen Sie die multiple Klonierungsstellen in den Reportervektor. KpnI, SacI, Mlu1, NheI, SmaI, XhoI, BglII und HindIII sind die Restriktionsendonuklease-Stellen in die multiple Klonierungsstelle des pGL3-Basic Vektor in 5 &#39;→ 3&#39;-Orientierung. Hinweis: Die Reihenfolge der Verdauung Webseiten, die auf Produktkataloge von Firmen zur Verfügung, die die Restriktionsenzyme produzieren. </li><li> Identifiziere alle Verdauungsstellen in der E1U Exon und das 2 kb-Region 5 &#39;von E1U Softwareprogramme wie DNA5 verwenden. Identifizieren mindestens zwei Verdauung Standorten in den pGL3-Basic Mehrfachklonierungsstelle, die nicht in E1U oder 2 kb upstream-Region zu finden sind. Anmerkung: Sie müssen eine multiple Klonierungsstelle Restriktionsstelle für die Vorwärts-Primer zu wählen, die für die Rückwärts-Primer ausgewählt, stromaufwärts von der einen ist, um sicherzustellen, daß der Einsatz will liegen in der richtigen Ausrichtung. </li></ol></li><li> Bereiten Sie Vorwärts- und Rückwärts-Primer für die PCR, die Sequenzen für die ausgewählten pGL3-basic Mehrfachklonierungsstelle Restriktionsendonukleasestellen mit kommerziellen Gen / Primer-Synthese Dienstleistungen oder Primer Auswahlsoftware (siehe Liste der Materialien und Geräte) enthalten. Wählen Sie einen Forward-Primer befindet ~ 2 kb stromaufwärts von der E1U Sequenz und einer Rückwärts-Primer innerhalb der E1U Sequenz. Die Primer, die in der Autoren verwendet &#39;früheren Arbeiten integriert, um eine SacI-Stelle in der Vorwärts-Primer und eine NheI-Stelle in der Rückwärts-Primer, und verstärkt die genomische Region von etwa -1.906-64 mit dem ersten 5&#39;-Nukleotid von E1U angegeben als + 1 (siehe Schritt 2.1.1 oben) und sind in Bezug 16 zur Verfügung gestellt. <ol><li> PCR - Amplifikation die E1U genomischen Region unter Verwendung dieser Primer, 0,01 bis 1 ug des BAC und PCR - Master - Mix High-Fidelity - Taq - Polymerasen enthält (siehe Liste der Materialien und Geräte) mit Denaturierung bei95 ° C für 30 Sekunden, dann 35 bis 40 PCR-Zyklen, mit der Erweiterung bei 72 ° C (2 min), und Tempern und Schmelztemperaturen auf der Grundlage der Schmelzeigenschaften der verwendeten Primer. Anmerkung: Die Verwendung von High-Fidelity Taq - Polymerasen zur Sequenzierung von Promotorregionen von wesentlicher Bedeutung ist , die hohen GC - Gehalt haben. Wenn große genomische DNA-Fragmente unter Verwendung von beispielsweise einer BAC als Templat kann die Sekundärstruktur der genomischen DNA für PCR-Primer schwer zu binden. Wenn dieses Problem auftritt, kann eine bessere PCR-Ergebnisse erhalten werden, wenn die lange genomische DNA-Templat sanft durch Beschallung vor der PCR-Reaktion geschert wird. </li><li> Überprüfen Sie die Länge des amplifizierten PCR-Produkts durch einen Vergleich gegen eine 1 kb DNA-Leiter 0,8% TAE-Agarose-Gelelektrophorese. </li></ol></li><li> Digest das PCR-Produkt erhalten und den pGL3-Basic Vektor, mit den Restriktionsendonucleasen spezifisch für die Restriktionsverdauung Stellen eingeführt in die Vorwärts- und Rückwärtsprimer gemäß instructions mit den Restriktionsverdauungsenzyme geliefert. <ol><li> Reinige die Verdauung Reaktionen unter Verwendung von kommerziellen SV Gel und PCR Clean-Up - Systeme Satz (siehe Liste der Materialien und Geräte), nach dem Kit - Protokoll 21. <ol><li> Überprüfen Verdauung und Linearisierung des Vektors durch sie gegen den ungeschnittenen Vektor unter Verwendung von Agarosegel-Elektrophorese verglichen wird, dann geschnitten und reinige den verdauten Vektor DNA Band. Messen Sie die Konzentration des gereinigten PCR-Produkt und das gereinigte Vektor UV-Spektrometrie (siehe Liste der Materialien und Geräte). </li></ol></li></ol></li><li> Bereiten Sie die E1U Reporterkonstrukt durch das gereinigte Ligatur, Restriktionsenzym-verdaute PCR-Produkt und pGL3-Basic Glühwürmchen-Luciferase-Reportervektor (in dem Reporter-Assay-Kit enthalten, siehe