Name: Lasergestützte Mikrodissektion (LAM) als Werkzeug für die Transkriptionsprofilierung einzelner Zelltypen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Erfahren Sie die lasergestützte Mikrodissektion zur Isolierung spezifischer Pflanzenzellen wie Eizellen in Boechera-Arten. Diese Methode ermöglicht hochwertige RNA-Extraktion für transkriptionelle Analysen.

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Wir danken Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) für die Bereitstellung von Boechera divaricarpa Samen und Sharon Kessler (University of Oklahoma) für die kritische Lektüre und das Korrekturlesen. Die Arbeiten an zelltypspezifischen Transkriptomanalysen zur Untersuchung der Gametophytenentwicklung und Apomixis im Labor der UG werden unterstützt von der Universität Zürich, durch ein Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft und des Marie-Curie-Projekts IDEAGENA to AS, durch Stipendien des Staatssekretariats für Bildung und Forschung im Rahmen der COST-Aktion FA0903 (an UG und AS) und des Schweizerischen Nationalfonds (an UG).

<ol><li>Maheshwari, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaheshwari%2C+P+%22An+Introduction+to+the+Embryology+of+Angiosperms%22">An Introduction to the Embryology of Angiosperms</a>. , McGraw-Hill. New York. (1950).</li>
<li>Willemse, M. T. M., Van Went, J. L. The female gametophyte. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWillemse%2C+MTM+%22Embryology+of+Angiosperms%22">Embryology of Angiosperms</a>. Johri, B. M. , Springer-Verlag. Berlin. 159-196 (1984).</li>
<li>Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apomixis%3A+Molecular+strategies+for+the+generation+of+genetically+identical+seeds+without+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization.</a> Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).</li>
<li>Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apomixis+-+the+asexual+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Apomixis - the asexual revolution.</a> Science. 274, 1322-1323 (1996).</li>
<li>Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+future+for+apomixis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">A bright future for apomixis.</a> Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).</li>
<li>Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+germline+formation%3A+molecular+insights+define+common+concepts+and+illustrate+developmental+flexibility+in+apomictic+and+sexual+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction.</a> Development. 142, 229-241 (2015).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apomictic+and+sexual+germline+development+differ+with+respect+to+cell+cycle%2C+transcriptional%2C+hormonal+and+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+GENET%22%5BJournal%5D)">Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation.</a> PLOS GENET. 10, e1004476(2014).</li>
<li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarging+cells+initiating+apomixis+in+Hieractium+praealtum+transition+to+an+embryo+sac+program+prior+to+entering+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis.</a> Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).</li>
<li>Wuest, S. E., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+microdissection+applied+to+floral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted microdissection applied to floral tissues.</a> Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).</li>
<li>Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+expression+profiling+of+rare+cell+types+as+exemplified+by+its+impact+on+our+understanding+of+female+gametophyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development.</a> Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).</li>
<li>Wuest, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+female+gametophyte+gene+expression+map+reveals+similarities+between+plant+and+animal+gametes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes.</a> Curr Biol. 20, 1-7 (2010).</li>
<li>Cai, S., Lashbrook, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+plant+cells+from+tape-transferred+paraffin+sections+promotes+recovery+of+structurally+intact+RNA+for+global+gene+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling.</a> Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).</li>
<li>Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+the+Arabidopsis+megaspore+mother+cell+uncovers+the+importance+of+RNA+helicases+for+plant+germ+line+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+BIOL%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development.</a> PLOS BIOL. 9, e1001155(2011).</li>
<li>Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes%3A+laser-assisted+microdissection+and+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing.</a> PLOS ONE. 7, e29685(2012).</li>
<li>Mau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+apomicts+trapped+in+the+ecological+niches+of+their+sexual+ancestors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci.U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors.</a> Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).</li>
<li>Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+variation+in+transcriptionally+active+regions+of+sexual+and+apomictic+Boechera.+demonstrates+independently+derived+apomictic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages.</a> Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).</li>
<li>Corral, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+apomixis-specific+polymorphism+is+correlated+with+exclusive+exonuclease+expression+in+premeiotic+ovules+of+apomictic+boechera+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species.</a> Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).</li>
<li>Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Arabidopsis+thaliana.+phloem+RNAs+provides+a+search+criterion+for+phloem-based+transcripts+hidden+in+complex+datasets+of+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments.</a> Plant J. 55, 746-775 (2008).</li>
<li>Schmid, M. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Genome+Scale+Quantitative+Biology+in+Arabidopsis+thaliana%22">Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana</a>. , University of Zürich. PhD Thesis 40-104 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das Protokoll eignet sich für verschiedene Zell- und Gewebetypen LAM mit Transkriptom kombiniert Analysen von Microarrays oder RNA-Seq ist ein wertvolles Werkzeug Einblicke in die spezifischen Muster der Gen - Aktivität zu gewinnen , Entwicklungs- oder physiologische Prozesse regulieren 7-11,13,14. Jedoch ist die Eignung dieses Verfahren für jeden gegebenen Zelltyp kritisch abhängig von strukturellen Problemen. Die Zelle muss gut sichtbar und eind...

