Name: High Content Screening-Analyse die toxikologischen Wirkungen von gefährlichen und potenziell gefährlichen Inhaltsstoffe (HPHC) zur Bewertung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Erfahren Sie die Hochdurchsatz-Toxizitätsanalyse von Zigarettenrauch-Inhaltsstoffen mittels Impedanz-basierter Echtzeitzellanalyse und High-Content-Screening. Diese Methode ermöglicht die Bewertung zytotoxischer Effekte an humanen Bronchialepithelzellen.

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Die Autoren möchten sich Karsta Luettich und Grégory Vuillaume für ihre Überprüfung des Manuskripts danken.

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Alle Autoren sind Mitarbeiter von Philip Morris International. Philip Morris International ist die einzige Quelle für die Finanzierung und Sponsor dieses Projekts.

Der Bedarf an Alternativen zu Tierversuchen und für neue Hochdurchsatz-Testmethoden wurden in den vergangenen Jahren viel diskutiert. Dies hat Wissenschaftler und Regulierungsbehörden geführt alternative Methoden für Standardtoxizitätstests zu untersuchen, zellulären Assays verwendet, die die Physiologie der Zielgewebe eng imitieren. In dieser Studie haben wir die Anwendbarkeit der Kombination eines Echtzeit-Zell Analysator (RTCA) mit einem hohen Gehalt Screening (HCS) Plattform demonstriert die Wirkung der Exposition auf einzelne CS Bestandteile auf die menschliche Lungenepithelzellen zu beurteilen. Diese Einstellung könnte analog Zytotoxizität durch verschiedene andere Luftschadstoffe, Schwebeteilchen und Nanopartikel induziert zu bewerten angewendet. Des Weiteren können die erhaltenen Ergebnisse mit denen von Whole-Genome Transcriptomics und Berechnungsmethoden auf kausale biologischen Netzwerken basieren angepasst werden. Wie bereits berichtet, erlaubt dieser Ansatz uns Daten über molekulare Weg zu erhärtenStörung bei CS Exposition 5 mit HCS - Endpunkte, auch phänotypisch diese Weg Störungen Adressierung. Als Flussdiagramm - Assay bietet Echtzeit - Zellanalyse die Lebensfähigkeit der Zellen bezogenen Informationen in einer dosis- und zeitabhängige Auflösung, die eine bessere Entscheidungsfindung ermöglicht , die Dosis und die Belichtungszeit Punkt für Downstream - Analyse 14 günstig sein kann. Das Prinzip des Analysators beruht auf Veränderungen in der elektrischen Impedanz von den Zellen erzeugt, wie sie befestigen und die Ausbreitung auf einer Oberflächenkultur und mit einer Goldmikroelektrode bedeckt. Die Impedanz wird in einen dimensionslosen Parameter mit dem Namen zell Index umgewandelt, die verwendet werden können, die Zelladhäsion zu überwachen, Verstreuen, Morphologie und letztlich die Lebensfähigkeit der Zellen. Obwohl diese Technik bietet keine Informationen über zytotoxische Mechanismen, seine Empfindlichkeit Erkennung von morphologischen zellulären Veränderungen auch bei sehr niedrigen Dosen, bei denen ermöglicht die HCS nicht informativ ist (Daten nicht gezeigt). Basierend auf Previous Experimenten haben wir festgestellt, dass RTCA Methodik bei niedrigeren Dosen im Vergleich morphologischer Veränderungen zu erkennen in der Lage, die HCS-Endpunkte. Nach anfänglichen Screening mit der Echtzeit-Zellanalyse wurde eine HCS-Plattform zu gewinnen, weitergehende Informationen über die Art der Zytotoxizität von jedem HPHC ausgelöst verwendet. Das Panel HCS-Assay erlaubt HPHCs gegenüber ihren möglichen Auswirkungen auf die zellulären Kompartimenten / Organellen sowie zum Profil wie für den auslösenden Genotoxizität oder oxidativen Stress zu identifizieren. Die Analyse zeigte deutliche Profile, wobei die ausgewählten HPHCs Zytotoxizität in NHBE Zellen induzieren. Im Allgemeinen sind alle Verbindungen mit Ausnahme Phenol wurden gefunden Nekrose bei den höchsten getesteten Dosen zu induzieren. In Übereinstimmung mit einer möglichen Rolle bei der