Name: Cycloheximid Chase-Analyse von Proteinabbau in Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Erfahren Sie die Cycloheximid-Chase-Analyse zur Untersuchung des Proteinabbaus in Saccharomyces cerevisiae. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung spezifischer Proteine ohne radioaktive Isotope.

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Die Autoren danken aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Rubenstein-Labors für die Bereitstellung einer unterstützenden und enthusiastischen Forschungsumgebung. Die Autoren danken Mark Hochstrasser (Yale University) für die Bereitstellung von Reagenzien und Fachwissen. E.M.R. dankt Stefan Kreft (Universität Konstanz) und Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) für die Bereitstellung von unschätzbarem Fachwissen in der kinetischen Analyse von Proteinen. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health (R15 GM111713) an E.M.R., einen ASPiRE-Forschungspreis der Ball State University für E.M.R., einen Forschungspreis des Ball State University Chapter von Sigma Xi an S.M.E. und Mittel des Ball State University Provost's Office und des Department of Biology unterstützt.

1. Wachstum und Ernte von Hefezellen <ol><li> Wenn nicht Abbaukinetik eines endogenen Hefe-Proteins zu analysieren, umwandeln gewünschten Hefestamm (s) mit einem Plasmid, das das interessierende Protein kodiert. Zuverlässige Methoden für die Transformation von Hefe wurden 37 zuvor beschrieben wurde . </li><li> Beimpfen von Hefe in 5 ml geeigneten Medium (beispielsweise eine selektive synthetische definiert (SD) Medium für Plasmiderhaltung von transformierten Zellen oder nicht-selektiven Hefeextrakt-Pepton-Dextrose (YPD) Medium für nicht-transformierte Zellen). über Nacht bei 30 ° C inkubieren, drehen. HINWEIS: 30 ° C ist die optimale Wachstumstemperatur für typische Wildtyp - Labor Hefestämme 38. Da jedoch einige mutanten Hefestämmen nicht wachsen optimal bei 30 ° C und einige Proteine ​​unterzogen werden temperaturabhängige Abbau die Temperaturen empirisch 39 bestimmt werden für Hefe Zellwachstum und Cycloheximid chase verwendet sollte. </li><li> Messen Sie the optischen Dichte bei 600 nm (OD 600) jeder Übernachtkultur. HINWEIS: Die Zellen können in logarithmischen oder stationären Wachstumsphase sein , aber minimal eine Dichte erreicht haben , sollte die Verdünnung bis zu einer OD 600 ermöglichen = 0,2 in 15 ml frisches Medium. </li><li> Verdünne die Nacht - Kulturen auf eine OD 600 - Wert von 0,2 in 15 ml frisches Medium. </li><li> Inkubieren Hefe bei 30 ° C, Schütteln , bis die Zellen mittleren logarithmischen Wachstumsphase (dh eine OD 600 zwischen 0,8 und 1,2) erreichen. </li><li> Während des Zellwachstums Hefe, führen Sie die folgenden in Vorbereitung auf die Cycloheximid chase Verfahren: <ol><li> Stellen Sie einen Wärmeblock, der 15 ml konische Röhrchen auf 30 ° C für die Inkubation von Zellen in Gegenwart von Cycloheximid aufnehmen kann. Zugabe von Wasser zu den Vertiefungen der Heizblock eine effiziente Wärmeverteilung zu den Kulturen zu ermöglichen. Fügen Sie Wasser zu jeder Vertiefung, so dass eine 15 ml konischen Röhrchen wird der Wasserspiegel führen zu steigen, aber nicht überlaufen, um die Lippe des Brunnens. </li><li> Legen Sie einen zweiten Wärmeblock, der 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen auf 95 ° C für Eiweißdenaturierung folgende Zell-Lyse aufnehmen kann. </li><li> Pre-warmes frisches Wachstumsmedium (1,1 ml pro Zeitpunkt pro Kultur getestet werden) bis 30 ° C. </li><li> In 50 ul 20x Stop-Mix zu vormarkiert Mikrozentrifugenröhrchen (ein Röhrchen pro Zeitpunkt pro Kultur getestet werden). Die Röhrchen auf Eis. VORSICHT: Natriumazid, ein Bestandteil in 20x Stop-Mix, ist giftig über die orale Einnahme oder Hautkontakt. Folgen Sie den Empfehlungen des Herstellers bei der Vorbereitung, Lagerung und Umgang mit Natriumazid. Im