Sequential Anwendung von Glasplättchen die Drucksteifigkeit der Maus Objektiv zu beurteilen: Stamm und morphometrische Analysen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Drucksteifigkeit und Geometrie von Mauslinsen mit einem einfachen und kostengünstigen Ansatz zu bewerten. Diese Methode kann wichtige Fragen im Bereich der Objektive beantworten. Zum Beispiel, wie sich verschiedene genetische und experimentelle Störungen auf die biomechanischen Eigenschaften von Linsen auswirken.

Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie präzise und reproduzierbar ist und keine teuren oder speziellen Geräte erfordert. Diese Methode gibt Einblick in die Eigenschaften von Mauslinsen und kann möglicherweise auf größere Modellorganismen wie Ratten und Kaninchen angewendet werden. Die Visualisierung der Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zum Disparieren von Linsen und zum Anbringen von Deckgläsern ohne Demonstration schwer zu erlernen sind.

Catherine Cheng, eine Postdoktorandin aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Beginnen Sie die Dissektion mit einer gebogenen Pinzette, um das Gewebe um das Auge einer euthanasierten Maus herum zu drücken, die das Auge aus der Augenhöhle herausführt. Entfernen Sie dann das Auge und legen Sie es in eine Sezierschale mit frischem PBS unter ein Präpariermikroskop.

Schneiden Sie den Sehnerv so nah wie möglich am Augapfel ab. Führen Sie dann vorsichtig und vorsichtig eine feine, gerade Pinzette durch das Loch in den Augapfel ein, wo der Sehnerv aus dem hinteren Teil des Organs austritt. Machen Sie vorsichtig einen Schnitt mit einer Schere vom hinteren bis zum Rand der Hornhaut und achten Sie darauf, die Linse nicht zu beschädigen.

Setzen Sie den Schnitt entlang der Verbindung zwischen der Hornhaut und der Sklera fort, mindestens auf halber Höhe um den Augapfel. Und drücken Sie vorsichtig auf die Hornhaut, um die Linse durch die Öffnung aus dem Auge zu entfernen. Verwenden Sie dann eine gerade Pinzette mit feiner Spitze, um vorsichtig alle großen Ablagerungen zu entfernen, die noch an der Linse haften.

Und bestätigen Sie visuell, dass das Objektiv frei von Beschädigungen ist. Mindestens zwei Stunden vor Beginn der Steifigkeitsmessungen mit einer Analysenwaage mindestens 10 Deckgläser aus derselben Schachtel wiegen. Ermitteln Sie das durchschnittliche Gewicht der Deckgläser.

Befeuchten Sie dann die Deckgläser und einen rechtwinkligen Spiegel bei PBS bei Raumtemperatur. Während die Materialien hydratisiert werden, füllen Sie die Messkammer mit 65 bis 75 Millilitern PBS. Und stellen Sie die Kammer unter ein Präpariermikroskop, das auf eine 30-fache Vergrößerung eingestellt ist, mit Beleuchtung von unten und einer faseroptischen Lichtquelle auf der linken und rechten Seite.

Wenn die Deckgläser fertig sind, platzieren Sie den rechtwinkligen Spiegel in der Kammer in einem konstanten Abstand zu der Vertiefung, die zum Halten des Objektivs verwendet wird. Anschließend werden die präparierten Linsen mit einer gebogenen Pinzette vorsichtig in die Messkammer überführt. Stellen Sie das optische Netzteil auf 80 % der maximalen Lichtintensität ein und passen Sie die Leistung des Netzteils je nach Umgebungsbeleuchtung, Benutzerpräferenz und Bildqualität nach Bedarf an.

Erhalten Sie Bilder von oben von den ungeladenen Linsen direkt über der Kammer. Machen Sie dann ein Bild der scharfen Spiegelkante, gefolgt von einem Seitenbild der ungeladenen Linse durch den Spiegel außerhalb des Divots. Setze dann eine Linse in die Vertiefung ein und vergewissere dich, dass die Linse sicher und gerade in der Vertiefung am vorderen oder hinteren Pol sitzt.

Mach ein Foto von der Linse im Spiegel. Legen Sie dann vorsichtig einen Deckslip auf das Objektiv. Nehmen Sie nach zwei Minuten ein weiteres Bild der Seitenansicht des geladenen Objektivs auf.

Fahren Sie mit dem Hinzufügen von Deckgläsern fort und erhalten Sie zwei Minuten nach dem Hinzufügen jedes Deckblatts Bilder von der Seitenansicht, bis die Gesamtzahl von 10 Deckblättern angewendet wurde. Entfernen Sie dann alle Deckgläser, warten Sie zwei Minuten und erhalten Sie Bilder von der Seitenansicht des Objektivs innerhalb und außerhalb des Divots. Und ein Bild von oben des Objektivs außerhalb des Divots.

Um die Größe des Linsenkerns zu bestimmen, legen Sie eine Linse in eine saubere, mit PBS gefüllte Petrischale und verwenden Sie eine feine, gerade Pinzette, um die Linse vorsichtig zu entkapseln. Um die kortikalen Faserzellen zu entfernen, rollen Sie die Linse zwischen behandschuhten Fingern. Spülen Sie anschließend den Linsenkern im PBS vorsichtig ab und setzen Sie den Kern wieder in die Messkammer ein.

Nehmen Sie ein Bild des Linsenkerns durch den rechtwinkligen Spiegel auf. Um die Bilder zu analysieren, verwenden Sie schließlich die entsprechende Bildanalysesoftware, um die äquatorialen und axialen Durchmesser der Linsen vor und nach jedem Ladeschritt zu messen. Messen Sie auch den Durchmesser jedes Linsenkerns.

In diesem repräsentativen Experiment wurden die Steifigkeit und Abmessungen von zwei, vier und acht Monate alten Mauslinsen gemessen und die axialen und äquatorialen Dehnungen berechnet. Die axiale Dehnung ist eine logarithmische Funktion der aufgebrachten Last mit einer statistisch signifikanten, altersabhängigen Abnahme der axialen und äquatorialen Dehnungen unter der maximal aufgewendeten Last, was darauf hindeutet, dass sich die Mauslinse mit zunehmendem Alter versteift. Die während dieses Experiments gesammelten Bilddaten wurden auch verwendet, um mehrere andere morphologische Merkmale der Linse zu bestimmen.

Erwartungsgemäß nahmen der axiale und äquatoriale Durchmesser sowie das Linsenvolumen mit dem Alter zu. Das Seitenverhältnis zeigt an, dass das Objektiv einen etwas größeren äquatorialen Durchmesser als einen axialen Durchmesser hat. Und dieser Parameter änderte sich nicht mit dem Alter.

Der Durchmesser, das Volumen und der Anteil des Linsenkerns nehmen mit dem Alter zu, was darauf hindeutet, dass sich der Linsenkern umgestaltet, um mit zunehmendem Alter der Linse an relativer Größe zuzunehmen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 30 bis 45 Minuten pro Linse abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Vorgang ist es wichtig, die Linse gleichmäßig in der Vertiefung zu positionieren und die Linse zwischen jedem weiteren Deckglas zwei Minuten lang entspannen zu lassen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Drucksteifigkeit und die Morphometrie von Mauslinsen mithilfe des sequentiellen Aufbringens von Deckgläsern beurteilen können. Diese präzise, einfache und kostengünstige Technik ebnet Linsenforschern den Weg, um die biomechanischen Auswirkungen von Genmutationen bei Mäusen zu erforschen.