Krebsentwicklung 1-aminonaphtalene induzierte Phosphorylierung von H2AX als Marker für Genotoxizität, relea jedoch die HCS-Panel auch unbedeckten Aktivität dieses HPHC in der mitochondrialen Toxizität Auslesung (Masse erhöht und Cytochrom Cse) und oxidativer Stress (GSH Erschöpfung). In ähnlicher Weise, wie zuvor beschrieben, wurde Phenol identifiziert mitochondriale Dysfunktion zu induzieren, und die DNA-Schäden sowie GSH Verarmungs verursachen. Chrom (VI), einer der klassifizierten Verbindungen als Gruppe I Karzinogene und Crotonaldehyd wurden auch beide als genotoxisch, insbesondere Chrom (VI) auch induzierte Apoptose (Caspase-Kaskade Aktivierung) und Crotonaldehyd identifiziert verursachte ROS erhöht. Schließlich Arsen (V) wurde gefunden cJun-Phosphorylierung zu induzieren, die ein Marker für Stress Kinase-Signalweg-Aktivierung ist. In dieser Studie verwendeten wir NHBE Zellen als Modell für Lungen Epithelzellen in vitro. Unter Verwendung dieser Zellen in einer HCS-Einstellung ist beispiellos und ermöglichte die Untersuchung eines breiteren Spektrums von Endpunkten, einschließlich Genotoxizität und oxidativen Stress-Marker. Sowohl mit lebenden Zellen und feste Zellfärbung Ansätze wurden innerhalb unserer Protokolle beschrieben, die Flexibilität der gesamten Technik zu demonstrieren. in fAkt, die gleichen Protokolle können auf eine breitere Palette von Zielen angewandt werden, die durch die Verwendung eines Fluoreszenzfarbstoffes oder Antikörper behandelt werden können. Für die erfolgreiche Durchführung der Live Färbeprotokollen ist es wichtig, die Reaktionszeit zu beachten, da einige der Farbstoffe eine begrenzte Halbwertszeit und das Fluoreszenzsignal haben kann abnehmen, bevor die Bilderfassung abgeschlossen ist. Es ist auch wichtig zu bedenken, dass, wenn eine andere Zelltyp verwendet wird, werden alle Färbebedingungen sollte, als die optimale Farbstoffkonzentration und der Inkubationsdauer kann unterschiedlich sein neu bewertet werden. In der aktuellen Papier haben wir ein Szenario beschrieben, in dem nur fünf Verbindungen, bei denen mit dem HCS-Methodik untersucht. das zuvor beschriebene Plattenlayout bedenkt, wurden sie über zwei verschiedene Plattensätze für eine Gesamtzahl von 24 Platten (6 Assays und 2 Zeitpunkte) .Die Anzahl der Platten könnte auch erhöht, wodurch die gleichzeitige Screening mehrerer Verbindungen ermöglicht dosierende oder die invessuchung von mehreren Endpunkten. Bevor Sie dies tun, sollte man jedoch berücksichtigen, dass bestimmte Endpunkte (GSH und ROS) erfordern eine sofortige Erfassung, und als Folge, die Dosierung der Platten sollte in einer gestaffelten Art und Weise durchgeführt werden, um den Erwerb der vorherigen Platte zu ermöglichen. Auf der anderen Seite, eine feste Zellfärbung Protokoll stellt einen Vorteil, wenn die Platten gestapelt werden kann, das Protokoll zu jedem Schritt nach der Fixierung zu unterbrechen, für den Abschluss des Färbeverfahrens zu einem späteren Zeitpunkt. Dieser Ansatz, zum Beispiel, würde der Bediener mit der Zeit bieten alle lebenden Zellen Färbeplatten abzuschließen, ohne die Datenqualität zu beeinträchtigen. Um den Arbeitsablauf zu optimieren, indem die Anzahl der Platten abnimmt, wäre es auch möglich sein, mehrere Endpunkte miteinander zu multiplexen. Zum Beispiel in diesem Zusammenhang DNA-Schäden und Stress-Kinase könnte zusammen einfach Sekundär unter Verwendung von zwei mit Fluorochromen Antikörper untersucht werden, in verschiedenen c emittierendenanäle e xistieren. Die kontinuierliche Weiterentwicklung der HCS-Plattform, einschließlich vollautomatischen Zellaussaat, Verbindungsverdünnung, Dosieren und Färbung, sowie das Hinzufügen neuer Endpunkte wird weiter die Fähigkeit der HCS-Plattform als ein leistungsfähiges Profilierungswerkzeug erweitern für HPHCs auf epithelialen und anderen Zelltypen .