Falle versehentlicher Exposition, konsultieren Sicherheitsdatenblatt des Herstellers zur Verfügung gestellt. </li></ol></li><li> Wenn die Zellen mittleren logarithmischen Wachstum erreicht haben, sammeln 2,5 OD 600 Einheiten jeder Kultur pro Zeitpunkt zu untersuch (zB 7,5 OD 600 Einheiten Proteinmenge zu drei Zeitpunkten zu analysieren). Zentrifuge gesammelten Zellen in 15 ml konischen Röhrchen bei 3,000 × g bei Raumtemperatur für 2 min. HINWEIS: Eine OD600 - Einheit entspricht der Menge Hefe , die in 1 ml Kultur bei einer OD 600 von 1,0. V = X OD 600 Einheiten / Mess OD 600: Das Volumen der Kultur (in ml) erforderlich X OD 600 Einheiten (V) zu ernten kann durch Verwendung der folgenden Gleichung bestimmt werden. Beispielsweise zur Ernte 7,5 OD 600 Einheiten von Hefe - Zellkultur bei einer OD 600 von 1,0, sammeln 7,5 OD 600 Einheiten / 1,0 = 7,5 ml Hefekultur. </li><li> Resuspendieren jedes Zellpellet in 1 ml 30 ° C (vorgewärmte) frisches Wachstumsmedium pro 2,5 OD 600 Einheiten von Zellen (beispielsweise 3 ml 7,5 OD 600 - Einheiten). </li></ol> 2. Cycloheximide Chase <ol><li> Hefe-Zellsuspensionen durch Inkubation für 5 min bei 30 ° C Heizblock äquilibrieren. </li><li> Bereiten Sie einen Timer von 0:00 aufwärts zu zählen. </li><li> Um die Cycloheximid Jagd, drücken Sie &quot;Start&quot; auf dem Timer beginnen. Schnell,aber sorgfältig, führen Sie die folgenden Schritte aus: <ol><li> Hinzufügen Cycloheximid zu einer Endkonzentration von 250 ug / ml zur ersten Hefezelle Suspension (beispielsweise hinzu 37,5 ul 20 mg / ml Cycloheximid Lager zu 3 ml der Zellsuspension) und vortex kurz zu mischen. ACHTUNG: Cycloheximid ist ein reizend Haut und ist toxisch bei der oralen Einnahme. Folgen Sie den Empfehlungen des Herstellers bei der Vorbereitung, Lagerung und Handhabung Cycloheximid. Im Falle versehentlicher Exposition, konsultieren Sicherheitsdatenblatt des Herstellers zur Verfügung gestellt. </li><li> Unmittelbar nach Cycloheximid und Verwirbelung Zugabe, Transfer 950 ul (~ 2,4 OD 600 Einheiten) der Hefe - Zellsuspension mit zusätzlichem Cycloheximid zu einem vorher markierten Mikrozentrifugenröhrchen 50 ul eiskaltes 20x Stop Mix. Vortex, um die Mikrozentrifugenröhrchen, und auf Eis, bis alle Proben gesammelt worden sind. </li><li> Liefert die Hefe-Zellsuspension auf 30 ° C. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.3.1 bis 2.30,3 für jede der verbleibenden Hefezelle Suspensionen in regelmäßigen Zeitintervallen (beispielsweise alle 30 sec, so daß Cycloheximid hinzugefügt # 1 um 0:00, Probe # 2 bei 0.30, Probe # 3 um 1:00 bis Probe usw.). </li><li> Bei jedem nachfolgenden Zeitpunkt, Wirbel Hefezelle Suspensionen und Transfer 950 ul an markierte Mikrozentrifugenröhrchen 50 ul vorgekühlten 20x Stopp Mix enthält. Vortex und Ort gesammelten Zellen auf Eis. Rück 15 ml konische Röhrchen auf 30 ° C Heizblock. <ol><li> Beispielsweise für die Sammlung von Zellen 30 min nach Zugabe Cycloheximid (unter der Annahme von 30-sec Intervallen zwischen Cycloheximid neben Hefe-Zellsuspensionen zu Beginn des Zeitverlaufs), Vortexen und entfernen 950 &amp; mgr; l der Zellsuspension aus Probe # 1 bei 30:00 . Wiederholen für Probe # 2 bei 30:30, und so weiter. ANMERKUNG: Um zu verhindern, von Hefe Absetzen vortex Zellsuspensionen in 15 ml konische Röhrchen etwa alle 5 min im Verlauf des chase. Alternativ Hefe Zellsuspensions kann in einem kontinuierlich Rühren Wasserbad für die Dauer des Experiments Cycloheximid chase aufrechterhalten werden. </li></ol></li><li> Wenn alle Proben gesammelt worden sind, gesammelt Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 6.500 × g bei Raumtemperatur für 30 sec. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren oder Absaugen. Die Zellen sind nun bereit für die alkalische Lyse. Alternativ Snap-freeze-Zellen in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C pelletiert. </li></ol> 3. Post-alkalische Proteinextraktion (Modified aus 16,40) <ol><li> Füge 100 &amp; mgr; l destilliertes Wasser zu jedem Zellpellet. Resuspendieren durch Auf- und Abpipettieren oder Verwirbelung. </li><li> Zugabe von 100 ul 0,2 M NaOH zu jeder Probe. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren oder Verwirbelung. </li><li> Inkubieren suspendierten Zellen bei Raumtemperatur für 5 min. In diesem Stadium haben Hefezellen nicht lysiert, und die Proteine ​​wurden nicht 40 freigegeben. </li><li> Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 18.000 × g bei Raum Temperamenttur für 30 Sekunden. Überstand entfernen durch Pipettieren oder Absaugen. </li><li> Um lysieren Zellen, 100 &amp; mgr; l Laemmli-Probenpuffer zu jedem Zellpellet. Resuspendieren durch Auf- und Abpipettieren oder Verwirbelung. HINWEIS: Sequential Inkubation von Zellen mit NaOH und Laemmli-Probenpuffer Freisetzungen Proteine ​​in einer Form kompatibel mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) mit einem Tris-Glycin-Laufpuffersystem verwendet wird. </li><li> bei 95 ° C inkubieren 5 min voll Proteine ​​zu denaturieren. HINWEIS: Die Inkubation bei 95 ° C kann nicht für die Analyse von Proteinen geeignet sein , die zur Aggregation neigen (beispielsweise Proteine ​​mit mehreren transmembrane segments). Diese Proteine ​​können unlöslich werden , wenn sie bei erhöhten Temperaturen 41 inkubiert. So kann für die Analyse derartiger Proteine ​​sollten Lysate bei niedrigeren Temperaturen (zB 37 ° C - 70 ° C) inkubiert, für 10 bis 30 min, wie empirisch ermittelt. </li><li> Centrifuge Lysate bei 18.000 × g bei room Temperatur 1 min unlösliche Material zu pelletieren. Der Überstand (solubilisiert extrahierte Protein) bereit ist für die Trennung durch SDS-PAGE und anschließendem Western-Blot-Analyse. Alternativ speichern Lysate bei -20 ° C. </li></ol> 4. Repräsentative SDS-PAGE und Western Blot - Verfahren (Angepasst von 16) <ol><li> Lastproteinmolekulargewichtsstandards und empirisch ermittelten Volumen der Lysate auf einem SDS-PAGE-Gel. HINWEIS: Wählen Sie den Prozentsatz von Acrylamid und Bisacrylamid im Gel SDS-PAGE, bezogen auf das Molekulargewicht des Proteins von Interesse. In der Regel niedriger sind Prozentsatz Gele besser geeignet für höhermolekulare Proteine ​​zu lösen. </li><li> Führen Gel bei 200 V, bis die Farbstofffront hat den unteren Rand des Gels erreichte. </li><li> Transferproteine ​​aus dem Gel auf Polyvinylidenfluorid (PVDF) -Membran durch Nasstransfer bei 20 V für 60 bis 90 min bei 4 ° C. </li><li> Block Membran durch Inkubation in Tris-gepufferter Saline (TBS), enthaltend 5% Magermilch, schaukeln, bei Raumtemperatur für 1 Stunde oder bei 4 ° C über Nacht. ANMERKUNG: Um das mikrobielle Wachstum in Gegenwart einer Membran über Nacht inkubiert verhindern, wird empfohlen, Natriumazid in der Blockierungslösung bei einer Endkonzentration von 0,02% enthalten. </li><li> Inkubieren Membran mit primärem Antikörper, der spezifisch für Protein von Interesse in TBS mit 0,1% Tween-20 (TBS / T) und 1% Magermilch, schaukeln, bei Raumtemperatur für 1 Std. </li><li> Waschen Sie die Membran bei Raumtemperatur 3 x 5 min mit TBS / T, zu schaukeln. </li><li> Inkubieren Membran mit geeigneten Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper in TBS / T mit 1% Magermilch bei Raumtemperatur für 1 Stunde, zu schaukeln. HINWEIS: Fluorophore sind lichtempfindlich. Deshalb, um Fluorophoren konjugiert Verdünnungen von Antikörpern sollte im Dunkeln hergestellt werden, und die Inkubation der Membranen in der Gegenwart von Antikörpern gegen Fluorophore und nachfolgende Waschschritte in konjugiert lichtundurchlässigen (beispielsweise folienumwickelte) co auftretenntainers. </li><li> Waschen Sie die Membran bei Raumtemperatur 3 x 5 min mit TBS / T, zu schaukeln. </li><li> Bild Membran mit LI-COR Odyssey CLx und Bild-Studio-Software (oder einem vergleichbaren Bildgeräte und