Liste der Materialien und Geräte) im Einsatz: Vektor-Verhältnisse von 11, 21 und 31, unter Verwendung der &quot;T4 - DNA - Ligase schnell Ligationskits&quot; , wie pro Set Anweisungen 22, wodurch die E1U r Herstellungeporter Konstrukt, mit dem Namen pGL3-E1U. <ol><li> Verwenden Sie das pGL3-E1U Plasmid zur Transformation von Bakterien zu klonal pGL3-E1U folgenden Anweisungen in der TA-Cloning-Kit (siehe Liste der Materialien und Geräte) erweitern. </li><li> Bestätigen Sie die Ausrichtung und die Treue des Einsatzes durch Sequenzanalyse. </li></ol></li><li> Bereiten Reporterkonstrukte für E1A, E1B und E1C mit einer ähnlichen Methodik wie für E1U. Bestätigen Sie die Treue der Einsätze durch Sequenzierung, wie in Abschnitt 2.1.5.2. Anmerkung: Die Promotoreinsätze für E1A, E1B und E1C sollte ungefähr -1875 / + 10, -1847 / + 60 und -1904 / + 83 relativ zu dem ersten 5&#39;-Nukleotid (bezeichnet als +1) von E1A, E1B, oder E1C, respectively. </li></ol></li><li> Reporter - Assay - Verfahren Anmerkung: Allgemeine Strategie der Reporter-Assays: die putative Promotor (5&#39;-stromaufwärts-Region) eines Gens in die multiple Klonierungsstelle eines leeren &quot;Reporter&quot; Vektor insertiert, der eine &quot;reporte enthältr Gen &quot;(zB Glühwürmchen - Luciferase) stromabwärts von der Mehrfach - Klonierungsstelle. Der Vektor wird dann in eukaryotische Zellen transfiziert, die das Gen von Interesse exprimieren. Die trans-wirkenden Faktoren , die die Expression des Gens von Interesse in diesen Zellen zu fördern sollte die Aktivierung Promotor in der transfizierten Reportervektor, wodurch die Expression von Glühwürmchen-Luciferase, die sich leicht mit einem Lumineszenz-Assay quantifiziert werden kann. <ol><li> Wählen Sie die entsprechende Zelllinie für die Reporter-Assay zu verwenden. Hinweis: Um die Aktivität des E1U alternative Promotorreporterkonstrukt bewerten, ist es notwendig, dass in Zellen zu transfizieren, die konstruieren exprimieren Bcrp1 unter der Kontrolle des Promotors E1U. Die TM4 Maus Sertoli - Zelllinie (siehe Liste der Materialien und Geräte) drückt Bcrp1 Protein und Bcrp1 mRNA enthält E1U sowie E1A, E1B und E1C 5. Als negative Kontrolle, sollten Sie eine Zelllinie, die nicht Bcrp1 Protein oder mRNA exprimiert. </li><li> Kultur der TM4 cells in Platten mit 24 Vertiefungen bei einer Anfangsdichte von 200.000 Zellen / Vertiefung in einer 1: 1-Gemisch von Ham-F12-Medium und modifiziertem Eagle-Medium von Dulbecco mit 1,2 g / l Natriumbicarbonat, 15 mM HEPES mit 5% Pferdeserum, 2,5% fötales Rinderserum, Penicillin (100 IU / ml) und Streptomycin (100 ug / ml), bei 37 ° C, 5% CO 2, wie zuvor beschrieben 5. </li><li> Sechs Stunden nach der Zellen in Kultur platziert, transfizieren die Zellen mit 0,2 &amp; mgr; g pGL3-basic leeren Vektor oder mit 0,2 &amp; mgr; g pGL3-Vektor, enthaltend das -1906 / + 64 E1U oder -1875 / + 10 E1A oder -1847 / + 60 E1B oder -1904 / + 83 E1C Bcrp 1 Löschen konstruieren zusammen mit 4 ng pRL-TK (ein Renilla - Luciferase-exprimierenden Vektor) als interne Kontrolle, eine kommerzielle DNA - Transfektion Kit und Protokoll des Herstellers 23 (siehe Liste der Materialien und Geräte) . </li><li> 30 Stunden nach der Transfektion, entfernen Sie das Wachstumsmedium aus dem culturED-Zellen transfiziert. Waschen Sie die Zellen einmal mit 200 ul PBS, entfernen Sie dann die Waschlösung. <ol><li> Messen Sie Glühwürmchen und Renilla - Luciferase - Aktivität eines kommerziellen Kits nach Herstellerprotokolle 24. </li></ol></li><li> Drücken die Aktivität für jedes Rohr als das Verhältnis der Glühwürmchen - Luciferase - Aktivität , geteilt durch die interne (Renilla - Luciferase) -Steuerung; Gesamtergebnisse sind in der Regel als die Aktivität jedes Reportergen exprimiert mit dem leeren Vektor transfiziert pGL3 Grund derjenigen von Zellen relativ zu konstruieren, die einen Wert von 1 gegeben wird. </li></ol></li></ol>