Toxikologische Risikobewertung hat sich auf die Verwendung von Tiermodellen historisch verlassen, die zwar grundlegend in den Lebenswissenschaften, auch mit Mängeln wie inkonsistent Übersetzbarkeit auf den Menschen und der hohen Kosten verbunden ist. Darüber hinaus hat es eine zunehmende Anstrengungen zu finden Alternativen zu Tierversuchen in den Geist der &quot;3R&quot; 2 (Replacement, Reduction und Refinement). Dieser Aufwand hat sich in den letzten Jahren beschleunigt, nicht nur wegen der jüngsten Fortschritte wie Hochdurchsatztechniken und Systembiologie, aber wegen der Regelung ebenfalls die Verwendung von Tierversuchen beschränken, insbesondere in der Europäischen Union. Die Komplexität der zellulären Signalwegen die Reaktion auf toxische Beleidigungen Regelung macht es offensichtlich, dass einzelne toxikologische Endpunkte werden nicht ausreichen, um die toxikologische Grundlage bestimmter Verbindungen zu beschreiben. Hierzu wird das Zusammenspiel von Hunderten von in Wechselwirkung proteins an ein biologisches Netz beitragen wird ebenfalls berücksichtigt werden müssen. Um die Wirkung von Giften in diesen Netzwerken zu studieren, ein System Toxikologie Ansatz kombiniert mit phänotypischen Mittel- und Hochdurchsatz-Screening-Assays ist nützlich Potenzen zu schließen und gleichzeitig die weitere Informationen über die Wirkungsweise der einzelnen Noxen bereitzustellen. In dieser Studie verwendeten wir HCS als ein leistungsfähiges Screening-Tool, das aus einem automatisierten Mikroskop und einer biologischen Softwareanwendung zusammengesetzt ist, die, zu verarbeiten und zu analysieren Bilddaten aus den spezifischen fluoreszenzbasierten zellulären Assays können erwerben. Dies ermöglicht eine visuelle Veränderungen innerhalb einer Zelle in einer einzelnen Zelle oder subzellulären Ebene quantifiziert werden, und viele Parameter gleichzeitig zu analysieren. 3 beispielsweise DNA - Doppelstrangbrüche wurden auf Antikörper-Basis Identifizierung von Histon H2AX Phosphorylierung ausgewertet und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) wurden unter Verwendung eines zell perm quantifizierteable Superoxid-empfindlichen Farbstoff. Da Epithelzellen der Lunge die erste biologische Barriere gegen inhalativen Noxen darstellen, einschließlich Zigarettenrauch, verwendeten wir primären bronchialen Epithelzellen als in - vitro - Modell die Wirkung von HPHCs von der US - amerikanischen Food and Drug Administration veröffentlicht zu profilieren. 4 Dieses Manuskript eine Folge ist -bis auf einer früheren Studie 5 , bei dem man die biologische Wirkung einer unterschiedlichen Untergruppe von HPHCs ausgewertet. Im Rahmen unserer Workflow - Zytotoxizität in vitro zu beurteilen, zunächst wir die Potenzen einer Auswahl von 15 HPHC des ausgewertet, eine Impedanz-basierte Echtzeit - Zellanalyse (RTCA) System , das uns Dosisbereiche, geeignet für die anschließende HCS zu etablieren erlaubt Analyse (Abbildung 1). Eine toxikologische HCS Beurteilung wurde dann neun multiparametrisches Endpunkte zellulärer Toxizität durchgeführt unter Verwendung von jeweils zu zwei Zeitpunkten überwacht werden (4 und 24 h). Die Marker verwendet wurden , indikativ für mitochondriale Toxizität, DNA - Schäden, Stresskinase, reaktive Sauerstoffspezies (ROS), Glutathion (GSH) -Gehalt, Caspase 3 bis 7 - Aktivität, Cytochrom C Freisetzung und Zellmembranpermeabilität, wie in Tabelle 1 beschrieben. Unser Ansatz ermöglicht Identifizierung und Charakterisierung der Wirkung von Zigarettenrauchbestandteile durch dosis- und zeitabhängige Probenahme. Letztlich ergibt sich daraus eine In - vitro - Toxizitätsprofil für jeden HPHC. Multi-omics Ansätze können auch verwendet werden, um die HCS-Analyse ergänzen. Dies würde schließlich auch ein tieferes Verständnis für die Auswirkungen auf die Zellsignalisierung und / oder Transkriptionsebene.

