Name: Entwicklung eines In Vitro Ocular Platform Kontaktlinsen zu Test (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung eines in vitro Augenmodells mit PDMS zur Simulation von Tränenfluss und mechanischem Verschleiß. Diese kostengünstige Plattform ermöglicht die Bewertung von Kontaktlinsen und anderen ophthalmologischen Geräten.

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Alle Experimente wurden in Übereinstimmung und Einhaltung aller einschlägigen Richtlinien skizziert von der University of Waterloo Tierforschungsethikkommission abgeschlossen. Die Rinderaugen sind großzügig von einem örtlichen Schlachthof gespendet. 1. Augen Modell <ol><li> Konstruktion und Herstellung von Formen 13 <ol><li> Entwerfen Sie die Augenmodelle entsprechend den durchschnittlichen physiologischen Dimensionen des menschlichen erwachsenen Augen. 13 </li><li> Lassen Sie einen Abstand von 250 &amp; mgr; m zwischen dem Augapfel und dem Augenlid Stücke des Augenmodells. Entwerfen Sie die jeweiligen Formen unter Verwendung von Computer-Aided Design (CAD) Software. </li><li> Erstellen Sie neue .cad Datei oder .sldprt Datei mit AutoCAD oder Solidworks. Erstellen von 3D-Modellen des menschlichen Augapfel / Augenlid. Erstellen Formen der Modelle und die Formen als .stl-Dateien speichern. </li><li> Import STL - Dateien in 3D - Druckersoftware (zB makeware für replicator2). Geben Sie Parameter des Druck (Standort, Kargheit, Maßstab, Orientierung, Glätte usw. </em&gt;) 13. </li><li> Speichern Sie die Datei als G-Code-Datei für 3D-Drucker zu lesen. Wählen Materialien wie PLA (Polymilchsäure), ABS (Acrylnitril - Butadien - Styrol), PC (Polycarbonat), oder einer Kombination davon, zu drucken , um die Formen 13. </li><li> Installieren gewünschten Filaments von dem Material der Wahl. Importieren Sie die G-Code-Datei in den 3D-Drucker zu lesen. Drucken Sie die Form. HINWEIS: Alternativ erzeugen die Augenformen einen Computer numerisch (CNC) Maschine, wenn eine glattere Oberfläche auf dem Augenmodell gewünscht wird gesteuert. Für CNC Formenbau, Materialien für die Formen werden nicht mehr nur auf thermische Kunststoffe, aber auf Metall, Keramik und chemisch resistive Polymere wie Polytetrafluorethylen erstrecken. </li><li> Öffnen Sie die CNC-Software-Schnittstelle, die mit einem Schneidbohrer verbunden ist. Konstruieren Sie 3D-Formen nach vorne, oben, Seiten- und perspektivische Ansichten der zuvor konstruierten Augapfel / Augenlid Modell Formen in Steuerungs-Software-Schnittstelle. Wählen Sie den entsprechenden Parameter für dieBearbeitung (Bitgröße, Substratmaterial, Materialstärke) und fahren Sie mit der Form zu schneiden. </li></ol></li><li> Synthese von Okulare PDMS <ol><li> Unter Verwendung einer Spritze, messen 10 ml Volumen von PDMS (Polydimethylsiloxan) Basis und füllen Sie ihn in eine 15-50 ml Zentrifugenröhrchen. Werden 10% w / v der Elastomerlösung des Gesamtgewichts des PDMS. Mit einem Rührstab, mischen Sie die gut-Lösungen. </li><li> Gießen Sie die PDMS-Lösung in den Augapfel und Augenlid Formen. Lassen Sie die PDMS bei RT O / N (oder mindestens 12 hr) zu regeln, die Polymerisation zu starten und zu ermöglichen, Blasen aus dem Polymer zu lösen. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass es keine Blasen in der PDMS-links, die möglicherweise steigen oder zu erweitern. </li><li> Anschließend stellen die Formen in eine 75 ° C (167 ° F) heißen Ofen für 1 Stunde oder 150 ° C (302 ° F) für 5 min. Für ein weicheres Gel, lassen Sie die PDMS bei RT sitzen für mindestens 48 Stunden, um vollständig zu polymerisieren. </li><li> Lege die Proben in einer Gefriertruhe für einige min; dies wird die PDMS schrumpfen und zu vereinfachen,die Entnahme der Proben aus den Formen. Extrahieren Sie die Okulare aus den Formen einer dünnen Spachtel. </li><li> Für die Lieferung der Lösung in den Raum zwischen dem Augapfel und Augenlid Stücke, schließen Sie einen 1/16 &quot;x 1/8&quot; Polytetrafluorethylen Rohr mit einem 1/16 &quot;gleich Bein Koppler Rohrverbinder und befestigen Sie es auf das Augenlid Stück am Rohrloch . </li></ol></li><li> Synthese von Eyeball Stückes Agarose HINWEIS: Der Augapfel Stück synthetisiert werden können andere Polymere verwendet, wie Agarose. Das folgende Verfahren kann auch Augenstücke aus einer Vielzahl von Agar-Typen, wie PDA (Kartoffel-Dextrose-Agar) oder SDA (Sabouraud-Dextrose-Agar) zu erzeugen, modifizieren. <ol><li> Um eine 2% (2 g / 100 ml) Gel, messen 2 g Agarose produzieren und mit 100 ml Reinstwasser mischen. Bringen Sie die Lösung zum Kochen bringen (100 ° C), so dass die Agarose vollständig auflöst. Lassen Sie die Lösung abkühlen 5 min nach unten. </li><li> Füllen Sie die Lösung in den Augapfel Form und lassen Sie die Lösung für 3 zu kühlen0 min bei RT. Entfernen Sie die Augapfel Stücke mit einem Spatel. Lagern Sie den Augapfel Agar in einem -20 ° C Gefrierschrank für die spätere Verwendung. Für die Mikrobiologie Studien, Sterilisieren der Augapfel Formen im Autoklaven und / oder UV-Bestrahlung. </li></ol></li><li> Der Einbau von Bovine Cornea auf PDMS Eyeball HINWEIS:. Dieses Protokoll von Parekh angepasst wurde , et al 14 <ol><li> Führen Sie die Präparation und Einbau der Rinder-Cornea unter sterilen Bedingungen unter einer Laminar-Flow-Haube. Erwerben die Augen und sezieren sie am selben Tag. </li><li> Drehen Sie den Flow-Haube auf 10 Minuten vor der Verwendung und sanieren mit 70% Ethanol Alkohol. Sicherzustellen, dass alle Materialien und Instrumente steril sind durch Autoklavieren bei 273 ° F / 133 ° C für 45 min, und positioniert ist nicht weniger als 4 Zoll von der Strömungshaube Eingang. </li><li> Tauchen Sie die Rinderauges in einen Becher mit einem verdünnten PVP-Jod-Lösung für 2 min enthält. Spülen Sie das Auge in ein Becherglas mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) pH 7.4. Mit einer Pinzette vorsichtig aufstreichen Auge auf eine Petrischale aus Glas, Hornhautseite nach oben. </li><li> Entfernen Sie die überschüssige Muskel und Fettgewebe durch an den scleral Befestigungspunkte mit stumpfen Ende Dissektion Schere schneiden. Entsorgen Sie das überschüssige Gewebe in einen sterilen Becher für tierische Abfälle bezeichnet. </li><li> Mit Mikro-Schere, entfernen Sie die Bindehaut aus dem Auge. Wickeln Sie das Auge mit steriler Gaze, einen Abstand von mindestens 1 cm vom Limbus zu halten. </li><li> Mit einem Skalpell einzuschneiden die Sklera etwa 2 mm vom Limbus Region und oberflächlich, um Durchdringung des darunterliegenden Choroidea und Glaskörper zu vermeiden. verlängern Sie vorsichtig den Schnitt um 360 ° mit einem Skalpell oder Dissektion Schere ohne die Hornhaut aus ihrer natürlichen Krümmung zu verformen. </li><li> Mit einer feinen Pinzette, entfernen Sie die Hornhaut aus dem Auge. Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen Sie anhaftenden Uvea Gewebe und spülen Hornhaut mit PBS. </li><li> Lagern Sie die Hornhaut bei 31ºC in einem sterilen Behälter mit KulturMedium (wie beispielsweise Medium 199) 3% Fetal Bovine Serum enthaltendem Gewebe Feuchtigkeit und Zell Nahrung aufrechtzuerhalten. </li><li> Vor dem Experimentieren, ruhen die ausgeschnittenen Hornhaut auf dem PDMS Augapfel, und klemmen Sie die beiden Stücke zusammen mit einem spezialisierten Clip-on. </li></ol></li></ol> 2. Blink-Plattform <ol><li> Design und Produktion der Blink-Plattform HINWEIS: Die Blink-Plattform besteht aus drei Funktionsteilen: Augenmodell (beschrieben in Abschnitt 1), Getriebe und Elektronik. <ol><li> Gestaltung und Herstellung der blink-Plattform CAD und 3D-Druck, ähnlich wie für das Auge Modell beschrieben (Abschnitt 1.1). Gestalten Sie das Getriebe , so dass es eine einfache Drehung der Motoren in die seitlichen und Drehbewegungen der Okulare übersetzt. 15 </li><li> Verwendung des Ritzels und Getriebemechanismus, zu übersetzen Drehbewegung eines Schrittmotors in die seitliche Bewegung eines Ritzels, die mit den Augenlid Stücken verbunden ist. </li><li> Verwendung derKonjugat Getriebesystem, von einem Schrittmotor in drei (oder mehr) Drehbewegungen für drei verschiedene Augapfel Stücke eine Drehbewegung zu verstärken. </li><li> Ausrichten der zwei Getriebesysteme, eine für das Augenlid und einen für Augapfels, so dass der Abstand zwischen den beiden konstant sind. Bauen Sie die Elektronik mit einem Mikrocontroller, Motorschild und zwei Motoren. HINWEIS: zwei Schrittmotoren Rotationsmotoren zu schaffen, die durch das Getriebesystem in eine blinkende Bewegung übersetzt wird. </li><li> Verbinden die beiden Schrittmotoren mit einem System, bestehend aus einem Motorschild auf dem Mikrocontroller gestapelt. Schließen Sie und konfigurieren Sie die elektronischen Komponenten mit Open-Source-Software-Produkten zu arbeiten. </li><li> Programmieren Sie das System auf Motorparameter steuern, wie Umdrehungen pro Minute (RPM), die Anzahl der Runden nach vorne, die Anzahl der Runden zurück und drehen Stil. HINWEIS: Siehe die zusätzliche &quot;Arduino-Code-Datei&quot; für weitere Einzelheiten. </li><li> Laden Sie die Systemsoftware von der masteller &#39;Website. </li><li> Installieren Sie die Software und öffnen. Schreiben Sie den Code zu Schrittmotoren in der gewünschten Konfiguration zu steuern. Verbinden des Systems mit einer Quelle des elektronischen Systems mit Energie zu versorgen, so dass die Motoren in der gewünschten Weise bewegen, wie durch den Forscher definiert. HINWEIS: Siehe die zusätzliche &quot;Arduino-Code-Datei&quot;. </li></ol></li><li> Montage mit Mikrofluidik (künstliche Tränenlösung) <ol><li> Nehmen Sie die synthetisierten Augapfel und Augenlid Stücke und rutschen sie auf den entsprechenden Clip-ons für das Auge-Modell. Den Schlauch, der mit einer Spritze und positioniert auf der mikrofluidischen Pumpe mit dem Augenlid Stück (Abschnitt 1.2.5) verbunden ist. Testen Sie die Plattform laufen und für eine konsistente Bewegung überprüfen. </li><li> Prime der Schlauch und überprüfen für einen steten Fluss von künstlichen Tränenlösung (ATS). Das Rezept für ATS wurde bereits berichtet. 16 </li><li> Manuell bewegen zusammen, um die Augenmodellteile auf einer ebenen Fläche, so dass der Augapfel und das AugeDeckel in Kontakt sind. Stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit des mikrofluidischen Pumpe auf gewünschte Werte. Stellen physiologischen Flussraten von 1 bis 1,5 &amp; mgr; l / min. 17 </li><li> Die Pumpe und die Aktoren Experiment zu beginnen. Für die Lieferung Experimente Medikament, legen Sie die arzneimittelhaltige Kontaktlinse auf dem Augapfel Stück. </li><li> Ermöglichen die Durchflussflüssigkeit in eine 12-Well-Platte zu tropfen. Bei den festgelegten Zeitintervallen gewünscht, zu quantifizieren , den Analyten oder Arzneimittelkonzentration unter Verwendung üblicher Nachweisverfahren wie UV-Vis - Spektroskopie oder Fluoreszenz. 1,4,18 </li><li> Für Studien Ablagerung von Tränenkomponenten auf Kontaktlinsen Auswertung, legen Sie die Kontaktlinse auf dem &quot;Augapfel&quot; Stück. Sammeln Sie die Durchströmungsflüssigkeit, die verworfen werden kann. </li><li> Nach der gewünschten Zeitintervallen, entfernen Sie die Kontaktlinse aus dem Augapfel Stück und bereiten die Linse für eine weitere Analyse, wie die konfokale Mikroskopie. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Es gibt drei wichtige Schritte innerhalb des Protokolls, die besondere Aufmerksamkeit erfordern: Design und Herstellung von Formen (Abschnitt 1.1), Plattformeinheit (Abschnitt 2.2.1-2.2.3) und die Überwachung der Versuchslauf (Abschnitt 2.2.4-2.2.7 ). In Bezug auf die Konstruktion und Herstellung von Formen (Abschnitt 1.1), sollte der Augapfel Stück nach den Abmessungen einer menschlichen Hornhaut ausgebildet sein. Allerdings kann es mehrere Prototypen der Form vor einem Augapfel Stück benötigen, können erstellt werden,...