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<li>Bulun, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aromatase+expression+in+breast+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue.</a> Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).</li>
</ol>

Douglas D. Ross und der University of Maryland, Baltimore halten Patentrechte für die menschliche BCRP.

Die Mehrzahl der Methoden und repräsentative Ergebnisse sind in früheren Arbeit mit dem Titel beschrieben &quot;B CRP1 Transkription in Maus Hoden wird durch einen Promotor kontrolliert vor einem neuen ersten Exons (E1U) durch steroidogenen factor-1 reguliert&quot; , die im Jahr 2013 5 veröffentlicht . Zusätzlich zu den hier gezeigten repräsentativen Ergebnissen, sofern die vorherige Papier Schätzungen von alternativen ersten Exons Nutzungs 5&#39;-RACE PCR und RT-PCR-Methodik. Darüber hinaus...

Mehr als die Hälfte der menschlichen Gene sind 1 durch alternative Promotoren geregelt. Jede alternative Promotor kann regulatorische Elemente enthalten, die sich von denen in anderen alternativen Promotoren voneinander verschieden sein können. Der Promotor (en) in einem Gewebe verwendet werden, können sich von denen in einem anderen Gewebe verwendet werden, unterscheiden. Beispielsweise ist es möglich, dass die Aktivierung eines bestimmten Signalwegs die alternative Promotor für ein Gen in einem Gewebe verwendet auslösen können, aber keine Wirkung auf oder eine separate alternative Promotor für das gleiche Gen unterdrücken, die in einem anderen Gewebe verwendet wird. Expression des Gens wird durch Bcrp1 alternative Promotoren geregelt. Bcrp1 ist die murine Ortholog des menschlichen Brustkrebsresistenzprotein (BCRP) -Gen. BCRP ist ein ATP-bindenden Kassette (ABC) Transporter, förmlich festgelegten ABCG2 2, 3. Als apikalen Plasmamembranprotein, BCRP / Bcrp1 Funktionen eine Vielzahl von natürlichen und xenobiotic Substrate Ausströmen <sup&gt; 3, 4. Bei Menschen und Mäusen, BCRP / Bcrp1 ist hoch in pharmakologisch relevanten Organe wie Leber (Gallenkanälchen), Darm und Niere, sowie Organe mit Blut-Gewebe - Barrieren wie Placenta, Hirn und Hoden 2 ausgedrückt, 5-12. Expression von BCRP / Bcrp1 in hämatopoetischen und anderen Stammzellen, einschließlich Krebsstammzellen kann Resistenz dieser Zellen Xenobiotika und Krebs chemotherapeutischen Medikamenten verleihen 3. In frühen Arbeiten die Regulierung der BCRP - Expression in normalen und neoplastischen Zellen, 5 &#39;RACE-PCR (5&#39;-RACE) Analyse der BCRP mRNA zu verstehen , wurde durchgeführt , seine genaue Transkriptionsstartstelle 13 zu bestimmen. Nicht nur waren mehrere Transkriptionsstartstellen gefunden; waren ebenfalls drei alternative Formen des ersten Exons, die in BCRP-untranslatierten auftritt. Diese alternativen ersten Exons - bezeichnet E1a, E1b, E1c - wurden unterschiedlich in einer Vielzahl von menschlichen Geweben exprimiert. Zwei weitere erste Exon - Varianten wurden in einer BLAST - Suche der menschlichen EST - Datenbank unter Verwendung des zweiten Exon von BCRP 13 entdeckt. Vier Begegnungen ergab eine erste Exon&gt; 70 kb stromaufwärts von Exon 2, die E1U bezeichnet wurden; vier anderen Spielen ergab BCRP mRNA , die ein erstes Exon völlig fehlte, die E1- 13 bezeichnet wurden. Das Vorhandensein alternativer Führer Exons wird als 14 eine Manifestation von alternativen Promotor Nutzung zu sein. Bei Mäusen vier alternative erste Exons von Bcrp1 beschrieben , die auf alternative Promotoren entsprechen , die Bcrp 1 Transkription in verschiedenen Geweben der Maus steuern; Diese Exons / Promotoren bezeichnet werden E1U, E1A, E1B und E1C und sind etwa 70, 58, 15 und 5 kb stromaufwärts von Exon 2 Bcrp1 5, 15 befindet. Die E1A mRNA Isoform wurde vorherrschend in Murin gefundene hämatopoetischen Stammzellen, Herz, Lunge, Milz und Gehirn, während die E1B - Isoform in Mausdarm, fetales exprimiert wurde , Leberzellen und erythroiden Vorläuferzellen in Knochenmark 5, 15. Der Promotor stromaufwärts von E1B wurde gezeigt, dass die Haupt alternative Promotor regeln Bcrp1 Transkription in Mausdarm zu sein, zumindest teilweise geregelt, indem phospho-zyklisches-AMP-Antwortelement bindendes Protein (p-CREB) und einem CREB-Response-Element einzigartig für diese alternative Bcrp1 Promotor 16. Die E1C mRNA Isoform überwiegend bei erwachsenen Maus - Leber und Niere 5 ausgedrückt. Die E1U Isoform ist nicht nachweisbar in den meisten getesteten Geweben mit Ausnahme von Mäusehoden, wo sie die vorherrschende Isoform 5 ausgedrückt. Bcrp1 ausgedrückt in Hoden von Ratten in beiden somatischen (endothelial tight junctions, peritubulären myoid Zellen und Sertoli - Zellen) gefunden und Keimzellen (in der seminiferous Endothel, wo es im Spätstadium spermatids 4 schützen kann). Die regIonen stromaufwärts von E1U enthält eine funktionelle Antwortelement für steroidogenen factor-1 (SF-1) 5. Bcrp1 mRNA und Protein werden in den Hoden von Sertoli zellspezifischen SF-1 - Knockout - Mäusen deutlich reduziert, was darauf hindeutet , dass Bcrp1 Expression in murinen Sertoli - Zellen durch SF-1 gesteuert wird , 5. Die Protokolle Detail Methoden vorgestellt alternativen ersten Exons von Bcrp1 in-silico zu detektieren und identifiziert Luciferase-basierten Reporterassays für putative Promotoren stromaufwärts von den alternativen ersten Exons zu etablieren.