<table><tbody><tr><td>Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader</td><td>Thermo</td><td>N01-0002B</td><td></td></tr><tr><td>xCelligence RTCA MP</td><td>ACEA</td><td></td><td></td></tr> 05331625001 <tr><td>Screener (HCS)</td><td>Genedata</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CASY Zähler TTC</td><td>Roche</td><td>05 651 719 001</td><td></td></tr><tr><td>e-Plates VIEW 96</td><td>ACEA</td><td>06 472 451 001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Frame 96</td><td>ACEA</td><td>05232392001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Cardio Temperature Tool</td><td>ACEA</td><td>2801171</td><td></td></tr><tr><td>Plattenversiegelung Atemdichtung</td><td>Greiner bio-one</td><td>676051</td><td></td></tr><tr><td>Normale menschliche bronchiale Epithelzellen (NHBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-2540</td><td>nichtrauchender 60-jähriger kaukasischer männlicher Spender</td></tr><tr><td>BEGM BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>Warm bei 37°; C vor Gebrauch</td></tr><tr><td>ReagentPack Subkultur Reagenzien-Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-5034</td><td>Warm bei 37 °; C vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (100x)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Easy Flask Filterkappe 75&nbsp; cm2</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-349</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Assay-Platte&nbsp; schwarz&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-62249</td><td></td></tr><tr><td>Draq5 (für die Färbung von tiefroten Kernen)</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrienfarbstoff: MitoTracker Rot CMXRos</td><td>Life Technologien</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrialer Farbstoff: MitoTracker Rot CM-H2XRos</td><td>Lebenstechnologien</td><td>M-7513</td><td></td></tr><tr><td>ROS Farbstoff: Dihydroethidium</td><td>Sigma</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>ROS Farbstoff: CellROX</td><td>Life technologies</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>ROS Farbstoff: MitoSOX</td><td>Life technologies</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>GSH Farbstoff: Monochlorbiman</td><td>Sigma</td><td>69899</td><td>Giftiger</td></tr><tr><td>GSH Farbstoff: Monobromobimane</td><td>Life technologies</td><td>M-1378</td><td>Toxische</td></tr><tr><td>Membranpermeabilität Farbstoff: YO-PRO-1&nbsp;</td><td>Lebenstechnologien</td><td>Y3603</td><td>Irritierend&nbsp;</td></tr><tr><td>Farbstoff für Membranpermeabilität: TO-PRO-1&nbsp;</td><td>Lebenstechnologien</td><td>T3602</td><td>Irritierend&nbsp;</td></tr><tr><td>Membranpermeabilität Farbstoff: TOTO-1&nbsp;</td><td>Lebenstechnologien</td><td>T3600</td><td>Ärgerlich&nbsp;</td></tr><tr><td>Caspase-Farbstoff: Cellevent Caspase 3/7 green</td><td>Life technologies</td><td>C10423</td><td>Reizend&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Cytochrom C Antikörper (Maus)</td><td>Thermo</td><td>MA5-11823</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Phospho-c-Jun Antikörper (Maus)</td><td>Thermo</td><td>MA5-15889</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Phospho-H2AX Antikörper (Maus)</td><td>Thermo</td><td>MA1-2022</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG DyLight 650&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab96878</td><td></td></tr><tr><td>10x Permeabilisierungspuffer</td><td>Fisher</td><td>8408400</td><td></td></tr><tr><td>4% Formaldehydlösung</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td>Toxischer</td></tr><tr><td>10x