Software), nach den Empfehlungen des Herstellers. </li><li> Membran Bild Nach dem Erwerb, Inkubation der Membran mit einem primären Antikörper, der spezifisch für eine Ladekontrollprotein in TBS / T mit 1% Magermilch bei Raumtemperatur für 1 Stunde, schaukeln. </li><li> Waschen Sie die Membran bei Raumtemperatur 3 x 5 min mit TBS / T, zu schaukeln. </li><li> Inkubieren Membran mit geeigneten Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper in TBS / T mit 1% Magermilch bei Raumtemperatur für 1 Stunde, zu schaukeln. </li><li> Waschen Sie die Membran bei Raumtemperatur 3 x 5 min mit TBS / T, zu schaukeln. </li><li> Bild Membran, wie in Schritt 4.9. </li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In diesem Dokument wird ein Verfahren Protein Abbaukinetik zur Analyse dargestellt. Diese Technik kann leicht zu einer Reihe von Proteinen, die durch eine Vielzahl von Mechanismen abgebaut angewendet werden. Es ist wichtig zu beachten, daß Cycloheximid chase-Experimente berichten über Abbaukinetik des steady state Pool eines bestimmten Proteins. Andere Techniken können die Abbaukinetik von spezifischen Populationen von Proteinen zu analysieren. Zum Beispiel kann die degradative Schicksal von naszierenden Polypeptiden du...

Proteine ​​erfüllen wichtige Funktionen in praktisch jeder zelluläre Prozess. Viele physiologische Prozesse erfordern die Anwesenheit eines spezifischen Proteins (oder Proteine) für einen definierten Zeitraum oder unter bestimmten Umständen. Organismen deshalb überwachen und Proteinmenge regulieren die zelluläre Bedürfnisse 1 erfüllen. Zum Beispiel Cycline (Proteine, die Zellteilung kontrollieren) vorhanden sind , in bestimmten Phasen des Zellzyklus und der Verlust der geregelten cyclin Ebenen hat mit malignen Tumorbildung 2 verbunden. Zusätzlich Proteinspiegel zu regulieren zelluläre Bedürfnisse zu erfüllen, verwenden Zellen zersetzenden Qualitätskontrollmechanismen misfolded, unmontiert oder auf andere Weise anomale Proteinmoleküle 3 zu beseitigen. Kontrolle der Proteinmenge beinhaltet Regulierung sowohl makromolekularen Synthese (Transkription und Translation) und Abbau (RNA Zerfall und Proteolyse). Beeinträchtigte oder übermäßige trägt Proteinabbau zu mehreren PathologienEinschließlich Krebs, Mukoviszidose, neurodegenerativen Erkrankungen und Herz - Kreislauf - Erkrankungen 4-8. Proteolytischen Mechanismen stellen somit vielversprechende therapeutische Ziele für eine Reihe von Krankheiten 12.09. Analyse von Proteinen in einem einzigen Zeitpunkt (zB durch Western - Blot - 13, Durchflusszytometrie 14 oder Fluoreszenzmikroskopie 15) stellt eine Momentaufnahme der steady state Proteinmenge , ohne dass die relativen Beiträge der Synthese oder Abbau offenbaren. Ähnlich wachstums basierten Reporterassays reflektieren steady state - Proteinspiegel über einen längeren Zeitraum ohne 15-20 zwischen den Einflüssen der Synthese und Abbau zu unterscheiden. Es ist möglich , den Beitrag der degradative Prozesse steady state - Proteinspiegel durch Überfluß Vergleich zu schließen , vor und nach der spezifischen Komponenten des Mechanismus degradative Hemmen (beispielsweise durch die pharmakologisch Prote inaktivierendeasome 21 oder ein Gen vermutet , Ausschlagen zu 13 Abbau erforderlich). Eine Änderung in steady state - Proteinspiegel nach Abbauwege sorgt für den Beitrag der Proteolyse zur Kontrolle der Proteinmenge 13 starke Beweise hemmen. Allerdings ist eine solche noch eine Analyse keine Informationen über die Kinetik des Proteinumsatzes bereitstellen. Durch Western - Blot gefolgt Cycloheximide Chase überwindet diese Schwächen , indem Forscher Proteinabbau im Laufe der Zeit von 22 bis 24 sichtbar zu machen. Ferner wird in der Regel durch Western - Blot, radioaktive Isotope und langwierige Immunpräzipitation Schritte sind nicht erforderlich , für Cycloheximid Jagd, im Gegensatz zu vielen häufig verwendeten Puls chase