Name: Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von Neutrophilen aus menschlichem Blut mittels Dichtegradientenzentrifugation zur Untersuchung ihrer Rolle bei der Empfindlichkeit von Lymphomzellen gegenüber Krebstherapien.

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Diese Arbeit wurde vom Institute National du Cancer (INCa-DGOS-4664) unterstützt.

1. Neutrophilen-Isolierung und Co-Kultur mit primären leukämischen Zellen HINWEIS: Die Verfahren wurden im Rahmen der Genehmigung von Lyon Krankenhaus Ethikkommission bei allen Patienten durchgeführt, informierte Zustimmung zu unterzeichnen. <ol><li> Isolierung von primären leukämischen Zellen und Neutrophile <ol><li> Sammeln Sie Rohre aus dem peripheren Blut auf EDTA (1,8 mg EDTA pro Milliliter Blut) von Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie diagnostiziert (CLL). </li><li> Ist jeweils mit 15 ml Blut in einen sterilen 50 ml-Röhrchen und verdünnt mit 15 ml RPMI (Verdünnung 1: 1), dann vorsichtig und langsam 15 ml Dichtegradient-Lösung auf den Boden des Rohres, ohne die Phasen zu vermischen. Sicherzustellen, dass der Dichtegradient-Lösung bei RT für die Zubereitung ist. </li><li> Zentrifuge bei 300 × g für 35 min bei RT ohne Bremse. Das Blut sollte in vier verschiedene Phasen trennen , wie in Figur 1A von oben nach unten gezeigt: Thrombozyten und Plasma, mononukleäre Zellen (white Ring), Dichtegradientenlösung, Granulozyten und Erythrozyten. </li><li> Sammeln Sie den weißen Ring, der die primären leukämischen Zellen mit einer Kunststoff-Pasteur-Pipette und an einem neuen 50-ml-Tube darstellt. <ol><li> Das Rohr wird mit PBS (enthält Calcium und Magnesium) bis zu 50 ml in total und Zentrifuge bei 300 g für 10 min bei RT. </li><li> bis zu 50 ml in total und Zentrifuge bei 300 g für 10 min bei RT das Pellet mit 5 ml PBS dann PBS hinzu. </li><li> Das Pellet mit komplettem RPMI-Medium (RPMI 1640 mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM Glutamin, 100 U / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin) zum Zählen der Lebensfähigkeit der Zellen-Zähler verwendet wird. </li></ol></li><li> Aspirieren die oberen Phasen der Granulozyten und Erythrozyten-Phase verlassen und PBS summieren sich zu 25 ml dann 3% Dextran in 0,9% NaClup in insgesamt 50 ml hinzu. Mischen Sie die Röhrchen 10 Mal und halten sie für 30 min bei RT ohne sich zu vermischen. </li><li> Sammeln Sie die obere RBC-armen Neutrophilen Schicht eind sie in ein sauberes steriles 50 ml Röhrchen platzieren und die Röhrchen bei 300 g für 10 min bei RT zentrifugiert. bis zu 50 ml insgesamt resuspendieren jedes Pellet mit 5 ml PBS dann Puffer Lyse der Erythrozyten hinzufügen. </li><li> Halten der Rohre in Dunkelheit für 15 min bei RT, dann bei 500 g für 10 min bei RT zentrifugiert. Waschen Sie die Pellets mit PBS (add PBS bis zu 50 ml insgesamt) bei 500 g zentrifugiert werden für 10 min bei RT. </li><li> Resuspendieren der Pellets mit komplettem RPMI-Medium zum Zählen der Lebensfähigkeit der Zellen Zähler verwendet wird. Halten Sie 3 x 10 5 jeder Zelltyp in 50 ul PBS-FBS (4%) in 5 ml Kunststoffröhrchen , die Reinheit ihrer Isolation zu bestimmen , mittels Durchflusszytometrie. </li></ol></li><li> Analysieren Sie die Morphologische Einsätze der isolierten Zellpopulationen <ol><li> Dazu resuspendieren je 3 x 10 4 Neutrophilen und 3 x 10 4 mononukleären Zellen in 150 &amp; mgr; l komplettes RPMI Medium. Montieren Sie die Glasobjektträger, Filterkarten und Probenkammern in der Cytospin Zentrifuge, um sicherzustellen, dass ter Zentrifuge ist gut ausbalanciert. </li><li> Platzieren Sie jede Zelltyp in die Probenkammer und Zyto-Zentrifuge bei 750 × g für 10 min bei RT Entfernen Sie die Folien, Filterkarten und Probenkammern aus der Zentrifuge. Disassemblieren vorsichtig, um nicht die Zellen auf dem Objektträger zu beschädigen. Entsorgen Filterkarten und Probenkammern. </li><li> Stain die Zellen mit Giemsa-Kit und halten Sie die Folien für 1 Stunde trocknen lassen. Untersuchen Sie die Zellen unter dem Mikroskop mit 100-facher Vergrößerung. </li></ol></li><li> Testen Sie die Reinheit der isolierten Zellen durch FACS <ol><li> Beschriften der isolierten primären leukämischen Zellen , die mit anti-human CD19 - Antikörper , konjugiert an APC (5 &amp; mgr; l / 10 6 Zellen). Beschriften der gereinigten Neutrophilen mit einer Mischung aus anti-human - Antikörper aufgelistet in Tabelle 1 (5 &amp; mgr; l / 10 6 Zellen). Inkubieren der Zellen in Dunkelheit für 30 min bei 4 o C. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit 500 ul PBS-FBS (4%) der Zentrifuge die Röhrchen bei 300 g für 5 min bei RT. </li><li>Resuspendieren jedes Pellet in 200 &amp; mgr; l PBS-FBS (4%). </li><li> Analysieren Sie mit einem Durchflusszytometer, mit dem folgenden optischen Konfiguration: 488-nm-Laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP ), PE (575/26 BP); 633-nm-Laser: APC (660/20 BP), APC-Cy7 (780/60 BP). Sicherstellen, dass die Farbkompensation. </li></ol></li><li> Cokultur von primären leukämischen Zellen mit Autologe Neutrophile <ol><li> Seed 2 x 10 5 Zellen / ml der primären leukämischen Zellen allein oder mit autologem Neutrophilen im Verhältnis 1:10 in komplettem RPMI - Medium. Dazu Zellzahlen durch Verdünnen von Zellsuspensionen einzustellen und mit 2 x 10 5 Zellen / ml der primären leukämischen Zellen zu 2 x 10 6 Zellen / ml Neutrophilen. Vorsichtig mischen. </li><li> Zugeben von 25 &amp; mgr; M Bruton-Tyrosinkinase (Btk) -Inhibitor (Ibrutinib) zu den Zellen. Inkubieren für 24 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol></li><li> Zellernte und FACS Analyse <ol><li> Collect die Zellen in 5 ml Kunststoffröhrchen für die FACS-Analyse und zentrifugiert bei 300 g für 5 min bei RT die Rohre. Waschen der Pellets mit 1 ml PBS-FBS (4%), dann bei 300 g für 5 min bei RT zentrifugiert. </li><li> Resuspendieren Pellets in Annexin V und PI kommerziellen Kits und die Zellen in Dunkelheit für 10 min bei RT inkubiert. Analysieren Sie mit einem Durchflusszytometer die Gating - Strategie von 2A mit und der folgenden optischen Konfiguration: 488 - nm - Laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP). Sicherstellen, dass die Farbkompensation. </li></ol></li></ol> 2. Differenzierung von HL60-Zellen entlang der Granulozytäre Pathway und ihre Cokultur mit RL-Lymphom B-Zellen in 3D-Modell <ol><li> Differenzierung von humanen promyelocytic (HL60) Zellen in Neutrophilen-ähnliche Zellen <ol><li> Einstellen HL60 Zellzahl bis 3 x 10 5 Zellen / ml fügen Sie dann 1 uM Retinsäure (RA) und 1,25% DMSO deren Differenzierung zu induzieren. Samen je 3 x 10 5 </sup&gt; HL 60 Zellen pro Vertiefung in 48-Well - Platte dann mit 5% CO 2 bei 37 ° C für 48 Stunden inkubiert. </li><li> Später wurden die Zellen und Zentrifuge bei 300 g für 5 min bei RT sammeln. Resuspendieren der Zellen mit komplettem RPMI-Medium zum Zählen der Lebensfähigkeit der Zellen Zähler verwendet wird. </li><li> Dann Zellsuspension in komplettem RPMI - Medium verdünnt auf HL60 Zellzahl bis 3 x 10 5 Zellen / ml und induzieren wieder ihre Differenzierung durch Zugabe von 1 &amp; mgr; M Retinsäure (RA) und 1,25% DMSO einzustellen. Samen je 3 x 10 5 HL60 - Zellen pro Well in 48-Well - Platte und Inkubation für weitere 48 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol></li><li> Analyse von HL60 Differenzierung (HL60 diff) <ol><li> Sammeln Sie die Zellen und Zentrifugieren der Röhrchen bei 300 g für 5 min bei RT. Das Pellet mit komplettem RPMI-Medium zum Zählen der Lebensfähigkeit der Zellen Zähler verwendet wird. </li><li> Um die Änderungen in der Zelloberflächenmarker-Expression mittels Durchflusszytometrie analysiert. Legen Sie jedes 3 x 10 5 </sup&gt; undifferenzierte HL60 - Zellen (aus der Zellkultur) und 3 x 10 5 Zellen HL60 diff in 5 ml Kunststoffröhrchen für die FACS - Analyse und zentrifugieren die Röhrchen bei 300 g für 5 min bei RT. </li><li> Resuspendieren der Pellets in 50 &amp; mgr; l PBS-FBS (4%). Beschriften der Zellen mit anti-Mensch - CD11b konjugiert AF700 oder anti-human CD38 , konjugiert an APC (5 &amp; mgr; l / 10 6 Zellen). Inkubieren der Zellen in Dunkelheit für 30 min bei 4 o C. </li><li> Waschen mit 500 ul PBS-FBS (4%), dann bei 300 g für 5 min bei RT zentrifugiert. Resuspendieren der Pellets in 200 ul PBS-FBS (4%). </li><li> Analysieren Sie auf Durchflusszytometer mit