<table><tbody><tr><td colspan="4">COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS:</td></tr><tr><td>First Choice RLM-RACE kit</td><td>Ambion Inc., Austin, TX, derzeit erhältlich über Life Technologies</td><td>AM1700</td><td>5'-RACE PCR-Kit</td></tr><tr><td>TOPO TA Klonierungskit</td><td>Life Technologies</td><td>K450001</td><td>Dieses Kit enthält die chemisch kompetenten TOP10 E. coli Bakterien.</td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase-Schnellligationskit</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td></td></tr><tr><td>Faststart High-Fidelity Taq-DNA-Polymerase</td><td>Sigma-Aldrich/Roche</td><td>3553400001/RMB-4738284001&nbsp;</td><td>Enthält eine High-Fidelity-Taq-Polymerase-Enzymmischung</td></tr><tr><td>XtremeGENE HP DNA-Transfektionsreagenz</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Luciferase Reporter Assay Kit</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td>Enthält den pGL3-basischen leeren Reportervektor (Glühwürmchen-Luziferase), den pRLTK-Renilla-Luziferase-Exprimationsvektor und andere Kontrollvektoren.</td></tr><tr><td>QIAprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Für Plasmid miniprep - Isolierung und Reinigung von Plasmid-DNA aus Bakterienkolonien</td></tr><tr><td>pCR2.1 Vektor</td><td>Teil des TOPO TA Klonierungskits</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pGL3-basische Luciferase mit Vektor</td><td>Promega</td><td>E1751</td><td></td></tr><tr><td>pRL-TK Renilla Luciferase exprimierender Vektor</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>Bakterielles künstliches Chromosom</td><td>BACPAC Resources Center, Kinder s Krankenhaus Oakland Research Institute, Oakland, CA</td><td>RP23-285A12 und RP24-314E24</td><td>http://bacpac.chori.org/clones.htm</td></tr><tr><td colspan="4">REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Wizard&reg; SV Gel und PCR Clean-Up System&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>Nützlich für die Reinigung von PCR-Produkten nach dem Aufschluss mit Restriktionsendonukleasen</td></tr><tr><td>CRYOVIALS</td><td>Denville Scientific</td><td>V9012<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">SOFTWARE:</td></tr><tr><td>Ensembl software</td><td>Ensembl Projekt</td><td>http://Ensembl.org&nbsp;</td><td>Das Projekt Ensembl erstellt Genomdatenbanken für Wirbeltiere und andere eukaryotische Arten und stellt diese Informationen online frei zur Verfügung.</td></tr><tr><td>Strahlsoftware</td><td>NCBI</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web& PAGE_TYPE=BlastHome</td><td></td></tr><tr><td>Primer 3 Software</td><td>Simgene</td><td>http://simgene.com/Primer3</td><td>Nützlich für das Entwerfen von Primern für 5'-RACE PCR</td></tr><tr><td>NCBI Nukleotiddatenbank</td><td>NCBI</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">CELL LINES:</td></tr><tr><td>TM4 murine Sertoli Zellen</td><td>ATCC, Manassas, Virginia</td><td>CRL-1715&trade;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">INSTRUMENTS:</td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Turner Biosystems</td><td>TD-20/20</td><td>Dies ist ein relativ preiswertes, manuell betriebenes Luminometer. Es sind auch automatisierte Systeme vom selben Hersteller erhältlich, die 96-Well-Platten verwenden.</td></tr><tr><td>NanoDrop Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific, Inc.</td><td>Das NanoDrop 2000</td><td>Spektralphotometer kann sehr kleine Probenmengen verwenden</td></tr><tr><td>DU 800 UV/VIS-Spektralphotometer und Software für die Nukleinsäureanalyse II</td><td>BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA</td><td>DU 800</td><td></td></tr></tbody></table>

