Cycloheximid Chase-Analyse von Proteinabbau in
18. April 2016
Die Proteinhäufigkeit spiegelt die Raten sowohl der Proteinsynthese als auch des Proteinabbaus wider. Dieser Artikel beschreibt die Verwendung von Cycloheximid-Chase gefolgt von Western Blotting zur Analyse des Proteinabbaus im einzelligen Modell-Eukaryoten Saccharomyces cerevisiae (knospende Hefe).
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Abbau der stationären Population eines bestimmten Proteins in Saccharomyces cerevisiae sichtbar zu machen. Diese Methode kann verwendet werden, um die genetischen Voraussetzungen sowie die Auswirkungen der Umweltbedingungen auf den Abbau eines Proteins der Untersuchung zu bestimmen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass im Gegensatz zu Pulse-Chase-Methoden, die ebenfalls zur Visualisierung des Proteinabbaus eingesetzt werden, keine radioaktiven Isotope und zeitaufwändigen Immunpräzipitationsschritte erforderlich sind.
Dieses Verfahren kann verwendet werden, um entweder ein endogenes Hefe-Protein oder ein Protein, das von einem Plasmid exprimiert wird, zu analysieren. Für letzteres wird der Hefestamm mit einem Plasmid transformiert, das das Protein der Interesse kodiert, gemäß einem standardmäßigen Hefe-Transformationsprotokoll. Inokulieren Sie die Hefe in fünf Millilitern geeignetem Medium.
Inkubieren Sie über Nacht bei 30 Grad Celsius mit Rotation. Messen Sie am folgenden Morgen die optische Dichte bei 600 Nanometern (OD600) jeder Übernachtkultur. Verdünnen Sie die Kulturen auf eine OD600 von 0,2 in 15 Milliliter frischem Medium.
Inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius unter Schütteln, bis die Zellen die mittlere logarithmische Wachstumsphase erreichen. Während die Hefezellen wachsen, bereiten Sie den Cycloheximid-Chase-Versuch vor. Stellen Sie ein Heizblock, das 15-Milliliter-Konizialröhrchen aufnehmen kann, auf 30 Grad Celsius ein, um die Zellen in Gegenwart von Cycloheximid zu inkubieren.
Um eine effiziente Wärmeverteilung an die Kulturen sicherzustellen, geben Sie Wasser in jedes Loch des Heizblocks, sodass der Wasserspiegel durch ein 15-Milliliter-Konischgefäß bis an den Rand des Lochs ansteigt, jedoch nicht überläuft. Stellen Sie einen zweiten Heizblock, der 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen aufnehmen kann, für die Proteindenaturierung nach der Zelllyse auf 95 Grad Celsius ein. Wärmen Sie frisches Wachstumsmedium auf 30 Grad Celsius vor.
Für jeden Zeitpunkt und jede zu analysierende Kultur werden 1,1 Milliliter Medium benötigt. Geben Sie 50 Mikroliter 20x Stop-Mix-Lösung in vorbeschriftete Mikrozentrifugenröhrchen. Bereiten Sie ein Röhrchen pro Zeitpunkt und Kultur zur Analyse vor.
Stellen Sie die Röhrchen auf Eis. Wenn die Hefezellen das mittlere logarithmische Wachstum erreicht haben, sammeln Sie pro Zeitpunkt 2,5 OD600-Einheiten jeder Kultur für den Assay. Eine OD600-Einheit entspricht der Menge an Hefe, die in einem Milliliter Kultur bei einem OD600 von 1,0 vorhanden ist.
Zentrifugieren Sie die gesammelten Zellen in 15-Milliliter-Konischen Röhrchen bei 3.000 × g bei Raumtemperatur für zwei Minuten. Entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in einem Milliliter frischem Wachstumsmedium bei 30 Grad Celsius pro 2,5 OD600-Einheiten an Zellen.