der Gating - Strategie von 3A und die folgende optische Konfiguration: 488 - nm - Laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP); 633-nm-Laser: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP). </li><li> Um die morphologischen Veränderungen in HL60 diff zu testen, zu immobilisieren , die Zellen auf Glasobjektträger für die mikroskopische Untersuchung. <ol><li> Um dies zu tun, resuspendieren jedes 3 x 10 <sup&gt; 4 undifferenzierte HL60 - Zellen (aus Zellkultur) und 3 x 10 4 HL60 diff in 150 ul komplettem RPMI Medium. Montieren Sie die Glasobjektträger, Filterkarten und Probenkammern in der Cytospin Zentrifuge, um sicherzustellen, dass die Zentrifuge ausgeglichen ist. </li><li> Platzieren Sie jede Zelltyp in die Probenkammer und Zyto-Zentrifuge bei 1500 Umdrehungen pro Minute für 10 Minuten bei RT. Entfernen Sie die Folien, Filterkarten und Probenkammern aus der Zentrifuge. Disassemblieren vorsichtig, um nicht die Zellen auf dem Objektträger zu beschädigen. Entsorgen Filterkarten und Probenkammern. </li><li> Stain die Zellen mit Giemsa-Kit und halten Sie die Folien für 1 Stunde trocknen lassen. Untersuchen Sie die Zellen unter dem Mikroskop mit 100-facher Vergrößerung. </li></ol></li></ol></li><li> 3-dimensionale (3D) Kultur HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Materialien, die in diesem Experiment verwendet werden, sind kalt und das Experiment auf Eis stattfindet. <ol><li> Resuspendieren je 5 x 10 4 RL - Zellen, entweder allein oder mit HL60 diff gemischt </em&gt; Im Verhältnis RL: HL60 diff 1:10 mit 300 Matrix ul Basalmembran 1 ml Pipettenspitze mit einer sterilen Schere , um die Öffnung zu etwa 2 bis 3 mm zu erweitern geschnitten werden. Vermeiden Blasen während dieses Schritts. </li><li> Samen je 300 ul Zellsuspension / Well in 24-Well-Platte. Vermeiden Blasen während dieses Schritts. Die Platte für 30 Minuten bei 37 ° C mit 5% CO 2 dann 1 addieren ml RPMI - Medium für jede Vertiefung und Inkubation für 7 Tage bei 37 ° C mit 5% CO 2 abzuschließen. Ändern Sie das Medium alle zwei Tage. In 10 nM Vincristin am Tag 5. </li></ol></li><li> FACS - Analyse <ol><li> Nach 7 Tagen Kultur absaugen Medium und waschen Sie jede Vertiefung mit 1 ml eiskaltem PBS zweimal. 3 ml / Vertiefung von eiskaltem PBS-EDTA (5 mM). Nehmen Sie das Gel aus dem Boden des Bohrlochs durch Abkratzen der Unterseite von 200 ul Pipettenspitze. Schütteln Sie die Platte vorsichtig auf Eis für 30 min. </li><li> Übertragen Zellsuspension in sterile 15-ml-Röhrchen und schütteln die Röhrchen sanft auf ice für weitere 30 min. Überprüfen Sie, ob das Auftreten von homogenen Zellsuspension. (Wenn es nicht der Fall ist, dann schütteln die Zellen für längere Zeit oder mehr hinzufügen PBS-EDTA). </li><li> Zentrifugiere die Röhrchen bei 300 xg für 10 min bei RT. Waschen Sie die Pellets mit PBS dann bei 300 g für 10 min bei RT zentrifugiert werden. </li><li> Resuspendieren mit PBS-FBS (4%) und Etikett mit anti-human - CD19 - Antikörper an PE-Cy7 konjugiert und Anti-Human - CD38 - Antikörper konjugiert an APC (5 &amp; mgr; l / 10 6 Zellen). In dunklen Inkubieren für 30 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Waschen mit 500 ul PBS-FBS (4%), dann Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 5 min bei RT. Resuspendieren der Zellen mit Annexin V und PI kommerziellen Kits. </li><li> Analysieren Sie auf Durchflusszytometer mit der Gating - Strategie von 4A und die folgende optische Konfiguration: 488 - nm - Laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633-nm-Laser: APC (660/20 BP). Sicherstellen, dass die Farbkompensation. </li></ol></li&gt; </ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier beschrieben, eine wirksame, einfach, schnell und preiswert Protokoll zur Isolierung von Neutrophilen aus menschlichem Blut mit hoher Reinheit Dichtegradientenzentrifugation Ansatzes und innerhalb der gleichen Schritt mononukleären Zellen werden ebenfalls abgetrennt und gewonnen. Die isolierten Zellpopulationen sind ≥90% rein. Es sind mehrere Verfahren für neutrophile Isolierung aus menschlichem Blut zur Verfügung. Diese umfassen ähnliche Verfahren unter Verwendung von diskontinuierliche...