Blockierungspuffer</td><td>Fisher</td><td>8408500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Lösung</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporin</td><td>Sigma</td><td>S4400</td><td>Toxisches</td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Sigma</td><td>V0627</td><td>Toxisches</td></tr><tr><td>Paraquat</td><td>Sigma</td><td>36541</td><td>Toxisches</td></tr><tr><td>Anisomycin</td><td>Sigma</td><td>A9789</td><td>Toxische</td></tr><tr><td>Ethacrynsäure</td><td>Sigma</td><td>E4754</td><td>Giftiges</td></tr><tr><td>1-Aminonaphthalin</td><td>Sigma</td><td>34390</td><td>Giftiges</td></tr><tr><td>2-Nitropropan</td><td>Sigma</td><td>130265</td><td></td></tr><tr><td>Giftiges Acetamid</td><td>Sigma</td><td>695122</td><td></td></tr><tr><td>Giftiges Aceton</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td>Giftiges</td></tr><tr><td>Acrylamid</td><td>Sigma</td><td>A9099</td><td>Giftiges</td></tr><tr><td>Arsen (V)</td><td>Sigma</td><td>A6756</td><td>giftig</td></tr><tr><td>Benzol</td><td>Sigma</td><td>12540</td><td>Giftiges</td></tr><tr><td>Chrom (VI)</td><td>Sigma</td><td>216623</td><td>Giftiges</td></tr><tr><td>Crotonaldehyd</td><td>Sigma</td><td>262668</td><td>Giftiges</td></tr><tr><td>Methylethylketon</td><td>Sigma</td><td>34861</td><td>Giftiges</td></tr><tr><td>Nickel</td><td>Sigma</td><td>203866</td><td>Giftiges</td></tr><tr><td>Nitrobenzol</td><td>Sigma</td><td>48547</td><td>Giftiges</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma</td><td>P5566</td><td>Giftiges</td></tr><tr><td>Chinolin</td><td>Sigma</td><td>241571</td><td>Giftiges</td></tr><tr><td>Toluol</td><td>Sigma</td><td>34866</td><td>Giftiges</td></tr></tbody></table>

high content screening-analyse die toxikologischen wirkungen von gefährlichen und potenziell gefährlichen inhaltsstoffe (hphc) zur bewertung

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

Zigarettenrauch (CS) ist ein wichtiger Risikofaktor für Herz-Kreislauf- und Lungenerkrankungen. Da CS ist ein komplexes Aerosol mehr als 7.000 Chemikalien , die 1 es die Beiträge der einzelnen Bestandteile zu seiner Gesamttoxizität zu bewerten ist eine Herausforderung. Toxikologische Profile der einzelnen Bestandteile sowie Gemische können jedoch in vitro hergestellt werden, durch Hochdurchsatz-Screening - Tools anwenden, die die Profilierung von gefährlichen und potenziell gefährlichen Inhaltsstoffe (HPHCs) von Tabakrauch zu ermöglichen, wie sie in der US - amerikanischen Food and Drug definiert Administration (FDA). 2 Für eine erste Einschätzung, ein impedanzbasierten Instrument wurde für eine Echtzeit, markierungsfreie Beurteilung der Verbindung der Toxizität verwendet. Das Instrument zeigt beruht auf Zelladhäsion, Lebensfähigkeit und Morphologie, die alle zusammen einen Überblick über den Zellstatus bereitzustellen. Ein dimensionsloser Parameter, Zellenindex genannt, wird für die Quantifizierung verwendet. Eine Reihe von difdene Färbeprotokollen wurde für eine Fluoreszenz-Imaging-basierte Untersuchung und eine HCS-Plattform verwendet wurde entwickelt, weitergehende Informationen über die Art der Zytotoxizität von jedem HPHC ausgelöst zu gewinnen. Von den 15 getesteten Bestandteile wurden nur fünf ausgewählt für HCS-basierte Analyse , da sie eine berechenbare LD 50 (&lt;20 mm) registriert. Dazu gehörten 1-aminonaphtalene, Arsen (V), Chrom (VI), Crotonaldehyd und Phenol. Auf der Grundlage ihrer Wirkung in dem HCS, 1-aminonaphtalene und Phenol kann mitochondriale Dysfunktion zu induzieren, identifiziert werden, und zusammen mit Chrom (VI) als genotoxisch basierend auf der Histon H2AX Phosphorylierung erhöht. Crotonaldehyd wurde als oxidativen Stress Induktor und Arsen als Stress-Kinase-Weg-Aktivator identifiziert. Diese Studie zeigt , dass eine Kombination von impedanzbasierten und HCS Technologien zur in vitro Bewertung der CS Bestandteile ein robustes Werkzeug zur Verfügung stellt.

