Cycloheximid Chase-Analyse von Proteinabbau in Saccharomyces cerevisiae

Die Proteinhäufigkeit spiegelt die Raten sowohl der Proteinsynthese als auch des Proteinabbaus wider. Dieser Artikel beschreibt die Verwendung von Cycloheximid-Chase gefolgt von Western Blotting zur Analyse des Proteinabbaus im einzelligen Modell-Eukaryoten Saccharomyces cerevisiae (knospende Hefe).

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Abbau der Steady-State-Population eines bestimmten Proteins in Saccharomyces cerevisiae sichtbar zu machen. Diese Methode kann verwendet werden, um die genetischen Anforderungen und Umwelteinflüsse auf den Abbau eines Proteins von Interesse zu bestimmen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass keine radioaktiven Isotope und langwierige Immunpräzipitationsschritte erforderlich sind, im Gegensatz zu Pulse-Chase-Techniken, die auch zur Visualisierung des Proteinabbaus verwendet werden.

Dieses Verfahren kann verwendet werden, um entweder ein endogenes Hefeprotein oder ein Protein, das aus einem Plasmid exprimiert wird, zu analysieren. Für letzteres wird der Hefestamm mit einem Plasmid transformiert, das für das Protein von Interesse kodiert, wobei ein Standard-Hefetransformationsprotokoll folgt. Die Hefe in fünf Milliliter geeignetem Medium impfen.

Über Nacht bei 30 Grad Celsius mit Rotation inkubieren. Messen Sie am nächsten Morgen die optische Dichte bei 600 Nanometern oder OD600 jeder Übernachtkultur. Verdünnen Sie die Kulturen auf einen OD600 von 0,2 in 15 Millilitern Frischmedium.

Inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius unter Schütteln, bis die Zellen die mittlere logarithmische Wachstumsphase erreichen. Während die Hefezellen wachsen, bereiten Sie sich auf das Cycloheximid-Chase-Verfahren vor. Stellen Sie einen Heizblock ein, der konische Röhrchen von 15 Millilitern aufnehmen kann, auf 30 Grad Celsius für die Inkubation von Zellen in Gegenwart von Cycloheximid.

Um eine effiziente Wärmeverteilung auf die Kulturen zu gewährleisten, fügen Sie Wasser zu jeder Vertiefung des Wärmeblocks hinzu, so dass ein konisches 15-Milliliter-Rohr den Wasserstand bis zum Rand der Vertiefung ansteigen lässt, aber nicht überläuft. Stellen Sie einen zweiten Heizblock ein, der 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen aufnehmen kann, auf 95 Grad Celsius für die Proteindenaturierung nach der Zelllyse. Frisches Medium bis 30 Grad Celsius vorwärmen.

Pro zu testender Kultur werden 1,1 Milliliter Medium benötigt. Geben Sie 50 Mikroliter 20x Stop Mix in vormarkierte Mikrozentrifugenröhrchen. Bereiten Sie ein Röhrchen pro Zeitpunkt und Kultur vor, das untersucht werden soll.

Lege die Röhren auf Eis. Wenn die Hefezellen das mittlere logarithmische Wachstum erreicht haben, entnehmen Sie 2,5 OD600-Einheiten jeder Kultur pro zu testendem Zeitpunkt. Eine OD600-Einheit entspricht der Menge an Hefe, die in einem Milliliter Kultur bei einem OD600 von 1,0 vorhanden ist.

Die gesammelten Zellen werden in konischen 15-Milliliter-Röhrchen bei 3.000 g bei Raumtemperatur zwei Minuten lang zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand. Jedes Zellpellet wird in einem Milliliter 30 Grad Celsius frischem Wachstumsmedium pro 2,5 OD600 Zelleinheiten resuspendiert.

Bevor Sie mit der Cycloheximid-Jagd beginnen, äquilibrieren Sie die Hefezellsuspensionen, indem Sie sie fünf Minuten lang in dem 30 Grad Celsius heißen Wärmeblock inkubieren. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist der Zeitpunkt der Zugabe von Cycloheximid und der Entnahme von Zellen für jede Probe. Wir stellen den Erfolg sicher, indem wir einen Zeitplan für die Zugabe von Cycloheximid und die Entnahme von Zellen festlegen und einhalten.

Um die Cycloheximid-Verfolgungsjagd zu starten, drücken Sie "Start" auf dem Timer. Cycloheximid in einer Endkonzentration von 250 Mikrogramm pro Milliliter schnell, aber vorsichtig in die erste Hefezellsuspension geben und kurz zum Mischen einwirbeln. Sofort 950 Mikroliter oder ca. 2,4 OD600 Einheiten der Hefezellsuspension mit zugesetztem Cycloheximid in ein vormarkiertes Mikrozentrifugenröhrchen mit 50 Mikrolitern eiskaltem 20x Stop Mix überführen.