Angeborene Immunzellen bilden einen wesentlichen Teil der Zellen innerhalb der Tumor - Mikroumgebung und wurden mit Tumor Malignität in Patienten und Tiermodellen von Krebs 1 verbunden. Vor kurzem hat es sehr geschätzt werden , dass eine chronische Immunreaktionen eine entscheidende Rolle bei der Förderung der Tumorprogression, Metastasierung und Resistenz gegen Chemotherapien 2 spielen. Makrophagen sind wichtige angeborenen Immunzellen , die direkt gezeigt worden ist, um Tumorzellantwort auf Chemotherapie 3,4 regulieren. Allerdings ist die Rolle der Neutrophilen, wichtige Akteure in der angeborenen Immunsystems, bei der Regulierung der Tumor Reaktion auf Anti-Krebs-Behandlung nicht bekannt. Die Ziele dieser Protokolle sind eine schnelle und glaubwürdige Methode zu verwenden Neutrophilen von CLL Patienten Blutproben zu trennen und HL60-Zellen entlang der granulocytic Weg, um ihre Rolle zu unterscheiden bei der Regulierung der Empfindlichkeit von Lymphomzellen zu Anti-Lymphom-Agenten zu studieren. 5 und wirken als erste Verteidigungslinie gegen Mikroorganismen 6 eindringen. Neutrophile haben eine wesentliche Rolle 7 wirksam angeborenen Immunantwort zusätzlich zu den variablen Effektor - Funktionen in verschiedenen pathologischen Zuständen in steigenden. Daher ist eine schnelle und glaubwürdige Methode Neutrophile von anderen Blutzellen, wie Dichtegradient - Trennverfahren zu isolieren, ist für in vitro - Studien erforderlich. Unter Verwendung dieses Verfahrens zur Isolierung von Neutrophilen erleichtert die weitere Forschung auf Neutrophilen-vermittelten immunologischen Funktionen in vivo und ex vivo. Die Fähigkeit , reine Populationen von Neutrophilen zu erhalten , ist ein wichtiger erster Schritt für die Untersuchung von Patienten mit immunologischen Erkrankungen 8. Dichtegradienten-Trennungsverfahren ist ein ideales Verfahren, bei dem eine hohe Ausbeute an Zellen erhalten wird. Die method beinhaltet die Zugabe von Dichtegradient-Lösung in den Boden eines Röhrchens verdünnten Humanblut durch Zentrifugation für 35 min bei 300 g ohne Bruch enthält, gefolgt. Der Ring der einkernigen Zellen erscheint an der Schnittstelle und die Neutrophilen liegen unterhalb des ersteren. Diese Verfahren haben erhebliche Vorteile gegenüber anderen verfügbaren Verfahren, wie Neutrophilen - Isolierungs - Kits , die 9 viel teurer sind. Zusätzlich Neutrophilen aus menschlichem Blut durch kommerzielle Kits unter Verwendung von Antikörpern, die an einen Oberflächenmarker spezifisch für humane Neutrophile, erhöhen das Risiko von Zell-Aktivierung oder Differenzierung zu isolieren. Dichtegradienten Trennungsverfahren erlaubt die Isolierung von neutrophilen Granulozyten innerhalb eines kurzen Zeitraums. Innerhalb der gleichen Schritt werden mononukleäre Zellen ebenfalls abgetrennt und gewonnen. Es ist eine grundlegende Technik, bei dem eine hohe Ausbeute an reinen Zellen, um erhaltene funktionelle Integrität zu erzielen. Um den Tumor microenv zu imitierenironment wurden 3D-Experimente durchgeführt. In Anbetracht der kurzen Halbwertszeit von Neutrophilen in vitro, sind die 3D - Experimente mit frischen menschlichen Neutrophilen nicht schlüssig. Dimethylsulfoxid (DMSO) und Retinsäure (RA) mit Hilfe der Differenzierungsinduktoren Aus diesem Grund promyelocytic (HL60-Zellen) induziert in Neutrophilen-ähnliche Zellen zu differenzieren. Mit differenzierten HL60 - Zellen (HL60 diff) wird verhindert , dass unterschiedliche Reaktionen von Neutrophilen, die aufgrund Isolierung von verschiedenen Spendern. In - vitro - 3D - Kulturmodelle stellen eine Zwischenstufe zwischen In - vitro - 2D - Modelle und in vivo Modellen. Im 2D-Kultur, breiteten sich die Zellen auf Kunststoff-Oberfläche unnatürliche Zelle Anhänge abgeschiedenen Proteine ​​bilden, die auf dieser synthetischen Oberfläche denaturiert werden. Umgekehrt können die Zellen in 3D-Kulturform natürliche Zell-Zell-Anlagen, da die Zellen und die extrazelluläre Matrix synthetisieren sie das natürliche Material, an dem sie angebracht sind.Aus diesem Grund 3D Kokultur Modellen, insbesondere zwischen Krebszellen und anderen Zelltypen, ist der Beitrag zu Tumorwachstum, Angiogenese und Metastasierung sehr nützlich für die Anzeige. Als Ergebnis machen 3D - Kulturen die Zellkultur , die physiologischen Bedingungen nachahmen , die mit 10 in vivo existieren.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640&nbsp;</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS enthält Calcium und Magnesium)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetyl-L-alanyl-L-glutamin (L-Glutamin)</td><td>Lebenstechnologien</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (Pen-Streptomycin)</td><td>Lebenstechnologien</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Bruton-Tyrosinkinase (Btk)-Hemmer (Ibrutinib)</td><td>CliniSciences</td><td>A3001</td><td></td></tr><tr><td>Vincristine&nbsp;</td><td>EG labo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel Basalmembran-Matrix&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Über Nacht (O/N) vor dem Tag des Experiments auf 4 oC</td></tr> setzen.<tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll (Pancoll)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-60500</td><td></td></tr><tr><td>Dextran&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Retinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Euromedex</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Anhang-V-FLOUS-Färbeset&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11&nbsp; 988&nbsp; 549&nbsp; 001</td><td></td></tr><tr><td>Kit RAL 555 Modifiziertes Giemsa Färbekit</td><td>Cosmos Biomedical</td><td>CB361550-0000</td><td></td></tr><tr><td>LSRII Durchflusszytometrie</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zytozentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMR-XA Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter</td><td>Nexcelom&nbsp; Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