In Transkriptions Studien an der Gewebeebene getan werden die Transkriptom von hoch spezialisierten, aber seltene Zelltypen durch die reichlicher umgebenden Zellen oft maskiert. Ein Beispiel für eine solche hochspezialisierte Zelltypen sind die Zellen der weiblichen Fortpflanzungs lineage (Keimbahn) in Pflanzen. Die weibliche Keimbahn ist in der Entwicklung Ovula angegeben, die Vorläufer von Samen im Inneren der gynoecium der Blume 1,2. Der Megasporenmutterzelle (MMC) ist die erste Zelle des weiblichen Keimbahn. Es erfährt Meiose ein tetrad reduzierter Megasporen zu bilden. Typischerweise überlebt nur eine dieser Megasporen und teilt sich mitotisch ohne Zytokinese, dh in einem Syncytium. Diese Mitosen werden von Zellularisierung folgte der reifen gametophyte zu bilden, die in der Regel besteht aus vier Zelltypen: drei antipodals, zwei synergid Zellen, das Ei und die zentrale Zelle. Das Ei und Zentralzellen sind die weiblichen Gameten, die von zwei Samenzellen während dou befruchtetble Fertilisation die zu den Embryo und Endosperm des entwickelnden Samen 1,2 zu ergeben. Im sexuellen Modellsystem Arabidopsis thaliana, nur ~ 50 Samen pro Blüte entwickeln , während etwa 50 bis 80 Samen pro Blume in der nahe verwandten Gattung Boechera entwickeln. Somit besteht die weiblichen Keimbahn von nur wenigen hochspezialisierte Zelltypen, ist es ein ausgezeichnetes Modell macht Entwicklungsprozesse, wie Zell Beschreibung und Differenzierung zu studieren. Darüber hinaus Einblicke in die Gen-regulatorischen Prozesse Pflanzenreproduktion regeln kann der angewandten Wert sein. In Pflanzen können sowohl sexuelle und asexuelle Vermehrung durch Samen (Apomixis) auftreten. Während der sexuellen Reproduktion genetische Vielfalt in einer Population erzeugt, Apomixis führt zur Bildung von klonale Nachkommenschaft, die genetisch identisch mit der Mutterpflanze ist. Daher hat apomixis ein großes Potenzial für Anwendungen in der Landwirtschaft und der Saatgutproduktion, als auch komplexe mütterliche Genotypen3,4,5 beibehalten unverändert über mehrere Generationen werden. Da apomixis natürlich nicht in allen wichtigen Kulturarten auftreten, ist das Engineering von Apomixis in Kulturen von großem Interesse 3,4,5. Doch dieses langfristige Ziel ist schwer zu erreichen , da die zugrunde liegenden genetischen und molekularen Grundlagen von apomixis nicht ausreichend detailliert 6 verstanden wird. Um einen Einblick in die Transkriptions Basis gewinnen regeln apomictic Reproduktion, zelltypspezifischen Transkriptionsprofilierung mit lasergestützten Mikrodissektion (LAM) und Next Generation Sequencing (NGS) stellt einen sehr leistungsfähigen Ansatz 7,8. LAM hat zunächst für Tier und der biomedizinischen Forschung etabliert. In den letzten Jahren hat LAM auch auf Pflanzenbiologie 6,9,10 angewendet. Im Gegensatz zu anderen Verfahren ermöglicht Profilierung einzelner Zell- und Gewebetypen, LAM erfordert nicht die Erzeugung von Markierungslinien 6,9,10. Daher kann es sein, applog auf eine beliebige Zelle oder Gewebetyp ohne vorherige molekulare Wissen. Ein weiterer