methoden alternative promoter verwendung und transkriptions-verordnung von murine bcrp1 zu entdecken

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Genexpression in verschiedenen Geweben wird häufig durch alternative Promotoren gesteuert, die bei der Synthese der mRNA resultieren mit einzigartigen - in der Regel nicht-translatierten - erste Exons. Bcrp1 (ABCG2), der murine Ortholog des Protein ABC transporter Breast Cancer Resistance (BCRP, ABCG2) hat mindestens vier alternative Promotoren, die von den entsprechenden vier alternativen ersten Exons hergestellt bezeichnet sind: E1U, E1A, E1B und E1C. Hier in-silico - Protokolle werden vorgestellt für Bcrp1 alternative Promotor Gebrauch zu prognostizieren. Weiterhin sind, reporter Assayverfahren beschrieben Reporterkonstrukten für alternative Promotoren zu erzeugen, und die Funktionalität von putativen Promotoren stromaufwärts von den alternativen ersten Exons zu bestimmen, die gekennzeichnet sind.

Identifizierung von Bcrp 1 alternative Promotor Nutzung in Maus Hoden durch die Analyse der Leader - Exons Wenn die EST - Datenbank bei NCBI sondiert wurde (April 2015) , erläutert die Schritte unter Verwendung von in Protokoll 1, fanden die ESTs , die mit dem 5&#39; - Ende von Exon 2 in Bcrp 1 - mRNA sind in Tabelle ...

Mit dem murinen ABC transporter Bcrp1 (ABCG2) als Beispiel in-silico - Protokolle werden dargestellt , um alternative Promotor Gebrauch in Gene in Mausgeweben exprimiert erkennen und die Funktionalität der alternativen Promotoren unter Verwendung von Reporter - Assays identifiziert , zu bewerten.

Methoden Alternative Promoter Verwendung und Transkriptions-Verordnung von Murine Bcrp1 zu entdecken