neutrophilen-isolierung und analyse zur bestimmung ihrer rolle in der lymphom-zellempfindlichkeit therapeutische mittel

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophile sind die am häufigsten vorkommende (40% bis 75%) Art von weißen Blutkörperchen und gehören zu den ersten Entzündungszellen, die zum Ort der Entzündung wandern. Sie sind wichtige Akteure im angeborenen Immunsystem und spielen eine wichtige Rolle in der Krebsbiologie. Neutrophile wurden als Schlüsselmediatoren der malignen Transformation, der Tumorprogression, der Angiogenese und bei der Modulation der Antitumorimmunität vorgeschlagen; durch ihre Freisetzung löslicher Faktoren oder ihre Wechselwirkung mit Tumorzellen. Um die spezifischen Funktionen von Neutrophilen zu charakterisieren, ist eine schnelle und zuverlässige Methode für die in vitro Isolierung von Neutrophilen aus menschlichem Blut begehrt. Hier wird eine Dichtegradienten-Trennungsmethode demonstriert, mit der sowohl neutrophile als auch mononukleäre Zellen aus dem Blut isoliert werden können. Das Verfahren besteht darin, die Dichtegradientenlösung wie Ficoll sorgfältig über das verdünnte Blut von Patienten zu schichten, bei denen chronische lymphatische Leukämie (CLL) diagnostiziert wurde, gefolgt von einer Zentrifugation, Isolierung der mononukleären Schicht, Trennung von Neutrophilen von Erythrozyten durch Dextran und anschließender Lyse der verbleibenden Erythrozyten. Es hat sich gezeigt, dass mit dieser Methode Neutrophile ≥ einer Reinheit von 90 % isoliert werden können. Um die Mikroumgebung des Tumors nachzuahmen, wurden 3-dimensionale (3D) Experimente mit Basalmembranmatrix wie Matrigel durchgeführt. Aufgrund der kurzen Halbwertszeit von Neutrophilen in vitro können keine 3D-Experimente mit frischen humanen Neutrophilen durchgeführt werden. Aus diesem Grund werden promyelozytäre HL60-Zellen entlang des granulozytären Weges mit den Differenzierungsinduktoren Dimethylsulfoxid (DMSO) und Retinsäure (RA) differenziert. Das Ziel unserer Experimente ist es, die Rolle von Neutrophilen auf die Empfindlichkeit von Lymphomzellen gegenüber Anti-Lymphom-Wirkstoffen zu untersuchen. Diese Methoden können jedoch verallgemeinert werden, um die Wechselwirkungen von Neutrophilen oder neutrophilenähnlichen Zellen mit einer Vielzahl von Zelltypen in verschiedenen Situationen zu untersuchen.

Dichtegradiententrennung hier beschriebenen Verfahren liefert primären leukämischen Zellen und unstimulierte aus dem Blut von CLL - Patienten isoliert Neutrophilen 1A die verschiedenen Blutschichten nach Dichtegradientenzentrifugation (von oben nach unten darstellt , die erhalten. Blutplättchen und Plasma, weißen Ring der einkernigen Zellen darstellt, Dichtegradientenlösung, Granulozyten und Erythrozyten). 1B und 1C zeigen die Unterschiede in den morphol...

Neutrophile sind die am häufigsten vorkommende Art von weißen Blutkörperchen. Die Isolierung von Neutrophilen aus menschlichem Blut durch die Dichtegradiententrennungsmethode und die Differenzierung von humanen promyelozytären (HL60) Zellen entlang des granulozytären Weges werden hier beschrieben; ihre Rolle bei der Empfindlichkeit von Lymphomzellen gegenüber Anti-Lymphom-Wirkstoffen zu testen.

