Ganzkörper-Massenspektrometrie Imaging durch Infrarot-Matrix-assistierte Laser-Desorptions-Elektrospray-Ionisations (IR-MALDESI)

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die wichtigsten Schritte zu beschreiben, die für die IR-MALDESI Massenspektrometrie-Bildgebung von Ganzkörpergewebeschnitten erforderlich sind. Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich der massenspektrometrischen Bildgebung effektiv beantworten, wie z. B. die räumliche Verteilung von endogenen und exogenen Analyten in mehreren Organen gleichzeitig. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie bei Atmosphärendruck arbeitet und die exogene Eismatrix dazu beiträgt, Schwankungen des Wassergehalts in verschiedenen Organen zu berücksichtigen.

Obwohl dieses Protokoll einen Einblick in eine gezielte Ganzkörperbildgebung bietet. Die Bildgebung der IR-MALDESI Massenspektrometrie kann auch für die gezielte und quantitative Analyse der Wirkstoffverteilung eingesetzt werden. Das folgende Protokoll beschreibt, wie IR-MALDESI MSI-Experimente durchgeführt werden.

Ausführliche Informationen über die optimierte Geometrie der IR-MALDESI-Quelle und ihre Synchronisation mit dem Laser, dem Tisch und dem Massenspektrometer finden Sie an anderer Stelle. Um die Probe vorzubereiten, tragen Sie Schutzhandschuhe und tragen Sie eine Schicht OCT-Einbettmedium auf eine 40-Millimeter-Kryostaten-Probenscheibe auf. Legen Sie dann vorsichtig eine gefrorene ganze Mausprobe auf den OCT-beschichteten Halter und richten Sie ihn zum Schneiden aus.

Die OCT wird ausschließlich verwendet, um das Gewebe an der Probenscheibe zu verkleben. Betten Sie das Gewebe nicht vollständig in das OCG ein. Legen Sie die Probenscheibe auf den Peltier-Probenhalter im Kryostaten.

Schalten Sie das Peltier ein und warten Sie 10 Minuten, bis sich die Probe äquilibriert hat. Legen Sie dann die Probenscheibe in den Scheibenhalter und richten Sie sie so aus, dass sie in die gewünschte Ebene geschnitten wird. Schneiden Sie die Probe bei 20 Grad Celsius bei z. B. 25 Mikron für die Ganzkörperanalyse.

Verwenden Sie die Anti-Roll-Glasplatte und verwenden Sie das Kryostat-Vakuum und die Bürsten, um unerwünschte Gewebereste zu entfernen. Nachdem das Gewebe durchtrennt wurde, bedecke die Klinge mit einem Klingenschutz. Richten Sie nun den gefrorenen Schnitt auf der Probenplatte aus und tauen Sie sie auf vorgereinigte Glasmikroskop-Objektträger auf.

Bringen Sie die Folien so nah wie möglich an die Abschnitte, ohne sie zu berühren. Bewahren Sie die montierten Objektträger im Kryostaten auf, bis die IR-MALDESI-Kalibrierung abgeschlossen ist, um die Kryokonservierung des Gewebes aufrechtzuerhalten. Schalten Sie zunächst den Laser im mittleren IR-Bereich ein und starten Sie die Lasersteuerungsanwendung.

Wählen Sie dann die gewünschte Wellenlänge. IR-MALDESI-Experimente werden typischerweise bei 2940 Nanometern durchgeführt. Schalten Sie als Nächstes den Stage-Controller ein und starten Sie das Steuerungsprogramm.

Kalibrieren Sie mit dem Programm die Tischposition mit der Home-Taste. Füllen Sie anschließend eine Ein-Milliliter-Spritze mit Elektrospray-Lösungsmittel und spülen Sie die Siliziumdioxidkapillare. Richten Sie dann den ESI-Emitter anhand der Quellparameter wie ESI-Spot-Abstand, Spot-Einlassabstand, Probenhöhe und Lösungsmittelflussrate auf den MS-Einlass aus.

Alle wurden mit Hilfe der statistischen DOE für die Analyse in Gewebeschnitten optimiert. Starten Sie nun das Elektrospray und bewerten Sie seine Stabilität für mindestens 10 Minuten. Überwachen Sie den Gesamtionenstrom, der zu diesem Zeitpunkt ausschließlich aus Umgebungsverbindungen besteht.

Eine Abweichung von weniger als 10 % über einen Zeitraum von 10 bis 15 Minuten zeigt an, dass das System stabil ist. Nachdem Sie das Elektrospray ausgeschaltet und sichergestellt haben, dass es ausgeschaltet ist, übertragen Sie einen Probenobjektträger vom Kryostaten auf die IR-MALDESI-Probenplatte. Treten Sie dann vom ESI-Strahler zurück und starten Sie den Elektrospray neu.

Schließen Sie die Zugangstür der IR-MALDESI-Quelle und spülen Sie das Gehäuse mit trockenem Stickstoff, um eine Kondensation von Wasser auf dem Gewebe zu verhindern. Sobald die relative Luftfeuchtigkeit im Gehäuse weniger als 3 % beträgt, schalten Sie die Gleichstromversorgung der Peltier-Platte auf etwa 12 Volt ein, um die Probenplatte auf 9 Grad Celsius zu kühlen. Stoppen Sie nach etwa 5-10 Minuten die Stickstoffspülung und öffnen Sie die Zugangstür zur Quelle, um das Gewebe der Umgebungsfeuchtigkeit auszusetzen.