Zwei wesentliche Bereiche von Interesse innerhalb der Kontaktlinse (CL) Arena sind Unbehagen und die Entwicklung neuer CL-Anwendungen. Die zugrunde liegenden Mechanismen CL Beschwerden Aufklären ist ein Thema, das Feld für Jahrzehnte. 8 Die Entwicklung neuer, funktionaler CLs, wie Drug-Delivery - Geräte 1,3,9 und Biosensoren ausgewichen hat, 10-12 ein Bereich von wachsendem Interesse ist, mit erheblichen potenziellen Märkten. In beiden Fällen würde ein hoch entwickeltes In - vitro - Modell relevanten Informationen zur Verfügung mit der Auswahl geeigneter Linsenmaterialien oder Konstruktionsmerkmale , während der Entwicklungsphase zu unterstützen. Leider sind aktuelle In - vitro - Modelle für CLs und andere Augenbezogenen Anwendungen Auswertung relativ grob und ungekünstelt. Traditionell Studien CL in vitro Auswertung Tränenfilmabscheidung oder Arzneimittelabgabe werden in statischen, große Volumen Fläschchen durchgeführt ein festes Flüssigkeitsvolumen enthält, die greatly übersteigt physiologischen Mengen. Außerdem fehlt diesem einfachen Modell der natürlichen Tränenströmungskomponente und den Blinkreflex, welche beide Faktoren der Augenumgebung definieren. Die Entwicklung eines anspruchsvollen, physiologisch relevanten Auge &quot;Modell&quot; wird einen multidisziplinären Ansatz erfordern und erfordern erhebliche In - vivo - Validierung. Aus diesen Gründen ist der grundlegende Rahmen für unsere in - vitro - Augenmodell sehr vielseitig, so dass das Modell kontinuierlich durch zukünftige Upgrades und Modulationen verbessert werden. Bis heute ist das Modell der Simulation Tränenvolumen der Lage, Tränenfluss, mechanischer Verschleiß und Luft ausgesetzt. Das Ziel ist es, ein in - vitro - Modell zu erstellen, um aussagekräftige Ergebnisse liefern wird, die in vivo prädiktive und kostenlose und Ex - vivo - Beobachtungen.