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren besteht darin, hochreine neutrophile Granulozyten aus menschlichen Blutproben mithilfe einer Dichtegradientenzentrifugation schnell zu isolieren, um deren Rolle bei der Empfindlichkeit von Lymphomzellen gegenüber einer Krebstherapie anhand von zweidimensionalen und dreidimensionalen Zellkultursystemen zu untersuchen. Diese Methoden können helfen, zentrale Fragen zu den Wechselwirkungen zwischen dem angeborenen Immunsystem und Krebs zu beantworten, beispielsweise welche Rolle neutrophil-vermittelte Tumorzellantworten in der Krebstherapie spielen. Der entscheidende Vorteil der Dichtegradiententrennung liegt darin, dass damit in kurzer Zeit reine Populationen von Immunzellen isoliert werden können, ohne die Zellen funktionell beeinflussenden Stimuli auszusetzen.Um die primären leukämischen Zellen und Neutrophilen zu isolieren, geben Sie zunächst 15 Milliliter EDTA-behandeltes Blut aus Proben von Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie in einzelne sterile 50-Milliliter-Röhrchen. Verdünnen Sie das Blut mit 15 Millilitern RPMI. Fügen Sie dann vorsichtig und langsam 15 Milliliter der Dichtegradientenlösung bei Raumtemperatur unter das Blut hinzu, wobei darauf geachtet werden muss, dass die Schichten nicht vermischt werden.Nach der Trennung der Zellen durch Zentrifugation sind vier unterschiedliche Phasen sichtbar: die Thrombozyten und das Plasma oben, ein weißer Ring aus mononukleären Zellen, die Dichtegradientenlösung sowie die Granulozyten und Erythrozyten unten. Mit einer Pasteur-Pipette überführen Sie zuerst den weißen Ring aus primären leukämischen Zellen in ein neues 50-Milliliter-Gefäß.Spülen Sie die Zellen mit bis zu 50 Milliliter PBS mit Calcium und Magnesium. Und resuspendieren Sie das Präparat in fünf Milliliter frischem PBS. Anschließend geben Sie weitere 45 Milliliter PBS zu den Zellen hinzu und zentrifugieren die Zellen erneut.Nach der zweiten Wäsche das Präparat in vollständigem RPMI-Medium erneut suspendieren und die Anzahl der vitalen primären leukämischen Zellen bestimmen. Entfernen Sie anschließend die Thrombozytenplasma- und Dichtegradientenschichten und geben Sie 25 Milliliter PBS sowie 25 Milliliter Dextrin in Natriumchlorid zur Granulozyten-Erythrozyten-Phase hinzu.Mischen Sie die Röhrchen zehnmal durch Umstülpen. Anschließend lassen Sie die Zellen 30 Minuten bei Raumtemperatur sedimentieren. Am Ende der Equilibrierung überführen Sie die obere, arm an roten Blutkörperchen, reiche Neutrophilen-Schicht in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren die Zellen. Suspendieren Sie das Gewebe erneut in fünf Milliliter PBS und lysieren Sie die roten Blutkörperchen mit 45 Milliliter Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen. Nach 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur zentrifugieren Sie die Zellen erneut und waschen das Gewebe mit 50 Milliliter PBS. Am Ende der Wäsche resuspendieren Sie die Zellen in vollständigem RPMI-Medium und zählen Sie die Anzahl der vitalen Neutrophilen. Verdünnen Sie beide Zellgruppen auf eine Konzentration von 300.000 Zellen pro 50 Mikroliter RPMI und verteilen Sie die Proben auf die entsprechende Anzahl von fünf Milliliter-Facs-Röhrchen. Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie die Pellets in 50 Mikroliter PBS, ergänzt mit FBS. Um die Reinheit der isolierten Zellsubpopulationen zu bestimmen, markieren Sie eine Aliquotprobe primärer leukämischer Zellen mit dem APC-konjugierten Antikörper gegen humanes CD19 und die Aliquotprobe der gereinigten Neutrophilen mit einer Mischung aus Antikörpern gegen humane Antigene, wie in der Tabelle aufgeführt, für 30 Minuten im Dunkeln bei vier Grad Celsius.Am Ende der Inkubation die Zellen mit 500 µL PBS, ergänzt mit FBS, waschen und die Pellets in 200 µL frischem FBS-PBS resuspendieren. Anschließend die Reinheit der Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie analysieren, wobei darauf zu achten ist, die Proben farblich zu kompensieren. Um primäre leukämische Zellen mit autologen Neutrophilen zu koinzidieren, 200.000 Zellen pro Milliliter leukämischer Zellen allein oder zusammen mit autologen Neutrophilen in einer 24-Loch-Platte in komplettem RPMI-Medium kultivieren.Mischen Sie die Zellen vorsichtig. Behandeln Sie die Zellen anschließend 24 Stunden lang mit Bruttons Tyrosinkinase-Inhibitor bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2. Am nächsten Tag sammeln Sie eine Aliquotprobe der Zellen in einem fünf Milliliter fassenden Kunststoffröhrchen.Anschließend die Zellen abzentrifugieren und die Pellets mit einem Milliliter FBS PBS waschen. Nach der zweiten Zentrifugation die Zellen gemäß den Herstelleranweisungen zehn Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln mit Aninexin V und Propidiumiodid markieren. Danach die Neutrophilen und primären leukämischen Zellen mittels Durchflusszytometrie analysieren, unter Verwendung der dargestellten Gating-Strategie.Um eine dreidimensionale Kokultur einzurichten, geben Sie 50.000 RL-Lymphom-B-Zellen allein oder gemischt mit differenzierten HL60-Zellen in sterile 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Proben und resuspendieren Sie die Pellets in 300 Mikroliter Basalmembran-Matrix unter Verwendung einer 1-Millimeter-Pipettenspitze, deren Öffnung auf 2 bis 3 Millimeter gekürzt wurde. Inkubieren Sie anschließend jeweils 300 Mikroliter der Zellen pro Vertiefung einer 24-Loch-Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 Prozent CO2.Am Ende der Inkubation ein Milliliter vollständiges RPMI-Medium zu jedem Well hinzufügen und die dreidimensionalen Kulturen für weitere sieben Tage in den Inkubator zurückbringen, wobei alle zwei Tage das Medium gewechselt wird. Am fünften Tag zehn Nanomolar Incristin zu den Kulturen hinzufügen. Nach einer Woche Kultivierung das Medium abpipettieren und jeden Well zweimal mit je einem Milliliter eiskaltem PBS waschen.Anschießend drei Milliliter eiskaltes PBS mit EDTA zu jedem Well hinzufügen und den Boden der Wells mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze abkratzen, um die Gele zu lösen. Die Platte 30 Minuten lang vorsichtig auf Eis schütteln. Danach die Zellsuspensionen in einzelne sterile 15-Milliliter-Röhrchen überführen und weitere 30 Minuten vorsichtig auf Eis schütteln.Überprüfen Sie das Vorhandensein einer homogenen Zellsuspension. Zentrifugieren Sie anschließend die Zellen, waschen Sie sie mit PBS und resuspendieren Sie die Pellets in frischem PBS mit FBS. Markieren Sie die Zellen schließlich mit den geeigneten Antikörpern und Vitalitätsfarbstoffen, wie zuvor gezeigt, und analysieren Sie die differenzierten RL- und HL60-Zellen mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung der dargestellten Torgate-Strategie.Die Analyse aller Ereignisse der isolierten Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie zeigt, dass diese Trennmethode zu einer hochreinen, einzelnen CD19-exprimierenden primären leukämischen Zellpopulation führt. Außerdem ergibt sich eine mehr als 90 Prozent reine neutrophile Population, die positiv für das gemeinsame Leukozytenantigen CD45 sowie für die von reifen Neutrophilen exprimierten Antigene CD15 und CD16 ist. Die Gating-Analyse der primären leukämischen Zellen aus Neutrophilen-Kokulturen zeigt, dass die Neutrophilen einen schützenden Effekt auf das Zellüberleben gegenüber dem Tyrosinkinase-Inhibitor Ibrutinib ausüben, wobei eine signifikant höhere Anzahl an vitalen primären leukämischen Zellen im Vergleich zur Kultur alleiniger primärer leukämischer Zellen beobachtet wird.Differenzierte HL60-Zellen sind in 3D-Kulturen stabiler als Neutrophile. Nach der Induktion ihrer granulozytären Entwicklung sind diese Zellen kleiner als undifferenzierte HL60-Zellen und exprimieren höhere Mengen an CD11B und CD38. Differenzierte HL60-Zellen weisen außerdem mehrfach gelappte Kerne auf.Diese Zellen zeigen einen schützenden Effekt auf die RL-Zellen, wobei nach Behandlung mit Vincristin eine signifikant höhere Anzahl lebensfähiger RL-Zellen in dreidimensionalen Kulturen im Vergleich zu allein kultivierten, mit Vincristin behandelten Lymphomzellen beobachtet wird. Sobald die Dichtegradientenzentrifugation beherrscht ist, kann sie innerhalb von 90 Minuten durchgeführt werden. Nach ihrer Entwicklung ebneten diese Techniken den Forschern auf dem Gebiet der Krebsbiologie den Weg, um die Auswirkungen verschiedener weißer Blutkörperchen auf die Tumormalignität in präklinischen Modellen und Patientenproben zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Monozyten und Neutrophile schnell und zuverlässig isoliert, die Wirkung von Neutrophilen auf die Vermittlung der Tumorzellantworten auf Antikrebsmittel analysiert und einen dreidimensionalen Kokulturversuch einrichtet.