Das Mikrozentrifugenröhrchen verwirbeln und auf Eis legen, bis alle Proben gesammelt sind. Beginnen Sie die Cycloheximid-Verfolgung, wie für jede der verbleibenden Hefezellsuspensionen in regelmäßigen Zeitabständen gezeigt. Zu jedem weiteren Zeitpunkt die Hefezellsuspensionen vortexen und 950 Mikroliter in markierte Mikrozentrifugenröhrchen mit 50 Mikrolitern vorgekühltem 20x Stop Mix überführen.

Vortex und legen Sie die gesammelten Zellen auf Eis. Um ein Absetzen der Hefezellen zu verhindern, werden die Zellsuspensionen während der gesamten Verfolgungsjagd etwa alle fünf Minuten in den konischen 15-Milliliter-Röhrchen vortext. Wenn alle Proben gesammelt wurden, pelletieren Sie die gesammelten Zellen durch Zentrifugation bei 6.500 g und Raumtemperatur für 30 Sekunden.

Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren oder Aspiration. Die Zellen sind nun bereit für die alkalische Lyse. Bereiten Sie die Zellen für die alkalische Lyse vor, indem Sie jedem Zellpellet 100 Mikroliter destilliertes Wasser hinzufügen, und suspendieren Sie sie durch Auf- und Abpipettieren wieder.

Geben Sie 100 Mikroliter 0,2 molares Natriumhydroxid zu jeder Probe. Durch Vortexen mischen. Inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Zu diesem Zeitpunkt sind die Hefezellen noch nicht lysiert und die Proteine wurden noch nicht freigesetzt. Anschließend werden die Zellen durch Zentrifugation bei 18.000 g bei Raumtemperatur für 30 Sekunden pelletiert. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren oder Aspiration.

Um die Zellen zu lysieren, fügen Sie jedem Zellpellet 100 Mikroliter Laemmli Sample Buffer hinzu. Durch Auf- und Abpipettieren wieder suspendieren. Inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius, um die Proteine vollständig zu denaturieren.

Zentrifugieren Sie die Lysate bei 18.000 g und Raumtemperatur für eine Minute, um unlösliches Material zu pelletieren. Der Überstand, bei dem es sich um ein solubilisiertes extrahiertes Protein handelt, ist bereit für die Trennung durch SDS PAGE und die anschließende Western-Blot-Analyse. Alternativ können die Lysate bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.

Die Stabilität von Deg1-Sec62, einem Modell-Hefe-Endoplasma-Retikulum-assoziierten Abbausubstrat, wurde mit Hilfe der Cycloheximid-Chase-Methode analysiert. Das Deg1-Sec62-Protein migriert auf SDS PAGE in mehreren Spezies und wird in Wildtyp-Zellen leicht abgebaut. Pgk1 ist eine Belastungskontrolle, deren Abundanz unter den untersuchten Bedingungen nicht variiert.

Der Verlust entweder der ER-residenten Ubiquitin-Ligase hrd1 oder des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms ubc7 stabilisierte das Deg1-Sec62-Protein im Wesentlichen, was die zuvor beobachtete Rolle dieser Proteine beim Abbau von Deg1-Sec62 bestätigt. Cue1 ist ein Transmembranprotein, das ubc7 an der ER-Membran verankert und das Enzym aktiviert, aber eine Notwendigkeit für cue1 beim Abbau von Deg1-Sec62 wurde nicht direkt untersucht. Die Beobachtung aus dieser Studie, dass Deg1-Sec62 in Abwesenheit von cue1 stabilisiert war, bestätigte eine Rolle von cue1 bei der ER-assoziierten Degradation von Deg1-Sec62.

Das Ergebnis des Western Blots wurde mit Hilfe einer Bildgebungssoftware quantifiziert. Um die Häufigkeit des Deg1-Sec62-Proteins zwischen den Proben zu vergleichen, wurde für jede Probe ein Verhältnis der angepassten Signalintensitäten von Deg1-Sec62 zu Pgk1 bestimmt. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass dieses Verfahren am direktesten über die Abbaukinetik einer Steady-State-Population eines Proteins von Interesse berichtet.

Um den Abbau der entstehenden Population eines interessierenden Proteins zu visualisieren, können andere Techniken, wie z. B. Pulse-Chase-Experimente, verwendet werden. Vergessen Sie nicht, dass Cycloheximid und Natriumazid extrem giftig sind und Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, um den direkten Kontakt mit diesen Chemikalien während der Durchführung dieses Verfahrens zu vermeiden.