Techniken, die auch durchgeführt werden , zu visualisieren Proteinabbau 25 durchgeführt , da Proteindetektion folgende Cycloheximid Jagd. Cycloheximide wurde zuerst als eine Verbindung mit Anti-Pilz richtige identifiziertBindungen von den grampositiven Bakterium Streptomyces griseus 26,27 erzeugt. Es ist eine zellpermeable Molekül , das spezifisch eukaryotische cytosolischen hemmt (aber nicht organellären) Übersetzung von der ribosomalen Translokation 28-31 beeinträchtigen. In einem Cycloheximid chase Experiment wird Cycloheximid zu Zellen zugesetzt, und Aliquote der Zellen werden sofort und zu bestimmten Zeitpunkten nach der Zugabe der Verbindung 22 gesammelt. Die Zellen werden lysiert und Proteinmenge zu jedem Zeitpunkt, typischerweise durch Western-Blot analysiert. Vermindert in Proteinmenge nach der Zugabe von Cycloheximid kann getrost auf den Proteinabbau zurückzuführen. Ein instabiles Protein wird in Hülle und Fülle im Laufe der Zeit ab, während ein relativ stabiles Protein wenig Veränderung in Hülle und Fülle aufweisen wird. Mechanismen der selektiven Proteinabbau wurden in ganz Eukarya hoch konserviert. Vieles von dem, was über den Proteinabbau bekannt ist, wurde zum ersten Mal gelernt, indas Modell einzelliger Eukaryonten, Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) 25,32-36. Studien mit Hefe sind wahrscheinlich neue und wichtige Einblicke in Proteinabbau fortzusetzen bereitstellt. Verfahren zur Cycloheximid chase in Hefe durch Western-Blot-Analyse der Proteinmenge, gefolgt Zellen wird hier vorgestellt.

<table><tbody><tr><td>Gewünschte Hefestämme, Plasmide, Standardmedium und Pufferkomponenten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Borosilikatglasröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>Erhältlich von einer Vielzahl von Herstellern</td></tr><tr><td>Temperaturgeregelter Inkubator (z.B. Heratherm Inkubator Modell IMH180)</td><td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>Erhältlich von einer Vielzahl von Herstellern</td></tr><tr><td>New Brunswick Austauschbare Trommel für 18-mm-Röhrchen (Röhrchenrolle)</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-0450</td><td>Eine Röhrchenrolle wird empfohlen, um Starterkulturen von Hefezellen über Nacht in Suspension zu halten. Wenn eine Röhrchenwalze nicht verfügbar ist, kann alternativ ein Plattformschüttler in einem temperaturgesteuerten Inkubator für Starterkulturen über Nacht verwendet werden. Ein Plattformschüttler oder eine Röhrchenrolle kann verwendet werden, um größere Kulturen in Suspension zu halten.</td></tr><tr><td>New Brunswick TC-7 Walzentrommel 120 V 50/60 H</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-4004</td><td>Zur Verwendung mit Rohrwalze</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spektralphotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>Von verschiedenen Herstellern erhältlich</td></tr><tr><td>Zentrifuge 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216&nbsp;</td><td>Der Rotor, der mit dem Gerät verkauft wird, fasst 1,5 und 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Rotor kann gegen einen Rotor ausgetauscht werden, der 15 und 50 ml konische Röhrchen fasst</td></tr><tr><td>Festwinkelrotor F-35-6-30 mit Deckel und Adaptern für Zentrifuge Modell 5430/R, 15/50 ml konische Röhrchen, 6-fach</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Siebdruck-Schraubverschlussröhrchen 17 x 20 mm konisch, Polypropylen</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>Erhältlich von einer Vielzahl von Herstellern</td></tr><tr><td>1,5 ml Flex-Röhrchen, PCR-saubere, natürliche Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>Erhältlich von einer Vielzahl von</td></tr><tr><td>Herstellern Analoge Dri-Bad-Heizgeräte</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>Es wird empfohlen, zwei Heizgeräte zur Verfügung zu stellen (einen zum Inkubieren von Zellen während der Cycloheximid-Behandlung und einen zum Kochen von Lysaten zur Denaturierung von Proteinen). Alternativ 30 Grad C-Wasserbad kann zur Inkubation von Zellen in Gegenwart von Cycloheximid verwendet werden. Ein kochendes Wasserbad mit Heizplatte kann alternativ zur Denaturierung von Proteinen verwendet werden.