Lasergestützte Mikrodissektion (LAM) als Werkzeug für die Transkriptionsprofilierung einzelner Zelltypen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls für die LAM besteht darin, spezifische Pflanzenzellen zur Erzeugung von RNA hoher Integrität für die transkriptionelle Analyse zu isolieren. Der Fokus liegt auf schwer zugänglichen Zellen, wie beispielsweise Eizellen, in sexuellen und apomiktischen Boechera-Arten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungs- und Genetik der Pflanzen zu beantworten, beispielsweise die transkriptionellen Grundlagen, die der sexuellen und asexuellen Fortpflanzung von Pflanzen über Samen zugrunde liegen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass bestimmte, spezifische Arten von Stilen durchgeführt werden können. Dadurch wird der Effekt der Maskierung von Transkriptionen seltener Zelltypen bei der Analyse von Atherogenese-Geweben überwunden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie mit der Blockierstation ein vorgewärmtes, frisches Kunststoff-Balance-Behältnis mit geschmolzenem Paraffinwachs bei 56 Grad Celsius füllen.

Heben Sie den Deckel des Paraffinbades an und nehmen Sie jeweils ein Kärtchen heraus. Übertragen Sie eine Probe in das flüssige Paraffinwachs bei 56 Grad Celsius in einem Ausgleichstablett. Arbeiten Sie schnell, um zu verhindern, dass sich beim Umgang mit dem Kärtchen Wachs um die Probe herum verfestigt.

Dann positionieren Sie die Probe entsprechend dem Versuchsdesign mit einer Präpariernadel. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Proben übertragen sind. Um dünne Schnitte für die LAM vorzubereiten, entfernen Sie auf einem beleuchteten Tisch das Paraffinwachs mit der Probe aus dem Kunststoffbehälter.

Entfernen Sie einen Wachsblock mit der Probe, beispielsweise einer Knospe oder Blüte, mithilfe eines RNase-freien Rasiermessers. Schmelzen Sie anschließend einen kleinen Tropfen Paraffinwachs an der Spitze eines Spatels. Befestigen Sie den Block mit der eingebetteten Probe mithilfe des heißen Wachses auf dem Träger.

Entfernen Sie das überschüssige Wachs um die Probe mit einer Rasierklinge und stellen Sie sicher, dass der Block eine quadratische Oberfläche mit parallelen Kanten aufweist. Stellen Sie dann die Heizplatte auf 42 Grad Celsius ein. Befestigen Sie die Probe sicher am Mikrotom.

Bereiten Sie sieben Mikrometer dicke Schnitte für die Zellen des reifen Gametophyten von Boechera vor. Danach überführen Sie die 10 bis 15 Zentimeter langen Paraffinbänder in eine Plastikbox mit schwarzem Kartonboden, bevor Sie sie auf die LAM-Objektträger positionieren. Um die Objektträger für die LAM vorzubereiten, stellen Sie fünf bis zehn metallumrandete Objektträger mit den flachen Oberflächen nach oben auf die Heizplatte.

Pipettieren Sie ein bis zwei Milliliter RNase-freies Wasser auf den Kunststoffteil der Objektträger. Schneiden Sie die Paraffinfaden mit einer Rasierklinge in kurze Stücke von etwa vier bis fünf Zentimetern Länge, die lang genug sind, um die Kunststofffenster der Objektträger zu überbrücken.

Verwenden Sie dann eine Pinzette und eine Präpariernadel, um die Paraffinstreifen parallel zueinander auf das Kunststofffenster der Objektträger zu legen. Heben Sie die Objektträger vorsichtig an einem Ende an, um das Wasser zu entfernen, und stellen Sie sie zurück. Bedecken Sie die Heizplatte mit einem Kunststoffdeckel, ohne die Objektträger zu berühren, und stellen Sie sicher, dass der Kunststoffdeckel einen Luftaustausch ermöglicht.

Trocknen Sie die Objektträger bei 42 Grad Celsius über Nacht. Entfernen Sie unter einem Abzug die Paraffinierung der Objektträger zweimal für jeweils 10 Minuten in Xylol. Achten Sie darauf, nur den Kunststoffteil der Objektträger einzutauchen, und halten Sie das breitere Ende des Metallrahmens jedes Objektträgers zum Entfernen trocken.

Lassen Sie die Objektträger vor der LAM 10 Minuten in der Abzugshaube trocknen. Schalten Sie in diesem Verfahren den Computer und das Mikroskop für die LAM ein. Starten Sie anschließend das Programm, das das Mikroskop und den Laser steuert.