Vorteil der LAM ist, dass es kann so lange in jedem Zelltyp angewendet werden, wie die Zelle kann in Trockenabschnitten basierend auf Position und / oder Strukturmerkmale erkannt werden. LAM hat den zusätzlichen Vorteil, dass fixierten Geweben verwendet werden, die bei der Verarbeitung Veränderungen des Transkriptionsprofils verhindert. Das Gewebe von Interesse, beispielsweise Blütengewebe wird in einem nicht vernetzenden Fixiermittel fixiert , bevor sie in Paraffin eingebettet wird . Einbettung in Paraffinwachs kann manuell durchgeführt werden, nach etablierten Protokollen 9,11. Jedoch führt die Verwendung eines automatischen Gewebeprozessor zur Dehydratisierung und Infiltration mit dem Wachs in der Regel höhere Reproduzierbarkeit in Bezug auf die Erhaltung der RNA-Qualität und Gewebemorphologie. Die alternative Strategie von Geweben in Harz einzubetten wurde auch für Zelltyp-spezifischen Analysen von LAM 8 erfolgreich verwendet. Jedoch ist die Verwendung eines automated Gewebeprozessor in Wachs zur Einbettung ist sehr zeitsparend, da viele Proben einmal verarbeitet werden können, auf ein Minimum von hands-on Zeit erfordern. Während typischerweise während der Fixierung und Einbettung keinen signifikanten Verlust an RNA-Qualität erfolgt, bleibt die Herstellung von Dünnschnitten mit dem Mikrotom und insbesondere auf den Frameslides die Halterung für LAM verwendet ein kritischer Schritt für die Konservierung von RNA-Qualität. Dies wurde zuvor festgestellt , und die Verwendung eines Bandübertragungssystem hat bei diesem Schritt in einer besseren Qualität RNA resultieren 12 beschrieben. Dies jedoch fügt einen zusätzlichen zeitaufwendigen Schritt bei der Herstellung der Folien und erfordert auch spezielle Ausrüstung. Das optimierte Protokoll unter reproduzierbar beschrieben produziert RNA , die für die Transkriptionsprofilierung mit Genchips und Next Generation Sequencing (NGS) nähert sich 7,11,13,14 von ausreichender Qualität ist. Darüber hinaus verwendet, um mit dem Laser Mikrodissektion Mikroskop, eine hohe Reinheit der isolierten Zelltypen ist routinely produziert 7,11,13,14. Die Gattung Boechera ist ein ausgezeichnetes Modellsystem für die wichtigsten Schritte von apomictic Wiedergabe zu studieren. In Boechera, eine Vielzahl unterschiedlicher sexueller und apomictic Beitritte wurden identifiziert und können für Vergleichsanalysen verwendet werden 15,16,17. In einem Vergleich von zelltypspezifischen Transkriptomen von Zellen aus der weiblichen Keimbahn von sexuellen Arabidopsis und apomictic Boechera identifizierten wir Gene und Wege , die differentiell exprimiert werden, um dadurch neue Aspekte der regulatorischen Prozesse identifizieren Apomixis 7 regelt. Darüber hinaus überprüft diese Studie die Eignung von LAM für zelltypspezifischen Transkriptionsanalysen von kleinen und seltenen Zelltypen. Wir haben bereits dieses Protokoll für die Analyse verschiedener Zelltypen in einer Vielzahl von Pflanzenarten verwendet, aber arten und gewebespezifische Modifikationen am Protokoll kann in bestimmten Fällen erforderlich sein.