</td></tr><tr><td>Heizblock für 12 x 15 ml konische Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-473-70</td><td>Zur Verwendung mit Dri-Bath Heater während der Inkubation von Zellen in Gegenwart von Cycloheximid.</td></tr><tr><td>Heizblock für 20 x 1,5 ml konische Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-9Q</td><td>Zur Verwendung mit Dri-Bath Heater zum Kochen von Lysaten für die Proteindenaturierung.</td></tr><tr><td>SDS-PAGE Betriebs- und Übertragungsgeräte, Netzteile und bildgebende Geräte oder Dunkelkammern für SDS-PAGE und Übertragung auf Membran</td><td></td><td></td><td>Variiert je nach Labor und Anwendung</td></tr><tr><td>Western-Blot-Bildgebungssystem (z. B. Li-Cor Odyssey CLx Scanner und Image Studio Software)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>Variiert je nach Labor und Anwendung</td></tr><tr><td>EMD Millipore Immobilon PVDF-Transfermembranen</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>Variiert je nach Labor und Anwendung</td></tr><tr><td>Primäre Antikörper (z. B. Phosphoglyceratkinase (Pgk1) Monoklonaler Antikörper, Maus (Klon 22C5D8))</td><td>Life Technologies</td><td>459250</td><td>Variiert je nach Labor und Anwendung</td></tr><tr><td>Sekundäre Antikörper (z. B. Alexa-Fluor 680 Kaninchen Anti-Maus IgG (H + L))Life</td> <td>Technologies</td><td>A-21065</td><td>Variiert je nach Labor und Anwendung</td></tr></tbody></table>

cycloheximid chase-analyse von proteinabbau in<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation der Proteinmenge ist entscheidend für nahezu jeden zellulären Prozess. Protein Fülle spiegelt die Integration der Geschwindigkeiten der Proteinsynthese und Proteinabbau. Viele Tests auf Proteinmenge Berichterstattung (zB Single-Zeitpunkt Western - Blot, Durchflusszytometrie, Fluoreszenzmikroskopie oder wachstumsbasierten Reporter - Assays) keine Diskriminierung der relativen Auswirkungen der Übersetzung und Proteolyse auf Protein - Ebene ermöglichen. Dieser Artikel beschreibt die Verwendung von Cycloheximid durch Western - Blot gefolgt Chase speziell Proteinabbau im Modell einzelliger Eukaryonten, Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) zu analysieren. In diesem Verfahren werden Hefezellen in Gegenwart des Translationsinhibitor Cycloheximid inkubiert. Aliquots von Zellen unmittelbar nach und in bestimmten Zeitpunkten nach der Zugabe von Cycloheximid gesammelt. Die Zellen werden lysiert und die Lysate werden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt for Westernblot-Analyse von Proteinmenge zu jedem Zeitpunkt. Die Cycloheximid chase Verfahren ermöglicht die Visualisierung der Abbaukinetik der Steady-State-Population einer Vielzahl von zellulären Proteinen. Das Verfahren kann die genetische Anforderungen und Umwelteinflüsse auf den Proteinabbau zu untersuchen, verwendet werden.

Zu Cycloheximid chase Methodik, die Stabilität der deg1 -Sec62 (Abbildung 1), ein Modell Hefe endoplasmatischen Retikulum (ER) -assoziierten Degradation (ERAD) -Substrat wurde 42-44 veranschaulichen analysiert. In ERAD, Qualitätskontrolle Ubiquitin-Ligase-Enzyme kovalent an die ER-Membran lokalisiert Ketten des kleinen Proteins Ubiquitin an anomale Proteine ​​anhängen. Solche polyubiquitylated Proteine ​​werden anschließend aus dem ER und durch das Pr...

Die Proteinhäufigkeit spiegelt die Raten sowohl der Proteinsynthese als auch des Proteinabbaus wider. Dieser Artikel beschreibt die Verwendung von Cycloheximid-Chase gefolgt von Western Blotting zur Analyse des Proteinabbaus im einzelligen Modell-Eukaryoten Saccharomyces cerevisiae (knospende Hefe).