Bevor die Cycloheximid-Chase begonnen wird, die Hefe-Zellsuspensionen durch fünfminütige Inkubation im 30-Grad-Celsius-Wärmeblock äquilibrieren. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist die exakte Timing der Cycloheximid-Zugabe und die Zellentnahme für jede Probe. Wir gewährleisten den Erfolg, indem wir einen Zeitplan für die Cycloheximid-Zugabe und die Zellentnahme aufstellen und strikt einhalten.
Um die Cycloheximid-Chase zu beginnen, drücken Sie „Start“ am Timer. Geben Sie Cycloheximid schnell, aber vorsichtig zu der ersten Hefezellsuspension hinzu, sodass eine Endkonzentration von 250 Mikrogramm pro Milliliter erreicht wird, und wirbeln Sie kurz um zu mischen. Überführen Sie unverzüglich 950 Mikroliter oder etwa 2,4 OD600-Einheiten der Hefezellsuspension mit zugesetztem Cycloheximid in ein vorher beschriftetes Mikrozentrifugenröhrchen, das 50 Mikroliter eiskalte 20x Stop-Mix enthält.
Vortexen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Sie es auf Eis, bis alle Proben gesammelt wurden. Beginnen Sie den Cycloheximid-Chase, wie für jede der verbleibenden Hefe-Zellsuspensionen in regelmäßigen Zeitabständen gezeigt. Übertragen Sie zu jedem nachfolgenden Zeitpunkt 950 Mikroliter der vortexten Hefe-Zellsuspension in beschriftete Mikrozentrifugenröhrchen, die 50 Mikroliter vorgekühlte 20x Stop-Mix enthalten.
Vortexen Sie die Probe und stellen Sie die gesammelten Zellen auf Eis. Um ein Absinken der Hefezellen zu verhindern, vortexen Sie die Zellsuspensionen in den 15-Milliliter-Kegelröhrchen während des gesamten Chase-Vorgangs etwa alle fünf Minuten. Sobald alle Proben gesammelt wurden, pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 6.500 × g und Raumtemperatur für 30 Sekunden.
Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren oder Absaugen. Die Zellen sind nun bereit für die alkalische Lyse. Bereiten Sie die Zellen für die alkalische Lyse vor, indem Sie 100 µL destilliertes Wasser zu jedem Zellenpellet hinzufügen und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren resuspendieren.
Geben Sie 100 Mikroliter 0,2 molarer Natronlauge zu jeder Probe hinzu. Mischen Sie durch Wirbeln. Inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten bei Raumtemperatur.
In diesem Stadium wurden die Hefe-Zellen noch nicht lysiert und die Proteine noch nicht freigesetzt. Als Nächstes pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 18.000 × g bei Raumtemperatur für 30 Sekunden. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren oder Absaugen.
Um die Zellen zu lysieren, 100 Mikroliter Laemmli-Probe-Puffer zu jedem Zellenpellet hinzufügen. Durch wiederholtes Auf- und Abpipettieren resuspendieren. Fünf Minuten bei 95 Grad Celsius inkubieren, um die Proteine vollständig zu denaturieren.
Zentrifugieren Sie die Lysate bei 18.000 × g und Raumtemperatur für eine Minute, um unlösliches Material zu pelletieren. Der Überstand, der das solubilisierte extrahierte Protein enthält, ist bereit für die Trennung mittels SDS-PAGE und anschließende Western-Blot-Analyse. Alternativ können die Lysate bei −20 °C gelagert werden.
Die Stabilität von Deg1-Sec62, einem Modell-Substrat für den abbauassoziierten Abbau im endoplasmatischen Retikulum von Hefe, wurde mittels der Cycloheximid-Chase-Methode analysiert. Das Deg1-Sec62-Protein wandert in der SDS-PAGE als mehrere Spezies und wird in Wildtyp-Zellen rasch abgebaut. Pgk1 dient als Ladekontrolle, deren Menge unter den getesteten Bedingungen nicht variiert.