RTCA Da die HCS - Endpunkte nicht informativ sein wird , wenn keine toxische Wirkung festgestellt wird, sind solche Verbindungen nicht zeigen verminderte Lebensfähigkeit der Zellen bis zur höchsten Konzentration in der RCTA nicht durch HCS (3b getestet, c, d, g, k, l, m , p). Verbindungen zeigt verminderte Lebensfähigkeit der Zellen bei nur der höchsten Konzentration (Abbildung 3e, o) sind auch für die HCS abgewählt. Schließlich sind nur die Bestandteile mit einem berechenbaren LD 50 (&lt;20 mM) werden für die weitere Analyse HCS (3a, f, h, j, n) ausgewählt. HPHCs die oben genannten Kriterien erfüllen, sind: 1-aminonaphtalene, Arsen (V), Chrom (VI), Crotonaldehyd und Phenol. HCS Als Qualitäts-Check (QC), sind positive Kontrollen first analysiert, dass Färbeverfahren, um sicherzustellen, richtig ausgeführt wird. Repräsentative Bilder von Positivkontrolle behandelten Zellen werden in 6 gezeigt. Die Datenwerte werden auf die Fahrzeug normalisierten wie zuvor beschrieben. Keine Dosis-Wirkungskurven werden dargestellt als nur drei Dosen getestet werden und nicht alle drei Dosen werden bei jedem Zeitpunkt betrachtet. Die Positivkontrollkonzentrationen ausgewählt werden (basierend auf früheren Versuchen, Daten nicht gezeigt), so dass geeignete Antworten für jeden Endpunkt sowohl auf 4 Stunden und 24 Stunden beobachtet werden. Insbesondere Dosen 1 und 2 werden verwendet, um die Wirkung bei 4 h zu bewerten, während die Dosen 2 und 3 werden verwendet, um die Wirkung bei 24 Stunden auszuwerten. Die Platten werden verworfen, wenn keine Antwort für die positive Kontrolle Dosen beobachtet wird. Man beachte, dass für alle Endpunkte, außer mitochondrialen Membranpotentials und GSH-Gehalt wird eine Erhöhung der Signalintensität erwartet. Alle Verbindungen, mit Ausnahme von Phenol, führte zu einer nekrotischen Phäno<html> Typ, basierend auf erhöhte Permeabilität der Zellmembran (7a, f, h, l). 1-aminonaphtalene, Chrom (VI), Crotonaldehyd und Phenol wurden als genotoxisch basierend auf erhöhte Phosphorylierung von Histon H2AX (7e, j, n, p) identifiziert. Phenol und 1-aminonaphtalene wurden zu induzieren starke mitochondriale Dysfunktion (7b, o) gefunden, die mit 1-aminonaphtalene, führte zu einer erhöhten Freisetzung von Cytochrom C (Abbildung 7c). Der Nachweis von erhöhten Caspase 3/7 Aktivität zur Verfügung gestellt Nachweis von apoptotischen Ereignisses auf Chrom-Exposition. Oxidativer Stress Induktion (ROS oder GSH) wurde auch bei der Behandlung mit 1-aminonaphtalene nachgewiesen, Crotonaldehyd und Phenol (7d, m, q). Schließlich induziert Arsen Zellstress durch die erhöhte Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors cJun (Figur 7G) zeigten als. Last / 53987 / 53987fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Verbindung Tox-Profiler - Workflow. A) Schematische Darstellung des Workflow folgte in dieser Studie. Zunächst wurde eine Dosis-Entfernungsmessung durchgeführt , die RTCA - Plattform unter Verwendung von geeigneten Dosen zu wählen für nachfolgende HCS die substanzspezifischen Toxizitätsprofile. B) Experimentelles Design der Studie zu charakterisieren. 24 Stunden nach dem Aussäen wurden die Zellen dosiert und Impedanzwerte kontinuierlich über die folgenden 24 Stunden überwacht, während HCS Endpunkte untersucht wurden 4 und 24 Stunden nach der Dosierung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig2.jpg" /> Abbildung 2. RTCA Belichtungsplatte. Compound Masterplatte zuerst durch die Durchführung einer fünfstufigen 01.10 serielle Verdünnung erzeugt wird. Jede Verbindung,die Fahrzeugsteuerung einschließlich (Dosis 0) wird dann mit Medium und Staurosporin als Kontrollen in dreifacher Ausfertigung an die Belichtungsplatte zusammenaddiert. Beachten Sie, dass die Dosen - Sequenz bei der Übertragung beibehalten wird, höchsten Dosen in Zeilennummer 1 sind , während Fahrzeugsteuerungen sind in der Reihe Nummer 7 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen Bitte hier klicken.