Auf dem Tisch und dem montierten Gewebeschnitt bildet sich eine dünne Eisschicht. Wenn die Luft trocken ist, stellen Sie ein Becherglas mit warmem Wasser in das Gehäuse. Schließen Sie nun die Tür und starten Sie den Stickstofffluss neu, um die Luftfeuchtigkeit auf etwa 10 % zu reduzierenPassen Sie den Stickstofffluss nach Bedarf an, um während des Experiments eine stabile Eisschicht auf der Probe zu erhalten.

Verschieben Sie den Tisch mithilfe der Rastier-GUI an die Analyseposition, indem Sie auf die Schaltfläche LASER-Position klicken. Verwenden Sie die Einstelldiode des Lasers, um sicherzustellen, dass ein Bereich außerhalb des Gewebes abgeladen wird. Geben Sie dann eine Testaufnahme ab, um den Versatz des Lasers in Bezug auf die Kameraansicht zu kalibrieren.

Klicken Sie auf die Schaltfläche Laser Test Fire, um die Laserposition zu aktualisieren. Kehren Sie nun zur Kameraposition zurück und aktualisieren Sie die Laserposition in Rastier, indem Sie das Laserausrichtungsabsehen auf dem Laserablationspunkt platzieren. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche ROI und wählen Sie die gewünschte Region aus.

Fügen Sie einen Bereich außerhalb des Gewebes hinzu, der als Kontrolle dient. Verwenden Sie diesen Gewebeabschnitt für das Peak-Picking. Die Spotgröße des Lasers auf Gewebe beträgt etwa 150 Mikrometer.

Ein kleinerer Durchmesser ist bei Überprobenahme möglich. Geben Sie nun die entsprechenden experimentellen Parameter ein und benennen Sie die Massenspektrometer-Bildgebungsdatei in das Feld für den Projektnamen. Wählen Sie dann die entsprechende Laserfrequenz aus dem Dropdown-Feld aus.

In der Regel werden zwei Laserpulse pro Voxel bei 20 Hertz verwendet, um das Material vollständig zu desorbieren. Stellen Sie außerdem die Verzögerungszeit auf 10 Millisekunden ein, damit die Ionen Zeit haben, den Massenanalysator zu erreichen. Die Wiederholrate sollte auf das Maximum des Lasers eingestellt werden.

Wählen Sie nun in der Massenspektrometer-Software die Parameter des Massenspektrometers aus, wie z. B. den Ionisationsmodus, die Elektrospray-Spannung, die Lösungsmitteldurchflussrate, die Kapillartemperatur und die Injektionszeit. Sobald alle Parameter eingestellt sind, versetzen Sie das Massenspektrometer zur Synchronisation in den Handshake-Modus und starten Sie die Massenspektrometererfassung. Überprüfen Sie mit der Rastier-Imaging-Software, ob alle Schritte in der Checkliste ausgeführt wurden, und laden Sie dann das Programm.

Sobald die RUN-Taste verfügbar ist, starten Sie die MSI-Signalerfassung. Stoppen Sie nach Abschluss des bildgebenden Experiments die Erfassung des Massenspektrometers und versetzen Sie das Gerät in den Standby-Modus. Schalten Sie die Stickstoffspülung zum Gehäuse aus.

Schalten Sie den Stage-Controller aus. Schalten Sie die Stromversorgung der Peltier-Platte aus und schalten Sie den Laser aus. Öffnen Sie dann die Zugangstür.

Entfernen Sie die Eletrospray-Emitterspitze von der Innenseite des Quellengehäuses und tragen Sie Schutzhandschuhe, um den sehr heißen, verlängerten Metall-Massenspektrometer-Einlass zu entfernen. Reinigen Sie den Einlauf mit Handschuhen und Schutzbrille mit einem Ultraschallbad. Verwenden Sie zunächst 15% Salpetersäure für 10 Minuten.

Verwenden Sie dann 10 Minuten lang Wasser in HPLC-Qualität und zum Schluss 10 Minuten lang Methanol in HPLC-Qualität. Trocknen Sie den Metallkapillareinlass unter einem Stickstoffstrom und setzen Sie ihn für die zukünftige Analyse wieder in das Massenspektrometer ein. Die räumliche Verteilung der Metaboliten in verschiedenen Organen des Ganzkörpergewebes wurde mit der beschriebenen Methode analysiert.

Cholesterin wurde aufgrund seiner strukturellen Rolle in den Zellmembranen in allen Geweben beobachtet. Andere Lipidmetaboliten wiesen unterschiedliche Verteilungen innerhalb bestimmter Organe oder Gewebekompartimente auf. Zum Beispiel wurde beobachtet, dass einige Lipide, wie z. B. strafend zugeordnetes Desmosterol, eine spezifische Lokalisation im Gehirn aufweisen.

Während andere Lipide eine höhere Verteilung im Rückenmark aufwiesen. Und andere Lipide verteilten sich einheitlich über alle Organe außer dem Gehirn. Die IR-MALDESI Massenspektrometrie-Bildgebung ist eine bahnbrechende Technologie, die die relative und absolute Quantifizierung von Analyten in Geweben mit minimaler Probenvorbereitung bei Atmosphärendruck ermöglicht.

Sobald die Proben gemeistert sind, können alle Schritte der Probenvorbereitung in etwa 30 Minuten durchgeführt werden. Ein wichtiger Schritt bei der Probenvorbereitung ist die Bildung der Eismatrix, die eine effiziente Desorption von gewebebezogenem Material ermöglicht. Die Eismatrix hilft auch, Schwankungen des Wassergehalts in verschiedenen Organen zu berücksichtigen.

In Verbindung mit diesem Protokoll können ergänzende Analysen, wie z. B. histologische und immunhistochemische Färbungen des seriellen Schnitts, durchgeführt werden.