<table><tbody><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>1.009.861.000</td><td>absolut EMPROVE Ph Eur,BP,USP</td></tr><tr><td>15 ml Falcon Zentrifugenröhrchen</td><td>VWR</td><td>62406-200</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalysator</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Applichem</td><td>A3686,2500</td><td>100% molekularbiologischer Qualität</td></tr><tr><td>Ambion Nuklease freies Wasser</td><td>Lebenshaltungstechnologien</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>ASP200 S</td><td>Leica</td><td>14048043624</td><td>Tissue-Prozessor&nbsp;</td></tr><tr><td>schwarzer Karton</td><td></td><td></td><td>kann in speziellen Papiergeschäften erworben werden</td></tr><tr><td>. DNA- und RNAse-freie Frame Slides</td><td>Micro Dissect GmbH</td><td></td><td>1, 4 & micro; m PET-Membran; kann auch erworben werden bei Leica</td></tr><tr><td>Dumond Pinzetten</td><td>Actimed</td><td>0208-5SPSF-PS</td><td></td></tr><tr><td>Ethanollampe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Exsikkator</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z354074-1EA</td><td>Nalgene Vaccuum Exsikkator oder ähnlichem Gerät</td></tr><tr><td>Filterspitzen 10&nbsp; &Mikro; l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60010</td><td>kann durch ähnliche Spitzen ersetzt werden</td></tr><tr><td>Filterspitzen 1.000&nbsp; &Mikro; l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60010</td><td>kann durch ähnliche Spitzen ersetzt werden</td></tr><tr><td>Filterspitzen 20&nbsp; &Mikro; l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60020</td><td>kann durch ähnliche Spitzen ersetzt werden</td></tr><tr><td>Filterspitzen 200&nbsp; &Mikro; l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60200</td><td>kann durch ähnliche Spitzen ersetzt werden</td></tr><tr><td>Pinzette Präzision</td><td>VWE</td><td>232-1221</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Objektträgerhalter</td><td>Huber & Co.AG</td><td>10.0540.01</td><td>F&auml; rbek&auml; sten nach Hellendahl</td></tr><tr><td>Glasbeizwanne</td><td>Huber & Co.AG</td><td>10.0570.01</td><td>F&auml; rbekasten</td></tr><tr><td>Beheiztes Paraffineinbettmodul Leica</td><td>Leica</td><td>Leica EG 1150 H</td><td>Blockierstation, ähnliche Geräte sind geeignet</td></tr><tr><td>Heiz- und Trockentisch</td><td>Medax</td><td>15501</td><td>andere Modelle und/oder Anbieter eignen sich</td></tr><tr><td>Eiskübel</td><td>VWR Eiskübel mit Deckel&nbsp;</td><td>10146-184</td><td>ähnliche Eimer gleich passend</td></tr><tr><td>Leuchttisch</td><td>UVP An Analytical Jena Unternehmen</td><td>TW-26&nbsp;</td><td>Weißlicht-Transluminator</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143562CE</td><td>Schnittkanten</td></tr><tr><td>Mikrotom-Klinge</td><td>Thermo Scientific</td><td>FEAHS35</td><td>S35 Mikrotom-Klinge Einweg-MMI</td></tr><tr><td>Cell Cut Plus Instrument</td><td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antihaftbeschichtete, RNAse-freie Mikrofuge-Röhrchen, 2 ml</td><td>Lebenstechnologien</td><td>AM12475</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast X-TRA</td><td>Roth</td><td>X882.2</td><td>für Histologie</td></tr><tr><td>PicoPure RNA Isolation Kit</td><td>life technologies</td><td>KIT0204</td><td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td></tr><tr><td>Kunststoff-Ausgleichsschalen</td><td>Semadeni AG</td><td>2513</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffbox</td><td>Semadeni AG</td><td>2971</td><td>Plastikdose PS</td></tr><tr><td>Kunststoffdeckel für Heizplatte</td><td></td><td></td><td>hausgemachte</td></tr><tr><td>Vorbereitungsnadel</td><td>VWR</td><td>631-7159</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>RNAse free microfuge tubes</td><td>life technologies AM12400</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAse ZAP Decontamination Solution</td><td>life technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Halbautomatisches rotierendes