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, alternative erste Exons in der mRNA eines Gens wie Bcrp1 nachzuweisen und Luciferase-basierte Reporterassays für die vermuteten Promotoren upstream der identifizierten alternativen ersten Exons zu etablieren. Die verwendeten in-silico-Methoden können helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Transkription und Regulation zu beantworten, beispielsweise wie die mRNA-Expression in verschiedenen Geweben reguliert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie öffentlich zugängliche genetische Daten nutzt, um alternative erste Exons in der mRNA des Gens von Interesse zu identifizieren, was auf eine alternative Promotorbenutzung hindeutet.Diese Methode, die Berichts-Konstrukte herstellt und Reporter-Assays durchführt, kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Genregulation zu beantworten, beispielsweise die funktionelle Aktivität eines vermuteten alternativen Promotors. Um dieses Verfahren zu beginnen, erhalten Sie die Sequenz für Exon 2 des Maus-Bcrp1, indem Sie die mRNA-Referenzsequenz-ID in das Suchfeld des Ensembl-Genombrowsers eingeben und auf „Go“ klicken. Wählen Sie anschließend eine vollständige Sequenz aus, die 16 Exons enthält. Klicken Sie auf die Option „Download sequence“.Danach das FASTA-Format auswählen und auf Vorschau klicken. Im nächsten Bildschirm die Vorschaureihenfolge von Exon 2 in die Zwischenablage kopieren. Zur Blast-Homepage auf der NCBI-Website navigieren.Wählen Sie das Mausgenom aus. Fügen Sie die Sequenz von Exon 2 aus der Zwischenablage in das Abfragefeld ein. Danach wählen Sie ESTs aus dem Dropdown-Menü Datenbank aus.Optimieren Sie es für stark ähnliche Sequenzen und wählen Sie dann BLAST. Wenn der BLAST-Lauf abgeschlossen ist, erscheint die Ergebnisseite. Wählen Sie im Abschnitt „Beschreibungen“ der Ergebnisseite „Alle“, dann „Herunterladen“, anschließend „FASTA“ im Dropdown-Menü und danach „Weiter“.Eine TXT-Datei wird angezeigt. Öffnen und kopieren Sie die gesamte Datei in die Zwischenablage. Um die Position der EST-Sequenz zu identifizieren, die am 5'-Ende vor Exon 2 im Bcrp1-Gen liegt, wählen Sie auf der BLAST-Startseite unter dem Untertitel Spezialisierte BLAST die Option Zwei Sequenzen mit BLAST ausrichten.Fügen Sie die Textdatei aus der Zwischenablage in das Abfragefeld ein und geben Sie 372099104 in das Feld „Subject Sequence“ ein. Optimieren Sie die Suche für „Highly similar sequences“ unter „Program Selection“ und führen Sie BLAST aus. Sobald das Ergebnisfenster erscheint, zeigen Sie die Alignments grafisch an, indem Sie im Alignments-Fenster auf „Graphics“ klicken.Verwenden Sie die rechte und linke Pfeiltaste sowie die Zoomfunktion, um sich auf Bcrp1/ABCG2 und die Sequenzalignierungen zu konzentrieren. Speichern Sie anschließend die Sequenzalignierungen, indem Sie Alle im Feld Beschreibungen auswählen. Wählen Sie im Dropdown-Menü Herunterladen die Option Treffer-Tabelle und klicken Sie dann auf Weiter.Da die Position des 5'-Endes von Exon 2 dem Nukleotid 58.655.638 im Chromosom-6-Contig entspricht, wird diese als Plus eins bezeichnet, und anschließend werden die Positionen der teilweisen Sequenzen jedes EST upstream von 58.655.638 berechnet. Ein kritischer Schritt dieses Verfahrens ist die Vorhersage mehrerer erster Exons. Die alternativen Promotoren werden hierdurch identifiziert.Unter Verwendung der Sequenz von E1U, die aus der EST-Datenbank erhalten wurde, definieren Sie das erste 5'-Nukleotid von E1U als Plus Eins. Gewinnen Sie einen Back-Clone des Maus-Chromosoms sechs, der die Bcrp1/ABCG2-Gensequenz sowie die Sequenz von mindestens 100 Kilobasen upstream des Bcrp1/ABCG2-Gens enthält. Identifizieren Sie anschließend einen geeigneten Reportervektor, beispielsweise das Luciferase-Reporterkonstrukt pGL3-Basic.Bestimmen Sie die Mehrfachklonierungsstellen im Reportervektor. KpnI, SacI, MluI, NheI, SmaI, XhoI, BglII und HindIII sind die Restriktionsendonuklease-Stellen in der Mehrfachklonierungsstelle des pGL3-Basic-Vektors in der 5'-nach-3'-Orientierung. Wählen Sie anschließend den zwei Kilobasen langen Bereich upstream des E1U-Exons aus und fügen Sie die Sequenz in DNA5 ein, gefolgt vom Ausführen des Programms.Die Einzel- und Mehrfachverdauungsstellen werden angezeigt. Danach vergleichen Sie die Liste der Verdauungsstellen im E1U-Bereich mit der MCS des pGL3-Basic-Vektors in einer Excel-Tabelle. Bereiten