neutrophil-isolation-analysis-to-determine-their-role-lymphoma-cell

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung von zytotoxischen Neutrophilen hoher Dichte und Neutrophilen niedriger Dichte aus dem Blut einer tumortragenden Maus durch diskontinuierliche Saccharosegradientenzentrifugation.

Isolierung von zytotoxischen Neutrophilen aus tumortragendem Mausblut

Dieses Video zeigt einen Assay, der die Rolle von neutrophilenähnlichen Zellen beim Schutz von Lymphomzellen vor der Zytotoxizität von Chemotherapeutika untersucht. Eine 3D-Co-Kultur, bestehend aus Lymphom- und neutrophilenähnlichen Zellen, wird etabliert und mit Vincristin – einem Chemotherapeutikum – belichtet. Der direkte Kontakt mit den neutrophilenähnlichen Zellen induziert eine Hochregulierung der anti-apoptotischen Proteine in den Lymphomzellen und fördert dadurch deren Überleben in...

Bestimmung der Rolle neutrophilenähnlicher Zellen bei der Empfindlichkeit von Lymphomzellen gegenüber einem Testmedikament

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das zwei Paare Proteom-Techniken, nämlich 2-dimensionale Elektrophorese (2DE) und Massenspektrometrie (MS), differentiell zwischen zwei oder mehr Gruppen von Primärproben ausgedrückt identifizieren / post-translationale modifizierten Proteinen. Dieser Ansatz, der zusammen mit funktionellen Experimenten ermöglicht die Identifizierung und Charakterisierung von Prognosemarkern / therapeutische Ziele.

Von einem 2DE-Gel-Spot die Proteinfunktion: Lektion gelernt von HS1 in chronischer lymphatischer Leukämie

Neutrophile spielen nicht nur eine wichtige Rolle bei der Abwehr des Wirts gegen eindringende Mikroorganismen, sondern sind auch an der Immunüberwachung von Tumorzellen beteiligt. Hier beschreiben wir Techniken im Zusammenhang mit der Isolierung von Neutrophilen mit Anti-Tumor-Eigenschaften und Methoden zur Überwachung der Funktion von Anti-Tumor-Neutrophilen in vitro und in vivo.

Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen mit Anti-Tumor-Eigenschaften

Das hier beschriebene Protokoll stellt eine einfache und reproduzierbare Methode dar, die Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) verwendet, um den Purinstoffwechsel an chronischen lymphatischen Leukämie (CLL)-Zellen zu messen, die unter verschiedenen Bedingungen kultiviert wurden.

HPLC-basierten Assay extrazelluläre Nucleotid / Nukleosid Metabolismus in menschlichen chronischer lymphatischer Leukämie-Zellen zu überwachen

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode in der menschlichen Low-Density Neutrophilen (LDN), erholte sich von postoperativen peritoneal Lavage Fluid, produzieren massive Neutrophilenzahl extrazelluläre Traps (NETs) und effizient trap freie Tumorzellen, die anschließend wachsen.

Neutrophilenzahl extrazelluläre fallen durch geringe Dichte Neutrophilen erzeugt gewonnenen Peritoneal Lavage Fluid vermitteln Tumor Zellwachstum und Anlage

Chronische lymphatischer Leukämie (CLL) ist die häufigste Leukämie in der westlichen Welt. NFAT Transkriptionsfaktoren sind wichtige Regulatoren von Entwicklung und Aktivierung in zahlreichen Zelltypen. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Verwendung von Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) in menschlichen CLL-Zellen, neuartige Zielgene des NFAT2 zu identifizieren.

Ein Chromatin Immunopräzipitation Assay, neuartige NFAT2 Zielgene in chronischer lymphatischer Leukämie zu identifizieren

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von Neutrophilen aus Vollblut, Buffy Coats oder Leukapheresemembranen, um eine gute Ausbeute, hohe Reinheit und minimale Zellaktivierung zu erreichen. Wir verwenden Gradientenreinigung, Sedimentation der roten Blutkörperchen (RBC) und RBC-Lyse, um ein hochwertiges / reines Neutrophilenpräparat zu erhalten.

Isolierung von menschlichen Neutrophilen aus Vollblut- und Buffycoats

Dieses Protokoll umfasst eine Reihe von funktionellen Neutrophilen-Assays, die als Screening-Methode verwendet werden, um Funktionen aus verschiedenen Signalwegen abzudecken. Das Protokoll beinhaltet eine erste und einfache Bewertung der Zelllebensfähigkeit, Reinheit, Produktion reaktiver Sauerstoffspezies, Echtzeitmigration, Phagozytose und einen vorläufigen Vorschlag für neutrophile extrazelluläre Fallen.

Eine Reihe von Screening-Techniken für einen schnellen Überblick über die Funktion der Neutrophilen

Hier bieten wir einen zuverlässigen Ansatz für die Isolierung von Neutrophilen niedriger und normaler Dichte aus Vollblut mittels magnetischer Isolierung (negative Selektion) und diskontinuierlichem Dichtegradientenmedium. Es gewährleistet die unberührte Isolierung hochreiner Zellen (≥93%) und ermöglicht eine genaue nachgelagerte Analyse von Neutrophilen-Subpopulationen, die für das Verständnis ihrer Rolle bei Gesundheit und Krankheit entscheidend ist.

Die Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen niedriger und normaler Dichte aus Vollblut

Neutrophile niedriger Dichte (LDN) nehmen bei mehreren Krankheiten signifikant zu. LDN werden in der Regel durch Zellsortierung isoliert. Wir stellen eine praktische Methode vor, um reines und lebensfähiges LDN zu erhalten. Nach der Dichtegradientenzentrifugation von peripherem Blut werden die Zellen mit magnetischen Mikrokügelchen inkubiert und dann LDN durch magnetische Säulen getrennt.

Schnelle magnetische Mikrobead-Methode zur effizienten Aufreinigung von Neutrophilen niedriger Dichte

Erfahren Sie die Isolierung von Neutrophilen aus menschlichem Blut mittels Dichtegradientenzentrifugation zur Untersuchung ihrer Rolle bei der Empfindlichkeit von Lymphomzellen gegenüber Krebstherapien.

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

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