Der Verlust entweder der im ER lokalisierten Ubiquitin-Ligase Hrd1 oder des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms Ubc7 stabilisierte das Deg1-Sec62-Protein erheblich, was die zuvor beobachtete Beteiligung dieser Proteine am Abbau von Deg1-Sec62 bestätigt. Cue1 ist ein transmembranes Protein, das Ubc7 an der ER-Membran verankert und das Enzym aktiviert, jedoch wurde eine Beteiligung von Cue1 am Abbau von Deg1-Sec62 bisher nicht direkt untersucht. Die Beobachtung dieser Studie, dass Deg1-Sec62 in Abwesenheit von Cue1 stabilisiert wurde, bestätigte eine Rolle von Cue1 beim ER-assoziierten Abbau von Deg1-Sec62.
Das Ergebnis des Western Blots wurde mithilfe einer Bildanalyse-Software quantifiziert. Um die Häufigkeit des Deg1-Sec62-Proteins zwischen den Proben zu vergleichen, wurde für jede Probe das Verhältnis der angepassten Signalintensitäten von Deg1-Sec62 zu Pgk1 bestimmt. Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Verfahren am direktesten die Abbaukinetik einer im Gleichgewicht befindlichen Population eines Proteins der Untersuchung widerspiegelt.
Um den Abbau einer neu synthetisierten Population eines Proteins von Interesse zu visualisieren, können andere Techniken wie Pulse-Chase-Experimente verwendet werden. Vergessen Sie nicht, dass Cycloheximid und Natriumazid äußerst toxisch sind, und es sollten Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um direkten Kontakt mit diesen Chemikalien während der Durchführung dieses Verfahrens zu vermeiden.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Visualisierung des Proteinabbaus in Saccharomyces cerevisiae mittels Cycloheximid-Chase-Analyse gefolgt von Western Blotting. Die Technik ermöglicht es Forschern, den Abbau spezifischer Proteine zu analysieren, ohne auf radioaktive Isotope oder zeitaufwändige Immunkomplexpräzipitationsschritte angewiesen zu sein.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Proteindegradierung
- Zellbiologie
- Hefemodellsysteme
Hintergrund
- Die Proteinmenge wird durch die Raten von Synthese und Degradation beeinflusst.
- Der Cycloheximid-Chase ist eine Methode, die zur Untersuchung der Proteinstabilität verwendet wird.
- Die Western Blot-Analyse ist eine Technik zum Nachweis spezifischer Proteine.
- Das Verständnis der Proteindegradation ist entscheidend für Einblicke in zelluläre Prozesse.
Zweck der Studie
- Um den Abbau eines spezifischen Proteins in Hefe sichtbar zu machen.
- Um genetische und umweltbedingte Faktoren zu bestimmen, die den Proteinabbau beeinflussen.
- Um eine einfachere Alternative zu herkömmlichen Pulse-Chase-Methoden bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Verwendung von Cycloheximid zur Hemmung der Proteinsynthese.
- Western-Blot-Analyse zur Untersuchung der Proteinmengen über die Zeit.
- Transformation von Hefe mit Plasmiden, die Proteine von Interesse kodieren.
- Inokulation der Hefe in geeignetes Wachstumsmedium.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung des Proteinabbaus in Hefe.
- Identifizierung der genetischen Voraussetzungen für den Proteinabbau.
- Bewertung der Auswirkungen der Umweltbedingungen auf die Proteinstabilität.
- Nachweis der Effizienz der Methode im Vergleich zu herkömmlichen Techniken.
Schlussfolgerungen
- Die Cycloheximid-Chase-Methode eignet sich zur Untersuchung des Proteinabbaus.
- Diese Technik vereinfacht die Analyse der Proteinstabilität in Hefe.
- Die Ergebnisse tragen zu einem besseren Verständnis der Proteindynamik in Zellen bei.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die Kinetik des Proteinabbaus ist entscheidend für die Validierung von Zielstrukturen und die Absicherung mechanistischer Hypothesen im frühen Entdeckungsstadium. Die Cycloheximid-Chase-Methode ermöglicht eine quantitative Beurteilung der Proteinstabilität in einem genetisch zugänglichen Modell und unterstützt so die Überprüfung von Hypothesen sowie die Aufklärung von Signalwegen. Dieser Ansatz liefert eine prognostische Sicherheit für die Priorisierung von Zielstrukturen und die Risikominimierung mechanistischer Hypothesen vor der Verbindungsscreening-Phase.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Messung der Abbaugeschwindigkeiten von Proteinen im stationären Zustand.