Mikrotom&nbsp;</td><td>Leica</td><td>RM2245</td><td>ähnliche Geräte sind gleichermaßen geeignet</td></tr><tr><td>Tissue Loc Histo Bildschirmkassetten</td><td>Thermo Scientific</td><td>C-1000_AQ</td><td>ähnliche Kassetten anderer Anbieter eignen sich</td></tr><tr><td>Röhrchen mit Klebedeckel, ohne Diffusor 500 & micro; l&nbsp;</td><td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td><td>50204</td><td></td></tr><tr><td>Xylol (Isomere) ROTIPURAN</td><td>VWR</td><td>4436,2</td><td>min. 99%, p.a., ACS, ISO SP</td></tr><tr><td>Prozess Einbettkassetten</td><td>Leica</td><td>14039440000</td><td>Leica Jet Kassette I ohne Deckel</td></tr><tr><td>Universalofen</td><td>Memmert</td><td>UF55</td><td>andere Modelle und/oder Hersteller sind geeignet</td></tr></tbody></table>

lasergestützte mikrodissektion (lam) als werkzeug für die transkriptionsprofilierung einzelner zelltypen

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Das Verständnis von Entwicklungsprozessen auf molekularer Ebene erfordert Einblicke in die Transkriptionsregulation und damit das Transkriptom auf der Ebene einzelner Zelltypen. Während die hier beschriebenen Methoden generell auf ein breites Spektrum von Spezies und Zelltypen anwendbar sind, konzentriert sich unsere Forschung auf die pflanzliche Reproduktion. Der Pflanzenanbau und die Saatgutproduktion sind für die Ernährung von Mensch und Tier von entscheidender Bedeutung. Ein detailliertes Verständnis der regulatorischen Netzwerke, die die Bildung der Fortpflanzungslinie (Keimbahn) und letztlich des Saatguts steuern, ist Voraussetzung für die gezielte Manipulation der Pflanzenfortpflanzung. Insbesondere das Engineering der Apomixis (ungeschlechtliche Fortpflanzung durch Samen) in Nutzpflanzen verspricht große Verbesserungen, da es zur Bildung von klonalen Samen führt, die genetisch identisch mit der Mutterpflanze sind. Daher sind die Zelltypen der weiblichen Keimbahn von großer Bedeutung für das Verständnis und die Entwicklung der Apomixis. Da die entsprechenden Zellen jedoch tief in das Blütengewebe eingebettet sind, sind sie für experimentelle Analysen, einschließlich zelltypspezifischer Transkriptomik, sehr schwer zugänglich. Um diese Einschränkung zu überwinden, können Schnitte einzelner Zellen durch lasergestützte Mikrodissektion (LAM) isoliert werden. Während LAM in Kombination mit transkriptionellem Profiling die Identifizierung von Genen und Signalwegen ermöglicht, die in jedem Zelltyp mit hoher Spezifität aktiv sind, kann die Etablierung eines geeigneten Protokolls eine Herausforderung darstellen. Insbesondere kann die Qualität der RNA, die nach LAM erhalten wird, beeinträchtigt werden, insbesondere wenn kleine, einzelne Zellen angegriffen werden. Um dieses Problem zu umgehen, haben wir für LAM einen Workflow etabliert, der reproduzierbar zu einer hohen RNA-Qualität führt, die sich gut für die Transkriptomik eignet, wie hier beispielhaft die Isolierung von Zellen der weiblichen Keimbahn in apomiktischen Boechera zeigt. In diesem Protokoll werden Verfahren zur Gewebeaufbereitung und LAM beschrieben, auch im Hinblick auf die RNA-Extraktion und die Qualitätskontrolle.

Probenvorbereitung und LAM sind in aufeinanderfolgenden Schritten durchgeführt Eine Anzahl von aufeinanderfolgenden Schritte sind erforderlich RNA für die Transkriptionsanalyse von ausgewählten Zelltypen von LAM (Abbildung 1) herzustellen. Dies beginnt mit der Ernte der Blüten und sofortige Fixierung, um sicherzustellen, dass die RNA-Population nach der Ernte unverändert bleibt. Das Gewebe wir...

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die lasergestützte Mikrodissektion spezifischer Pflanzenzelltypen für die transkriptionelle Profilerstellung. Während das Protokoll für verschiedene Spezies und Zelltypen geeignet ist, liegt der Schwerpunkt bei der Kreuzblütlergattung Boechera auf schwer zugänglichen Zellen der weiblichen Keimbahn, die für die sexuelle und apomiktische Fortpflanzung wichtig sind.