<table><tbody><tr><td>Arduino Uno R3 (Atmega328 - montiert)</td><td>Adafruit</td><td>50</td><td>Board</td></tr><tr><td>Schrittmotor</td><td>Adafruit</td><td>324</td><td>Motor und Motorschild</td></tr><tr><td>Gleichschenkel 1,6 mm 1/16"</td> <td>VWR</td><td>CA11009-280</td><td>50 Stück Rohrverbinder</td></tr><tr><td>Schlauch PT/SIL 1/16" x1/8"</td> <td>VWR</td><td>16211-316</td><td>Gehäuse von 50feet</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 Solarzellenverkapselung</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, Typ 1-A, niedriger EEO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0169-25G</td><td></td></tr><tr><td>PHD UltraTM</td><td>Harvard Apparat</td><td>703006</td><td>MicroFluidic Pump</td></tr><tr><td>Rinderhornhaut</td><td>Cargill, Guelph/ON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soldidworks</td><td>Dassault Systèmes</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>3D-Druck</td><td>Universität Waterloo - 3D-Druckzentrum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sezierwerkzeuge</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Allgemeine Präparierwerkzeuge</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Nährmedium Lagerung für Hornhaut</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Zum Nährmedium hinzufügen, 3 % Gesamtvolumen</td></tr></tbody></table>