Cycloheximid Chase-Analyse von Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Abbau der stationären Population eines bestimmten Proteins in Saccharomyces cerevisiae sichtbar zu machen. Diese Methode kann verwendet werden, um die genetischen Voraussetzungen sowie die Auswirkungen der Umweltbedingungen auf den Abbau eines Proteins der Untersuchung zu bestimmen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass im Gegensatz zu Pulse-Chase-Methoden, die ebenfalls zur Visualisierung des Proteinabbaus eingesetzt werden, keine radioaktiven Isotope und zeitaufwändigen Immunpräzipitationsschritte erforderlich sind.Dieses Verfahren kann verwendet werden, um entweder ein endogenes Hefe-Protein oder ein Protein, das von einem Plasmid exprimiert wird, zu analysieren. Für letzteres wird der Hefestamm mit einem Plasmid transformiert, das das Protein der Interesse kodiert, gemäß einem standardmäßigen Hefe-Transformationsprotokoll. Inokulieren Sie die Hefe in fünf Millilitern geeignetem Medium.Inkubieren Sie über Nacht bei 30 Grad Celsius mit Rotation. Messen Sie am folgenden Morgen die optische Dichte bei 600 Nanometern (OD600) jeder Übernachtkultur. Verdünnen Sie die Kulturen auf eine OD600 von 0,2 in 15 Milliliter frischem Medium.Inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius unter Schütteln, bis die Zellen die mittlere logarithmische Wachstumsphase erreichen. Während die Hefezellen wachsen, bereiten Sie den Cycloheximid-Chase-Versuch vor. Stellen Sie ein Heizblock, das 15-Milliliter-Konizialröhrchen aufnehmen kann, auf 30 Grad Celsius ein, um die Zellen in Gegenwart von Cycloheximid zu inkubieren.Um eine effiziente Wärmeverteilung an die Kulturen sicherzustellen, geben Sie Wasser in jedes Loch des Heizblocks, sodass der Wasserspiegel durch ein 15-Milliliter-Konischgefäß bis an den Rand des Lochs ansteigt, jedoch nicht überläuft. Stellen Sie einen zweiten Heizblock, der 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen aufnehmen kann, für die Proteindenaturierung nach der Zelllyse auf 95 Grad Celsius ein. Wärmen Sie frisches Wachstumsmedium auf 30 Grad Celsius vor. Für jeden Zeitpunkt und jede zu analysierende Kultur werden 1,1 Milliliter Medium benötigt. Geben Sie 50 Mikroliter 20x Stop-Mix-Lösung in vorbeschriftete Mikrozentrifugenröhrchen. Bereiten Sie ein Röhrchen pro Zeitpunkt und Kultur zur Analyse vor.Stellen Sie die Röhrchen auf Eis. Wenn die Hefezellen das mittlere logarithmische Wachstum erreicht haben, sammeln Sie pro Zeitpunkt 2,5 OD600-Einheiten jeder Kultur für den Assay. Eine OD600-Einheit entspricht der Menge an Hefe, die in einem Milliliter Kultur bei einem OD600 von 1,0 vorhanden ist.Zentrifugieren Sie die gesammelten Zellen in 15-Milliliter-Konischen Röhrchen bei 3.000 × g bei Raumtemperatur für zwei Minuten. Entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in einem Milliliter frischem Wachstumsmedium bei 30 Grad Celsius pro 2,5 OD600-Einheiten an Zellen.Bevor die Cycloheximid-Chase begonnen wird, die Hefe-Zellsuspensionen durch fünfminütige Inkubation im 30-Grad-Celsius-Wärmeblock äquilibrieren. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist die exakte Timing der Cycloheximid-Zugabe und die Zellentnahme für jede Probe. Wir gewährleisten den Erfolg, indem wir einen Zeitplan für die Cycloheximid-Zugabe und die Zellentnahme aufstellen und strikt einhalten.Um die Cycloheximid-Chase zu beginnen, drücken Sie „Start“ am Timer. Geben Sie Cycloheximid schnell, aber vorsichtig zu der ersten Hefezellsuspension hinzu, sodass eine Endkonzentration von 250 Mikrogramm pro Milliliter erreicht wird, und wirbeln Sie kurz um zu mischen. Überführen Sie unverzüglich 950 Mikroliter oder etwa 2,4 OD600-Einheiten der Hefezellsuspension mit zugesetztem Cycloheximid in ein vorher beschriftetes Mikrozentrifugenröhrchen, das 50 Mikroliter eiskalte 20x Stop-Mix enthält.Vortexen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Sie es auf Eis, bis alle Proben gesammelt wurden. Beginnen Sie den Cycloheximid-Chase, wie