Lasergestützte Mikrodissektion (LAM) als Werkzeug für die Transkriptionsprofilierung einzelner Zelltypen

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls für die LAM besteht darin, spezifische Pflanzenzellen zur Erzeugung von RNA hoher Integrität für die transkriptionelle Analyse zu isolieren. Der Fokus liegt auf schwer zugänglichen Zellen, wie beispielsweise Eizellen, in sexuellen und apomiktischen Boechera-Arten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungs- und Genetik der Pflanzen zu beantworten, beispielsweise die transkriptionellen Grundlagen, die der sexuellen und asexuellen Fortpflanzung von Pflanzen über Samen zugrunde liegen.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass bestimmte, spezifische Arten von Stilen durchgeführt werden können. Dadurch wird der Effekt der Maskierung von Transkriptionen seltener Zelltypen bei der Analyse von Atherogenese-Geweben überwunden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie mit der Blockierstation ein vorgewärmtes, frisches Kunststoff-Balance-Behältnis mit geschmolzenem Paraffinwachs bei 56 Grad Celsius füllen.Heben Sie den Deckel des Paraffinbades an und nehmen Sie jeweils ein Kärtchen heraus. Übertragen Sie eine Probe in das flüssige Paraffinwachs bei 56 Grad Celsius in einem Ausgleichstablett. Arbeiten Sie schnell, um zu verhindern, dass sich beim Umgang mit dem Kärtchen Wachs um die Probe herum verfestigt.Dann positionieren Sie die Probe entsprechend dem Versuchsdesign mit einer Präpariernadel. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Proben übertragen sind. Um dünne Schnitte für die LAM vorzubereiten, entfernen Sie auf einem beleuchteten Tisch das Paraffinwachs mit der Probe aus dem Kunststoffbehälter.Entfernen Sie einen Wachsblock mit der Probe, beispielsweise einer Knospe oder Blüte, mithilfe eines RNase-freien Rasiermessers. Schmelzen Sie anschließend einen kleinen Tropfen Paraffinwachs an der Spitze eines Spatels. Befestigen Sie den Block mit der eingebetteten Probe mithilfe des heißen Wachses auf dem Träger.Entfernen Sie das überschüssige Wachs um die Probe mit einer Rasierklinge und stellen Sie sicher, dass der Block eine quadratische Oberfläche mit parallelen Kanten aufweist. Stellen Sie dann die Heizplatte auf 42 Grad Celsius ein. Befestigen Sie die Probe sicher am Mikrotom.Bereiten Sie sieben Mikrometer dicke Schnitte für die Zellen des reifen Gametophyten von Boechera vor. Danach überführen Sie die 10 bis 15 Zentimeter langen Paraffinbänder in eine Plastikbox mit schwarzem Kartonboden, bevor Sie sie auf die LAM-Objektträger positionieren. Um die Objektträger für die LAM vorzubereiten, stellen Sie fünf bis zehn metallumrandete Objektträger mit den flachen Oberflächen nach oben auf die Heizplatte.Pipettieren Sie ein bis zwei Milliliter RNase-freies Wasser auf den Kunststoffteil der Objektträger. Schneiden Sie die Paraffinfaden mit einer Rasierklinge in kurze Stücke von etwa vier bis fünf Zentimetern Länge, die lang genug sind, um die Kunststofffenster der Objektträger zu überbrücken.Verwenden Sie dann eine Pinzette und eine Präpariernadel, um die Paraffinstreifen parallel zueinander auf das Kunststofffenster der Objektträger zu legen. Heben Sie die Objektträger vorsichtig an einem Ende an, um das Wasser zu entfernen, und stellen Sie sie zurück. Bedecken Sie die Heizplatte mit einem Kunststoffdeckel, ohne die Objektträger zu berühren, und stellen Sie sicher, dass der Kunststoffdeckel einen Luftaustausch ermöglicht.Trocknen Sie die Objektträger bei 42 Grad Celsius über Nacht. Entfernen Sie unter einem Abzug die Paraffinierung der Objektträger zweimal für jeweils 10 Minuten in Xylol. Achten Sie darauf, nur den Kunststoffteil der Objektträger einzutauchen, und halten Sie das breitere Ende des Metallrahmens jedes Objektträgers zum Entfernen trocken.Lassen Sie die Objektträger vor der LAM 10 Minuten in der Abzugshaube trocknen. Schalten Sie in diesem Verfahren den Computer und das Mikroskop für die LAM ein. Starten Sie anschließend das Programm, das das Mikroskop und den Laser steuert.Schalten Sie die Lasersteuerbox ein und schalten Sie den Laser durch Drücken des entsprechenden Knopfs auf der Steuerbox ein. Danach setzen Sie eine Kappe in den Kappenhalter ein. Platzieren Sie