entwicklung eines<em&gt; in vitro</em&gt; ocular platform kontaktlinsen zu test

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Derzeit werden In-vitro-Bewertungen von Kontaktlinsen (CLs) für die Verabreichung von Medikamenten typischerweise in großvolumigen Fläschchen durchgeführt,1-6 die physiologischen Tränenvolumina nicht nachahmen. 7 Dem traditionellen Modell fehlen auch die natürliche Tränenflusskomponente und der Blinzelreflex, die beide bestimmende Faktoren des Augenmilieus sind. In dieser Studie wird die Entwicklung eines neuartigen Modells beschrieben, das aus einem einzigartigen 2-teiligen Design, Augapfel- und Augenlidstück, besteht, das in der Lage ist, das physiologische Tränenvolumen nachzuahmen. Die Modelle werden aus 3D-gedruckten Formen (Polytetrafluorethylen- oder Teflonformen) hergestellt, mit denen Augenmodelle aus verschiedenen Polymeren, wie z.B. Polydimethylsiloxan (PDMS) und Agar, erzeugt werden können. Weitere Modifikationen an den Okularen, wie z.B. die Integration einer explantierten menschlichen oder tierischen Hornhaut oder eines menschlichen Hornhautkonstrukts, ermöglichen komplexere in vitro Augenuntersuchungen. Eine kommerzielle mikrofluidische Spritzenpumpe ist in die Plattform integriert, um die physiologische Tränensekretion zu emulieren. Lufteinwirkung und mechanischer Verschleiß werden durch zwei mechanische Aktuatoren erreicht, von denen einer das Lidstück seitlich und der andere das Augapfelokular kreisförmig bewegt. Das Modell wurde verwendet, um CLs für die Wirkstoffabgabe und die Ablagerung von Tränenkomponenten auf CLs zu bewerten.

