TAPE: ein biologisch abbaubares hämostatische Kleber Inspiriert von einer Ubiquitous Verbindung in Pflanzen für chirurgische Anwendung

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, einen biologisch abbaubaren hämostatischen Klebstoff für chirurgische Anwendungen zu entwickeln, der von einer in Pflanzen weit verbreiteten Verbindung inspiriert ist. Diese Methode kann uns helfen, den wasserresistenten Adhäsionsmechanismus von biometrischen Materialien wie Gewebeklebstoffen und Dichtmitteln in biomedizinischen Anwendungen zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Herstellung von TAPE äußerst einfach, skalierbar und umweltfreundlich ist.

Zunächst bereiten Sie eine Tanninsäure-Lösung in einem vier Milliliter fassenden Glasfläschchen auf einem Magnetrührer vor. Geben Sie ein Milliliter destilliertes Wasser und ein Gramm Tanninsäure hinzu und rühren dabei mit 200 U/min. Nach einer Stunde ist die Tanninsäure vollständig in einer braunen Lösung gelöst.

Fügen Sie anschließend ein Milliliter destilliertes Wasser zu einem Gramm PEG-Pulver hinzu und vermischen Sie beides im Vortex zu einer weißen Suspension. Halten Sie die Suspension 10 Minuten lang bei 60 Grad. Sie sollte vollständig klar werden.

Danach auf Raumtemperatur zurückführen. Als Nächstes in einem Mikrozentrifugenröhrchen 329 µL PEG-Lösung mit 671 µL der Tanninsäure-Lösung mischen. Das Aliquot langsam entnehmen, da beide Lösungen ziemlich viskos sind.

Mischen Sie die Lösungen vorsichtig mit einem schmalen Spatel zu einer honigartigen Mischung. Zentrifugieren Sie die Mischung drei Minuten lang bei 12.300 × g in einem Festwinkelrotor. Entfernen Sie anschließend vorsichtig möglichst viel Überstand mittels Pipette, wobei das vollständig gebildete TAPE zurückbleibt.

Bewahren Sie das TAPE vier bis acht Grad Celsius für mehrere Wochen auf. Um die Haftfestigkeit des TAPE zu messen, bereiten Sie ein Testgewebe aus einer Schweinehaut-Biopsie vor. Entfernen Sie das gesamte Fett und bereiten Sie anschließend zwei Testgewebe mit einem Durchmesser von sechs Millimetern vor.

Tragen Sie einen handelsüblichen Cyanacrylat-Klebstoff auf die äußere Seite jedes Gewebes auf und befestigen Sie die Stäbe oder ein ähnliches Objekt, das von der Prüfmaschine gegriffen werden soll. Anschließend geben Sie einen Tropfen TAPE auf eine Seite des Gewebes und verteilen ihn gleichmäßig zwischen den inneren Seiten der beiden Gewebe, sodass diese verbunden werden. Danach befestigen und lösen Sie die Gewebe mehrmals, um eine homogene Mischung zu erzeugen, die die Grenzfläche vollständig bedeckt.

Befestigen Sie als Nächstes die Stäbe an der Prüfvorrichtung. Beginnen Sie damit, eine Kraft von 20 Newton für eine Minute aufzubringen. Ziehen Sie danach die Stäbe mit einer Geschwindigkeit von einem Millimeter pro Minute auseinander, bis die Gewebe vollständig abgetrennt sind.

Die Daten werden als Kraft-Abstands-Kurve dargestellt. Um die Haftfestigkeit in Gegenwart von Wasser zu testen, geben Sie 20 Mikroliter Wasser auf die abgelöste Fläche zwischen den beiden Geweben und verbinden Sie die nassen Oberflächen unverzüglich mit dem KLEBEBAND. Wiederholen Sie den Test wie zuvor, ohne weitere Änderungen vorzunehmen.

Schneiden Sie zuerst eine Kappe mit einem Durchmesser von acht Millimetern von einem Mikrozentrifugenröhrchen ab und wiegen Sie sie. Füllen Sie anschließend die Kappe mit 150 Milligramm TAPE und bestimmen Sie das Gesamtgewicht. Füllen Sie die Kappe nicht über den Rand hinaus, da dieser als Barriere benötigt wird.