Sie anschließend Vorwärts- und Rückwärtsprimer für die PCR vor, die Restriktionsendonuklease-Stellen enthalten, und verwenden Sie hierfür kommerzielle Gen-Primer-Syntheseleistungen oder Primer-Auswahlsoftware.Wählen Sie einen Vorwärtsprimer, der sich etwa zwei Kilobasen upstream der E1U-Sequenz befindet, und einen Rückwärtsprimer innerhalb der E1U-Sequenz. Amplifizieren Sie anschließend den E1U-Genomabschnitt mit diesen Primern unter Verwendung von 0,01 bis einem Mikrogramm Bak und PCR-Master-Mix, der eine hochfidelige Taq-Polymerase enthält. Überprüfen Sie danach die Länge des amplifizierten PCR-Produkts, indem Sie es mit einer 1-Kilobasen-DNA-Leiter über eine 0,8 %ige TAE-Agarose-Gelelektrophorese vergleichen.Anschließend das gewonnene PCR-Produkt und den pGL3-Basic-Vektor mit Restriktionsendonukleasen digerieren, die spezifisch für die in die Vorwärts- und Rückwärtsprimer eingeführten Restriktionsstelle sind. Danach die Digerierung des PCR-Produkts mittels Agarose-Gelelektrophorese überprüfen. Das digerierte Vektor-DNA und das zwei Kilobasen lange PCR-Band aus dem Agarosegel ausschneiden.Als Nächstes extrahieren Sie die geschnittene Vektor-DNA und das zwei Kilobasen lange PCR-Band aus den Gel-Stücken mithilfe eines kommerziellen SV-Gel- und PCR-Reinigungs-Kits. Messen Sie die Konzentration des gereinigten PCR-Produkts und des gereinigten Vektors mittels UV-Spektrometrie. Bereiten Sie anschließend den E1U-Reporter-Konstrukt vor, indem Sie das gereinigte, mit Restriktionsenzym geschnittene PCR-Produkt und den pGL3-Basic-Feuerfaden-Luciferase-Reporter-Vektor unter Verwendung des T4-DNA-Ligase-Schnell-Ligations-Kits ligieren, wodurch der E1U-Reporter-Konstrukt mit dem Namen pGL3 E1U entsteht.Kultivieren Sie in diesem Schritt die TM4-Zellen in 24-Loch-Platten mit einer anfänglichen Dichte von 200.000 Zellen pro Loch. Sechs Stunden nach der Inokulation der Zellen transfectieren Sie diese mit 0,2 Mikrogramm MP pGL3-Basic-Vektor oder 0,2 Mikrogramm pGL3-Vektor zusammen mit vier Nanogramm pRL-TK als interne Kontrolle. Dreißig Stunden nach der Transfektion entfernen Sie das Wachstumsmedium von den transfizierten Zellen.Waschen Sie die Zellen mit PBS und entfernen Sie danach die Waschlösung. Messen Sie anschließend die Aktivität von Firefly- und Renilla-Luciferase mithilfe eines kommerziellen Kits. Geben Sie die Aktivität für jedes Reaktionsgefäß als Verhältnis der Firefly-Luciferase-Aktivität zur internen Kontrolle an.Dieser Schritt bestätigt die funktionelle Aktivität des testisspezifischen Promotors. Dargestellt ist der Reportergen-Assay für die Bcrp1-Promotoren E1U, E1A, E1B und E1C in Bulben, die vollständig aus TM4-Zellen stammen. Die Daten werden als Lumineszenz der Feuerfliegen-Luciferase angegeben, normiert auf die Renilla-Luciferase.Das Sternchen kennzeichnet einen signifikanten Unterschied gegenüber der MP pGL3 Vektor-Kontrolle. Dieses Diagramm zeigt die Auswirkungen einer Mutation des SF-1-Response-Elements im Bcrp1 E1U-Luciferase-Reporterkonstrukt auf die Luciferase-Aktivität. Bcrp1-Reporterkonstrukte mit einer putativen SF-1-Bindungsregion wurden in TM4-Zellen transfiziert, und zwar mit und ohne erzwungene Expression von SF-1. In der Abbildung steht a für einen signifikanten Unterschied gegenüber dem leeren Vektor pGL3-Kontrolle; b kennzeichnet einen statistisch signifikanten Unterschied im Vergleich zum E1U-Promotorkonstrukt in den mit dem Vektor transfizierten Zellen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, eine geeignete Zelllinie für den Reporterassay auszuwählen. Die Zelllinie sollte das Gen von Interesse unter der Kontrolle des Promotors im Reporterkonstrukt exprimieren.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die quantitative RT-PCR durchgeführt werden, um die Bewertung der alternativen Promotorverwendung in mehreren Gewebeproben zu erleichtern. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Verwendung alternativer Promotoren für ein Gen Ihrer Wahl vorhergesagt und die Funktionalität dieses Promotors bestimmt werden kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier präsentieren wir eine Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) Verfahren zur genomweiten Ort Analyse von Protein-Isoformen, die in einer Histon-bindende Domäne unterscheiden. Wir wenden es ChIP-Seq-Analyse, um die Ziele des KDM5A/JARID1A/RBP2 Histon-Demethylase zu identifizieren.