Die synthetisierten Augenformen aus der Werkstatt erhalten und von 3-D - Druck sind in Abbildung 1 dargestellt. Diese Formen können mit einer Vielfalt von Polymeren, wie PDMS und Agarose, verwendet werden Okulare mit den gewünschten Eigenschaften herzustellen. Das bedeutete Montage des Augenmodells Plattform mit einer Mikrofluidik - Spritzenpumpe ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Plattform simuliert mechanischen Verschleiß über die Drehung des Augapfel...

Aktuelle In - vitro - Modelle zur Bewertung von Kontaktlinsen (CLS) und andere Augenbezogene Anwendungen sind stark eingeschränkt. Die dargestellte Augen Plattform simuliert physiologische Tränenfluss, Tränenvolumen, Lufteinflüssen und mechanischer Verschleiß. Dieses System ist sehr vielseitig und kann auf verschiedene in vitro mit CLs Analysen angewendet werden.

Entwicklung eines<em&gt; In Vitro</em&gt; Ocular Platform Kontaktlinsen zu Test

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

Das übergeordnete Ziel dieses In-vitro-Augenmodells ist es, das physiologische Tränenvolumen, den natürlichen Tränenfluss, die Lufteinwirkung und den mechanischen Verschleiß beim Blinzeln zu simulieren, um die Leistung von Kontaktlinsen zu bewerten. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Kontaktlinsen zu beantworten, wie z. B. die Vorhersage der Leistung von Kontaktlinsen und verwandten ophthalmologischen Geräten am Auge. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein einfaches und kostengünstiges In-vitro-Modell zur Simulation mehrerer Faktoren am Auge bietet, das derzeit nicht verfügbar ist.Obwohl diese Methode einen Einblick in die Leistung von Kontaktlinsen geben soll, kann sie auch zum Testen anderer ophthalmischer Systeme verwendet werden, wie z. B. der intelligenten Glukose-Kontaktlinse, die derzeit von Google und Novartis entwickelt wird. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, um zu verstehen, wie das Augenmodell funktioniert und wie es in verschiedenen Forschungsszenarien effektiv eingesetzt werden kann. Die Augenlid- und Augapfelteile des Modells sind aus PDMS gefertigt.Bereiten Sie zunächst das PDMS vor. Übertragen Sie mit

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Dieses Video zeigt die Entwicklung eines ex vivo-Modells der Aderhautkeimung zur Untersuchung der okulären mikrovaskulären Angiogenese. Der Assay umfasst die Kultivierung von Mausaugen-Explantaten, die das Aderhautgewebe enthalten, das an der Sklera und dem retinalen Pigmentepithel befestigt ist, unter bestimmten Bedingungen, die das keimende choroidale mikrovaskuläre Keimen fördern.

Aderhaut-Keimungs-Assay zur Ex-vivo-Untersuchung der okulären mikrovaskulären Proliferation

Hier wird die Etablierung eines klinisch relevanten ex vivo Schein-Kataraktchirurgie-Modells beschrieben, das zur Untersuchung von Mechanismen der Verletzungsreaktion von Epithelgeweben in ihrer nativen Mikroumgebung verwendet werden kann.

Einrichtung von einem klinisch relevanten<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Kataraktchirurgie Modell zur Untersuchung von epithelialen Wundheilung in einer nativen Mikromilieu

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Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

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In vitro und in vivo Modelle Corneal Endothelial-mesenchymale Transition zu studieren

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Subretinale Transplantation von humanen embryonalen Stammzellen abgeleitet retinalen Pigment Epithelzellen zu einem großen Augen geographische Atrophie

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Räumlich-zeitliche In-vivo-Bildgebung von okulären Wirkstoffabgabesystemen mittels faseroptischer konfokaler Lasermikroendoskopie

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