für jede der verbleibenden Hefe-Zellsuspensionen in regelmäßigen Zeitabständen gezeigt. Übertragen Sie zu jedem nachfolgenden Zeitpunkt 950 Mikroliter der vortexten Hefe-Zellsuspension in beschriftete Mikrozentrifugenröhrchen, die 50 Mikroliter vorgekühlte 20x Stop-Mix enthalten.Vortexen Sie die Probe und stellen Sie die gesammelten Zellen auf Eis. Um ein Absinken der Hefezellen zu verhindern, vortexen Sie die Zellsuspensionen in den 15-Milliliter-Kegelröhrchen während des gesamten Chase-Vorgangs etwa alle fünf Minuten. Sobald alle Proben gesammelt wurden, pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 6.500 × g und Raumtemperatur für 30 Sekunden.Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren oder Absaugen. Die Zellen sind nun bereit für die alkalische Lyse. Bereiten Sie die Zellen für die alkalische Lyse vor, indem Sie 100 µL destilliertes Wasser zu jedem Zellenpellet hinzufügen und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren resuspendieren.Geben Sie 100 Mikroliter 0,2 molarer Natronlauge zu jeder Probe hinzu. Mischen Sie durch Wirbeln. Inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten bei Raumtemperatur.In diesem Stadium wurden die Hefe-Zellen noch nicht lysiert und die Proteine noch nicht freigesetzt. Als Nächstes pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 18.000 × g bei Raumtemperatur für 30 Sekunden. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren oder Absaugen.Um die Zellen zu lysieren, 100 Mikroliter Laemmli-Probe-Puffer zu jedem Zellenpellet hinzufügen. Durch wiederholtes Auf- und Abpipettieren resuspendieren. Fünf Minuten bei 95 Grad Celsius inkubieren, um die Proteine vollständig zu denaturieren.Zentrifugieren Sie die Lysate bei 18.000 × g und Raumtemperatur für eine Minute, um unlösliches Material zu pelletieren. Der Überstand, der das solubilisierte extrahierte Protein enthält, ist bereit für die Trennung mittels SDS-PAGE und anschließende Western-Blot-Analyse. Alternativ können die Lysate bei −20 °C gelagert werden.Die Stabilität von Deg1-Sec62, einem Modell-Substrat für den abbauassoziierten Abbau im endoplasmatischen Retikulum von Hefe, wurde mittels der Cycloheximid-Chase-Methode analysiert. Das Deg1-Sec62-Protein wandert in der SDS-PAGE als mehrere Spezies und wird in Wildtyp-Zellen rasch abgebaut. Pgk1 dient als Ladekontrolle, deren Menge unter den getesteten Bedingungen nicht variiert.Der Verlust entweder der im ER lokalisierten Ubiquitin-Ligase Hrd1 oder des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms Ubc7 stabilisierte das Deg1-Sec62-Protein erheblich, was die zuvor beobachtete Beteiligung dieser Proteine am Abbau von Deg1-Sec62 bestätigt. Cue1 ist ein transmembranes Protein, das Ubc7 an der ER-Membran verankert und das Enzym aktiviert, jedoch wurde eine Beteiligung von Cue1 am Abbau von Deg1-Sec62 bisher nicht direkt untersucht. Die Beobachtung dieser Studie, dass Deg1-Sec62 in Abwesenheit von Cue1 stabilisiert wurde, bestätigte eine Rolle von Cue1 beim ER-assoziierten Abbau von Deg1-Sec62.Das Ergebnis des Western Blots wurde mithilfe einer Bildanalyse-Software quantifiziert. Um die Häufigkeit des Deg1-Sec62-Proteins zwischen den Proben zu vergleichen, wurde für jede Probe das Verhältnis der angepassten Signalintensitäten von Deg1-Sec62 zu Pgk1 bestimmt. Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Verfahren am direktesten die Abbaukinetik einer im Gleichgewicht befindlichen Population eines Proteins der Untersuchung widerspiegelt.Um den Abbau einer neu synthetisierten Population eines Proteins von Interesse zu visualisieren, können andere Techniken wie Pulse-Chase-Experimente verwendet werden. Vergessen Sie nicht, dass Cycloheximid und Natriumazid äußerst toxisch sind, und es sollten Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um direkten Kontakt mit diesen Chemikalien während der Durchführung dieses Verfahrens zu vermeiden.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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