Fügen Sie 50 Milliliter PBS-Puffer zu der 75 Quadratzentimeter großen Zellkulturflasche hinzu. Stellen Sie die beladene Kappe in die Flasche und tauchen Sie die Kappe vollständig ein. Inkubieren Sie die Flasche bei 37 Grad Celsius auf einem Rütteltablett, das auf 50 U/min eingestellt ist, jedoch nicht höher.

Zum gewünschten Zeitpunkt entfernen Sie die Kappe und trocknen sie mit Stickstoffgas. Danach wiegen Sie die Kappe. Anschließend ersetzen Sie das PBS im Kolben und setzen die Inkubation unter sanftem Schütteln bis zum nächsten Zeitpunkt fort.

Aus den Messungen die relative verbleibende Masse berechnen. Beginnen Sie mit einer vollständig anästhesierten sechs Wochen alten männlichen Maus, die mit einer Zehenquetschung getestet wird. Vor Beginn der Operation sicherstellen, dass Augensalbe auf die Augen aufgetragen wird.

Exponieren Sie nun die Leber durch einen medianen Bauchschnitt und legen Sie ein Filterpapier mit bekannter Masse unter die Leber, um sie zu fixieren. Stechen Sie anschließend mit einer 18-Gauge-Nadel in die Leber, um eine Blutung auszulösen. Während das Blut mit steriler Gaze aufgesogen wird, geben Sie unverzüglich 100 Mikroliter TAPE an die Schnittstelle.

Verwenden Sie für positive Kontrollen Cyanoacrylat oder einen ähnlichen Klebstoff und lassen Sie bei negativen Kontrollen keine Maßnahme durchführen. Ein weiteres Nähen ist nicht erforderlich. Nach dem Auftragen des Klebstoffs sammeln Sie das Blut von der Schadensstelle auf dem Papier auf.

Ersetzen Sie das Papier alle 30 Sekunden während eines Zeitraums von zwei Minuten. Messen Sie die Masse des absorbierten Blutes auf den vier Filterpapieren. Das Tier sollte euthanasiert werden.

Es wurden verschiedene Verhältnisse von TA und PEG getestet, und die ideale Kombination zur Herstellung von TAPE ergab ein Volumenverhältnis von zwei zu eins. Ein solches TAPE wurde zwischen zwei Schweineschäden mit einem Durchmesser von sechs Millimetern aufgebracht und anschließend wie beschrieben an einer Zugmaschine getestet. Die Kraft, die erforderlich war, um die beiden Schweineschäden zu trennen, betrug anfangs 200 Kilopascal und stieg bei wiederholten Zyklen auf 250 Kilopascal an.

Wenn die Hautproben nach jedem Anheftungs- und Ablösezyklus angefeuchtet wurden, sank die Zugfestigkeit der Verbindung anfänglich auf 90 Kilopascal und verringerte sich nach 20 Zyklen auf 50 Kilopascal. Die Haltbarkeit von TAPE wurde in kleinen Volumina, verdünnt in PBS, unter Schütteln bei physiologischen Lichtverhältnissen getestet. Bei Verwendung der Zwei-zu-Eins-Formulierung blieb die Masse 21 Tage lang erhalten.

Eine Formulierung des TAPE im Verhältnis eins zu eins hielt unter diesen Bedingungen nur 13 Tage an. Anschließend wurde ein hämostatischer Test in vivo durchgeführt. Die mit TAPE versiegelte Leber wurde mit handelsüblichem Fibrinkleber verglichen.

Die mit TAPE versiegelte Leber blutete deutlich weniger als die mit Fibrinkleber versiegelte Leber. Wenn man die Herstellung von TAPE einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von fünf Minuten erfolgen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, das optimierte Verhältnis zwischen Tanninsäure und PEG einzuhalten, da dies die Adhäsionskraft von TAPE erheblich beeinflussen kann.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Biometrie den Weg, naturinspirierte Ansätze zur Lösung aktueller Probleme bei der Entwicklung wasserresistenter Klebematerialien zu erforschen. Obwohl diese Methode Einblicke in hämostatische Materialien ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie beispielsweise Gewebeklebstoffe zur Wundheilung oder implantierbare Pflaster zur Arzneimittelfreisetzung.