Genomweite Analyse mittels ChIP zu Isoform-spezifische Gene-Targets zu identifizieren

Der genetische Reporter-Assay ist ein gut etabliertes und leistungsfähiges Werkzeug, um die Beziehung zwischen DNA-Sequenzen und ihren genregulatorischen Aktivitäten zu entschlüsseln. Die Kopplung von regulatorischen Elementkandidaten an Reportergene, die identifizierende Sequenz-Tags tragen, ermöglicht eine massive Parallelisierung dieser Assays.

Massively Parallel Reporter Assays in kultivierte Säugerzellen

Die hier beschriebene Methode wird verwendet, um die apoptotische Signalkaskade in definierten Schritten zu induzieren, um die Aktivität eines anti-apoptotischen bakteriellen Effektorproteins zu entschlüsseln. Diese Methode kann auch zur induzierbaren Expression von pro-apoptotischen oder toxischen Proteinen oder zur Störung von Interferenzen mit anderen Signalwegen verwendet werden.

Anlegen eines induzierbaren Expression System zu Störungen der bakteriellen Virulenzfaktoren mit Intrazelluläre Signal Studieren

DNA-regulatorische Elementen, wie z. B. Enhancer, Steuern Genexpression durch Kontaktaufnahme mit körperlich Ziel Gen Promotoren, oft durch weiträumige chromosomalen Interaktionen über genomische Entfernungen. Promotor erfassen Hi-C (PCHi-C) identifiziert signifikante Wechselwirkungen zwischen Promotoren und distalen Regionen ermöglicht die Zuordnung von möglichen regulatorischen Sequenzen, deren Zielgene.

Promotor Capture Hallo-c: Hochauflösende, genomweite Profilierung der Promoter Interaktionen

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Dominant-negativen induzierbaren System zu entwickeln, in der kein Protein bedingt inaktiviert durch reversibel überexprimiert eine Dominant-negativen mutierte Version davon.

Induzierbaren und Reversible Dominant-Negative (DN) Protein Hemmung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für effiziente Chromatin Immunopräzipitation (ChIP), gefolgt von Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung (ChIP-Seq) von braunen Fettgewebe (BAT) isoliert von einer Maus. Dieses Protokoll eignet sich für sowohl mapping Histon Änderungen und genomweite Lokalisierung von Histonproteine von Interesse in Vivozu untersuchen.

Chromatin Immunopräzipitation der murinen braunen Fettgewebe

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte erforderlich, um ein Modellsystem, in dem die Transkription des endogenen Gens von Interesse bedingt gesteuert werden kann, in lebenden Tieren oder Zellen mit verstärkten Lac Repressor und/oder Tet Aktivator Systeme generieren.

In-vivo Anwendung der REMOTE-Steuerung für die Manipulation von endogenen Genexpression

Die direkte Lieferung von vormontierten Cas9/Guide-RNA-Ribonukleoprotein-Komplexen ist ein schnelles und effizientes Mittel zur Genombearbeitung in hämatopoetischen Zellen. Hier nutzen wir diesen Ansatz, um einen RUNX1 intronic Schalldämpfer zu löschen und die Transkriptionsreaktionen in OCI-AML3-Leukämischen Zellen zu untersuchen.

Untersuchung der Transkriptionsrolle eines RUNX1 Intronic Schalldämpfers durch CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in akuten myeloischen Leukämiezellen

Hier beschreiben wir eine Methode zur retroviralen Überexpression und Adoptivübertragung von murinen B-1a-Zellen zur Untersuchung der in vivo B-1a-Zellmigration und -lokalisierung. Dieses Protokoll kann für verschiedene nachgelagerte funktionelle Assays erweitert werden, einschließlich der Quantifizierung der Spender-B-1a-Zelllokalisierung oder der Analyse von spenderzellabgeleiteten sekretierten Faktoren nach der Übertragung.

Retrovirale Überexpression von CXCR4 auf murine B-1a-Zellen und Adoptivtransfer für gezielte B-1a-Zellmigration zur Knochenmark- und IgM-Produktion

Die Genexpression wird durch Wechselwirkungen von Genpromotoren mit distalen regulatorischen Elementen reguliert. In dieser Arbeit beschreiben wir, wie Low Input Capture Hi-C (liCHi-C) die Identifizierung dieser Interaktionen in seltenen Zelltypen ermöglicht, die bisher nicht messbar waren.

Ein integrierter Workflow zur Untersuchung der Promotor-zentrierten raum-zeitlichen Genomarchitektur in seltenen Zellpopulationen

Lernen Sie alternative Promotornutzung und Transkriptionsregulation von murinem Bcrp1 mit In-silico-Methoden und Luciferase-Reporter-Assays. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung funktionaler Promotoren in verschiedenen Geweben.

Methoden Alternative Promoter Verwendung und Transkriptions-Verordnung von Murine Bcrp1 zu entdecken

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