den LAM-Objektträger auf einem mikroskopischen Glasobjektträger und stellen Sie sicher, dass die flache Oberfläche des Objektträgers mit den angebrachten Gewebeproben zur Glasobjektträgerseite weist.Danach das Objektträger in das Instrument mit der Glasplatte nach unten legen. Zuletzt den Deckglas-Halter mit dem Deckglas im Instrument positionieren. Das 4x-Objektiv auswählen.Bewegen Sie im Programm die Kappe in die obere Position. Führen Sie danach einen Scan des Objektträgers durch. Suchen Sie den Objektträger ab und identifizieren Sie die Strukturen von Interesse.Markieren und speichern Sie deren Positionen auf dem Objektträger, um später exakt zu diesen Positionen für den Schrittschneidvorgang zurückkehren zu können. Wählen Sie anschließend ein geeignetes Objektiv aus. Überprüfen Sie die Laserposition, indem Sie einmal die Laserschuss-Taste drücken.Idealerweise in einem Bereich der Membran ohne Gewebe. Mit der Kappe in der unteren Position verwenden Sie das Hand-Pen-Werkzeug, um die Grenzen des gewünschten Zelltyps oder Gewebes zu markieren. Zum Beispiel die Eizelle.Schneiden Sie es mit dem Laser durch Drücken von „Cut“ (Schneiden). Um einzelne Zellen zu isolieren, ist es entscheidend, diese in den richtigen Abschnitten eindeutig zu identifizieren. Außerdem sollten die Zellen einen Durchmesser von mindestens acht Mikrometern aufweisen, um eine zelltypspezifische Transkriptionsanalyse zu ermöglichen.Bitte beachten Sie, dass der Schnittvorgang wiederholt werden muss, falls die Umrandung der Zelle nicht vollständig durchtrennt wurde, was typischerweise auf dem Bildschirm zu erkennen ist. In diesem Fall wird empfohlen, die Software so einzustellen, dass standardmäßig zwei Wiederholungen des Schnitts automatisch durchgeführt werden. Danach heben Sie die Kappe an, wechseln zur nächsten Speicherposition mit einer Struktur von Interesse und dissezieren den nächsten Zellschnitt, bis alle Zellen von Interesse von einem Objektträger gesammelt wurden.Stellen Sie sicher, dass die Kappe so positioniert ist, dass der neue Abschnitt an einer leeren Stelle auf der Kappe haftet. Nachdem die gewünschten Zelltypen von allen Objektträgern isoliert wurden, entfernen Sie den Objektträger vom Gerät. Bringen Sie den Kappenhalter in die untere Position und überprüfen Sie die Oberfläche der Kappe visuell.Verwenden Sie das 4x-Objektiv, um unspezifische Verunreinigungen der Probe auszuschließen. Schließen Sie dann die Kappe. Und frieren Sie die trockenen Schnitte bei minus 80 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung ein.Hier ist die schematische Darstellung des ausgereiften weiblichen Gametophyten. Es handelt sich um dünne Schnitte durch Samenanlagen, die weibliche Gametophyten in Boechera divaricarpa enthalten, wobei die Eizellen aufgrund der charakteristischen Morphologie des weiblichen Gametophyten eindeutig identifizierbar sind. Eine vergleichbare RNA-Qualität wurde aus den Schnitten der Eizellen im Vergleich zu den größeren Gewebearealen, die von denselben Objektträgern als Kontrollen gewonnen wurden, erhalten.Die erreichte RNA-Qualität eignete sich für eine zelltypspezifische RNA-Sequenzierung, wodurch 236 Gene identifiziert wurden, die in der apomiktischen Eizelle exprimiert werden, nicht jedoch in der apomiktischen Zentralzelle, der Synergidenzelle oder der apomiktischen Initialzelle. Auch nicht in den Zellen des reifen sexuellen Gametophyten von Arabidopsis thaliana. Andere Zell- und Gewebetypen verschiedener Arten können untersucht werden, um weitere Fragestellungen der Entwicklungsbiologie zu beantworten.Beispielsweise die molekulare Grundlage der Genprägung im Endosperm und in den Embryonen von Pflanzensamen. Durch die Entwicklung dieser Technik wird es Forschern auf dem Gebiet der Entwicklungs-genetik und der Pflanzenfortpflanzung ermöglicht, die transkriptionelle Grundlage der apomiktischen Fortpflanzung in der Gattung Boechera zu erforschen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man hochwertige RNA für zelltypspezifische Transkriptionsanalysen unter Verwendung der laserunterstützten Mikrodissektion erhält.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Laser Capture Mikrodissektion von Säugetiergewebe

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