Schalten Sie die Lasersteuerbox ein und schalten Sie den Laser durch Drücken des entsprechenden Knopfs auf der Steuerbox ein. Danach setzen Sie eine Kappe in den Kappenhalter ein. Platzieren Sie den LAM-Objektträger auf einem mikroskopischen Glasobjektträger und stellen Sie sicher, dass die flache Oberfläche des Objektträgers mit den angebrachten Gewebeproben zur Glasobjektträgerseite weist.

Danach das Objektträger in das Instrument mit der Glasplatte nach unten legen. Zuletzt den Deckglas-Halter mit dem Deckglas im Instrument positionieren. Das 4x-Objektiv auswählen.

Bewegen Sie im Programm die Kappe in die obere Position. Führen Sie danach einen Scan des Objektträgers durch. Suchen Sie den Objektträger ab und identifizieren Sie die Strukturen von Interesse.

Markieren und speichern Sie deren Positionen auf dem Objektträger, um später exakt zu diesen Positionen für den Schrittschneidvorgang zurückkehren zu können. Wählen Sie anschließend ein geeignetes Objektiv aus. Überprüfen Sie die Laserposition, indem Sie einmal die Laserschuss-Taste drücken.

Idealerweise in einem Bereich der Membran ohne Gewebe. Mit der Kappe in der unteren Position verwenden Sie das Hand-Pen-Werkzeug, um die Grenzen des gewünschten Zelltyps oder Gewebes zu markieren. Zum Beispiel die Eizelle.

Schneiden Sie es mit dem Laser durch Drücken von „Cut“ (Schneiden). Um einzelne Zellen zu isolieren, ist es entscheidend, diese in den richtigen Abschnitten eindeutig zu identifizieren. Außerdem sollten die Zellen einen Durchmesser von mindestens acht Mikrometern aufweisen, um eine zelltypspezifische Transkriptionsanalyse zu ermöglichen.

Bitte beachten Sie, dass der Schnittvorgang wiederholt werden muss, falls die Umrandung der Zelle nicht vollständig durchtrennt wurde, was typischerweise auf dem Bildschirm zu erkennen ist. In diesem Fall wird empfohlen, die Software so einzustellen, dass standardmäßig zwei Wiederholungen des Schnitts automatisch durchgeführt werden. Danach heben Sie die Kappe an, wechseln zur nächsten Speicherposition mit einer Struktur von Interesse und dissezieren den nächsten Zellschnitt, bis alle Zellen von Interesse von einem Objektträger gesammelt wurden.

Stellen Sie sicher, dass die Kappe so positioniert ist, dass der neue Abschnitt an einer leeren Stelle auf der Kappe haftet. Nachdem die gewünschten Zelltypen von allen Objektträgern isoliert wurden, entfernen Sie den Objektträger vom Gerät. Bringen Sie den Kappenhalter in die untere Position und überprüfen Sie die Oberfläche der Kappe visuell.

Verwenden Sie das 4x-Objektiv, um unspezifische Verunreinigungen der Probe auszuschließen. Schließen Sie dann die Kappe. Und frieren Sie die trockenen Schnitte bei minus 80 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung ein.

Hier ist die schematische Darstellung des ausgereiften weiblichen Gametophyten. Es handelt sich um dünne Schnitte durch Samenanlagen, die weibliche Gametophyten in Boechera divaricarpa enthalten, wobei die Eizellen aufgrund der charakteristischen Morphologie des weiblichen Gametophyten eindeutig identifizierbar sind. Eine vergleichbare RNA-Qualität wurde aus den Schnitten der Eizellen im Vergleich zu den größeren Gewebearealen, die von denselben Objektträgern als Kontrollen gewonnen wurden, erhalten.

Die erreichte RNA-Qualität eignete sich für eine zelltypspezifische RNA-Sequenzierung, wodurch 236 Gene identifiziert wurden, die in der apomiktischen Eizelle exprimiert werden, nicht jedoch in der apomiktischen Zentralzelle, der Synergidenzelle oder der apomiktischen Initialzelle. Auch nicht in den Zellen des reifen sexuellen Gametophyten von Arabidopsis thaliana. Andere Zell- und Gewebetypen verschiedener Arten können untersucht werden, um weitere Fragestellungen der Entwicklungsbiologie zu beantworten.

Beispielsweise die molekulare Grundlage der Genprägung im Endosperm und in den Embryonen von Pflanzensamen. Durch die Entwicklung dieser Technik wird es Forschern auf dem Gebiet der Entwicklungs-genetik und der Pflanzenfortpflanzung ermöglicht, die transkriptionelle Grundlage der apomiktischen Fortpflanzung in der Gattung Boechera zu erforschen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man hochwertige RNA für zelltypspezifische Transkriptionsanalysen unter Verwendung der laserunterstützten Mikrodissektion erhält.