- Operationaler Wert: Unterstützt die funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch genetische und umweltbedingte Störungsanalysen.
- Prädiktiver Wert: Erzeugt quantitative Daten zur Abbaudynamik, um die Zuversicht in Zielstrukturen und Entscheidungen zur Priorisierung von Portfolioinhalten zu untermauern.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte und reproduzierbare Western Blot-Ergebnisse für zeitlich aufgelöste Messungen der Proteinstabilität.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit Tests unter mehreren Bedingungen zur Bewertung der Wirkung von Verbindungen auf Proteinabbauwege.
- Plattformnutzen: Schafft eine wiederverwendbare Methode zur Beurteilung der Zielstrukturenbindung durch Modulation des Abbaus in Hefe-basierten Systemen.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Verwendet Saccharomyces cerevisiae als krankheitsrelevantes System, um konservierte Abbaumechanismen zu modellieren.
- Translationale Kontinuität: Verbindet die entdeckungsphasenbasierte Zielvalidierung mit präklinischen Studien durch die Analyse konservierter Ubiquitin-Proteasom-Wege.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Identifiziert genetische und umweltbedingte Modulatoren des Abbaus, um Zielmechanismen vor der Validierung an Säugetieren hinsichtlich Risiken zu bewerten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Leitstruktur-Identifizierung ein, indem sie Daten zur Degradationskinetik liefert, die die Target-Auswahl und Studien zum Wirkmechanismus unterstützen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen, indem Degradationsvariablen von Syntheseeffekten isoliert werden.
- Screening: Ermöglicht die Entwicklung von Assays für die Wirkstoffprüfung, indem Basisdegradationsraten in gentechnisch veränderten Hefestämmen etabliert werden.
- Analytik: Erzeugt quantitative Western-Blot-Signale, die an Ladekontrollen normalisiert sind, zur vergleichenden Analyse unter verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verknüpft in Hefe basierende Degradationsbefunde mit Säugetiersystemen über konservierte, am endoplasmatischen Retikulum assoziierte Degradationskomponenten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine standardisierte Plattform zur risikomindernden Untersuchung von Zielstrukturen über Projekte hinweg mittels genetischer und chemischer Störungsanalysen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine mechanistische Entwicklungsrisikominderung, indem die Proteinhaltwertzeit quantifiziert und Abhängigkeiten von Degradationswegen identifiziert werden.
- Operationaler Wert: Bietet einen standardisierten, isotopenfreien Arbeitsablauf, der mit gängiger Western-Blot-Infrastruktur kompatibel ist.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem Unsicherheiten bezüglich des Zielmechanismus und der Auswirkungen modulierender Substanzen auf die Stabilität verringert werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf der Zugänglichkeit der Degradation und der Konservierung von Signalwegen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Hefekulturen, Sicherheitsprotokollen für Cycloheximid sowie in der Quantifizierung von Western Blots.
- Setzt Zugang zu Wärmeblöcken mit 30 °C und 95 °C, Zentrifugen sowie Standardausrüstung für SDS-PAGE und Western Blotting voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen den Arbeitsgruppen hinsichtlich der Zeitpunkterfassung, Lysateffizienz und Signalnormalisierung.
- Zu berücksichtigende Anpassungsaspekte sind plasmidbasierte Expressionssysteme, Epitop-Tags und die Verträglichkeit mit Hefe-Knockout-Bibliotheken.
- Praktische Einschränkungen umfassen die Toxizität von Cycloheximid, mögliche Nebenwirkungen auf die Translation sowie die Notwendigkeit einer Detektion im linearen Bereich beim Western Blotting.