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig3.jpg" /> Figure 3. Repräsentative RTCA Zell Viability Ergebnisse. A) 1-aminonaphtalene, b) 2-nitropropan, c) acetamid, d) Aceton, e) acrylamid, f) Arsen (V), g) benzol, h) Chrom (VI) , j) Crotonaldehyd, k) Methylethylketon, l) Nickel (II), m) Nitrobenzol, n) Phenol, o) Chinolin, p) Toluol. Bei 24 Stunden nach der Dosierung, die Fläche unter der Kurve (AUC) wurde für jede Dosis berechnet (einschließlich positive Kontrolle und Fahrzeug) und normalisiert in einem Bereich von 0 bis -100% Wirkung (y-Achse), wobei 0 die Aktivität widerspiegelt das Fahrzeug und -100 der positiven Kontrolle. Die Werte wurden dann aufgetragen und ausgestattet , um eine Vier-Parameter - Hill - Gleichung und, wenn möglich, LD 50 berechnet wurde. Die Konzentrationen werden auf einer logarithmischen Skala ausgedrückt (x-Achse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig4.jpg" /> Abbildung 4. Verdünnungsschema für Positivkontrolle Verbindungen für HCS - Assays. A) Die Zugabe von Positivkontrollen und vezeug an die serielle Verdünnungsplatte. b) Serielle Verdünnung der positiven Kontrollen. c) 200X positive Kontrollen Dosen. de) Verdünnung der 200x positiven Kontrollen Dosen in Medium (01.40) , um die positive Steuerplatte zu erzeugen , um die 5 - fach - Dosen enthalten. Beachten Sie, dass jede Dosis wird in dreifacher Ausführung verdünnt , um das endgültige Layout in der Belichtungsplatte zu reflektieren). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig5.jpg" /> Abbildung 5. HCS Belichtungsplatte. Compound Masterplatte zuerst durch die Durchführung einer fünfstufigen Verdünnung erzeugt wird. Jede Verbindung, einschließlich der Fahrzeugsteuerung (Dosis 0) wird dann in dreifacher Ausführung zu der Belichtungsplatte zusammen mit den positiven Kontrollen hinzugefügt. Beachten Sie, dass die Dosen, um bei der Übertragung beibehalten wird,höchsten Dosen sind in der Zeile Nummer 1 , während Fahrzeugsteuerungen in Zeilennummer 7. sind <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig5large.jpg" target="_blank">hier Bitte klicken</a> um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig6.jpg" /> Abbildung 6. Repräsentative Fluorescent Fotos von Antikörper- oder Dye-gefärbten Zellen a) Kernparameter - Nuclear Farbstoff. Ein durchlässiges Farbstoff, der in lebenden oder fixierten Zellen an DNA bindet. Dieser Fleck wird verwendet , um einzelne Zellen zu identifizieren , die Kernregion Kennzeichnung b) Nekrosen - Permeabilität der Zellmembran Farbstoff. Farbstoff-basierte Erkennung von Zellmembranintegrität. Reagenz ist intrinsisch undurchlässig für die Zellmembran. Während Nekrose, wird die Membran durchlässig und der Farbstoff in die Zelle und bindet an DNA eine starke Fluoreszenz s Herstellung. ignal c) Apoptosis - Cytochrome C: Antikörper-basierte Erkennung von Cytochrom C Freisetzung, einem bekannten Markenzeichen der frühen Apoptose. Nach der Induktion der Apoptose wird Cytochrom c aus den Mitochondrien freigesetzt und diffundiert in den Kern d) DNA Damage - pH2AX:.. Antikörper-basierte Detektion der Phosphorylierung von Histon H2AX, ein wohlbekanntes Merkmal der Doppelstrang - DNA - Brüche e) Stress Kinase - cJun-. Antikörper-basierte Erkennung von Phosphorylierung an Ser-73 von cJun-, einem bekannten Markenzeichen der zellulären Stress f) Oxidativer Stress - DHE: Farbstoff-basierte Erkennung von Superoxid - Radikalen. Dihydroethidium selbst fluoresziert im Zytoplasma blau , während die oxidierte Form Ethidium- auf DNA - Einlagerungs rot fluoresziert g) GSH - MBCL. Farbstoffbasis Nachweis freier GSH - Moleküle. MBCL reagiert mit GSHerzeugen ein hoch fluoreszierendes Produkt h) Apoptosis - Caspase 3/7 Aktivierung:. Dye-basierte Erkennung von Caspase 3/7 Aktivität. Reagenz ist nicht fluoreszierend mit einer Vier-Aminosäure-Peptid, das die DNA-Bindung hemmt. Bei der Caspase-3/7 Aktivierung wird das Peptid ermöglicht den Farbstoff gespalten, um DNA zu binden und eine helle, fluorogene Reaktion erzeugen. Panels bh positive Kontrolle behandelten Zellen zeigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="7" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig7.jpg" /> Abbildung 7. Repräsentative Ergebnisse HCS. 1-aminonaphtalene (ae), Arsen (V) (f und g), Chrom (VI) (hk), Crotonaldehyd (ln) und Phenol (OQ). 4 Stunden (blaue Linie) und24 hr (orange Linie) Signale wurden für jede Dosis und normiert auf die Fahrzeugaktivität (0%) berechnet. Werte, die nicht in Kurvenanpassung Berechnungen enthalten sind grau dargestellt. Die Konzentrationen werden auf einer logarithmischen Skala ausgedrückt (x-Achse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Probe </td><td> Endpoint # </td><td> Biologische Endpunkt </td><td> Zellkompartiments </td><td> der Ausgabe </td></tr><tr><td rowspan="4"> Zytotoxizität </td><td> 1 </td><td> Mitochondriale Masse 6 </td><td> Zytoplasma </td><td> Spot-Durchschnitt Bereich </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Mitochondriale Membranpotential 6 </td><td> Zytoplasma </td><td> Punkt mittlere Intensität </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Cytochrome C-Release <sup&gt; 7 </td><td> Kern </td><td> Durchschnittliche Intensität </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Zellmembranpermeabilität 8 </td><td> Kern </td><td> Durchschnittliche Intensität </td></tr><tr><td> DNA-Schäden </td><td> 5 </td><td> Phospho-H2AX 9 </td><td> Kern </td><td> Durchschnittliche Intensität </td></tr><tr><td> Stress-Kinase </td><td> 6 </td><td> Phospho-cJun- 10 </td><td> Kern </td><td> Durchschnittliche Intensität </td></tr><tr><td> ROS </td><td> 7 </td><td> ROS 11 </td><td> Kern </td><td> Durchschnittliche Intensität </td></tr><tr><td> GSH-Gehalt </td><td> 8 </td><td> GSH 12 </td><td> Zytoplasma </td><td> Punkt mittlere Intensität </td></tr><tr><td> Apoptosis </td><td> 9 </td><td> Caspase 3 13 </td><td> Zytoplasma </td><td> Punkt mittlere Intensität </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Liste der HCS einssays und Endpunkte. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"></td><td rowspan="2"> Fahrzeug </td><td colspan="6" rowspan="2"> RTCA Dosen (uM) </td><td rowspan="2"> LD 50 </td><td colspan="5"> HCS Dosen </td></tr><tr><td colspan="2"></td><td colspan="4"> Die Lebensfähigkeit der Zellen ausgewählten (uM) </td><td> 3R4F (nM) </td></tr><tr><td colspan="2"> 1-Aminonaphtalene </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 280 &amp; mgr; M </td><td> 2000 </td><td> 500 </td><td> 200 </td><td> 150 </td><td> 0,27 </td></tr><tr><td colspan="2"> 2-nitropropan </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Acetamide </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Aceton </td><td> Wasser </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Acrylamide </td><td> Wasser </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Arsen (V) </td><td> Wasser </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 160 &amp; mgr; M </td><td> 200 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 25 </td> &lt;td&gt; 0,17 </td></tr><tr><td colspan="2"> Benzol </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Chrom (VI) </td><td> Wasser </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 20 &amp; mgr; M </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 20 </td><td> 10 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td colspan="2"> Crotonaldehyd </td><td> Wasser </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 200 &amp; mgr; M </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2000 </td></tr><tr><td colspan="2"> Methyl-Ethyl Ketone </td><td> Wasser </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt;20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Nickel </td><td> Wasser </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> nitrobenzol </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Phenol </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 2300 &amp; mgr; M </td><td> 5000 </td><td> 2000 </td><td> 1000 </td><td> 500 </td><td> 240 </td></tr><tr><td colspan="2"> Chinolingelb </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td&gt; <td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Toluol </td><td> Wasser </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Liste der getesteten HPHC Verbindungen mit Relative LD 50 bei 24 Stunden der Behandlung. Die Verbindungen für HCS - Analyse ausgewählt werden orange markiert und getesteten Dosierungen sind ebenfalls angegeben. Die 3R4F Dosis ist auf die Menge des Bestandteils in der Rauch von einem Stock von der Referenz Zigarette 3R4F gleichwertig. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Probe </td><td> Verbindung </td><td> Stammlösung </td><td> Lösungsmittel </td&gt; <td colspan="3"> Dosis (s) (uM) </td></tr><tr><td> Zellengesundheit </td><td> Staurosporin </td><td> 10 mM </td><td> DMSO </td><td colspan="3"> 50 </td></tr><tr><td> Zytotoxizität </td><td> Valinomycin </td><td> 10 mM </td><td> DMSO </td><td> 50 </td><td> 20 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> DNA-Schäden </td><td> Paraquat </td><td> 100 mM </td><td> DMSO </td><td> 500 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Stress-Kinase </td><td> Anisomycin </td><td> 2 mM </td><td> DMSO </td><td> 10 </td><td> 4 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ROS </td><td> Rotenon </td><td> 200 mM </td><td> DMSO </td><td> 1000 </td><td> 400 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> GSH-Gehalt </td><td> Ethacrynsäure </td><td> 200 mM </td><td> DMSO </td><td> 1000 </td><td> 400 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Apoptosis </td><td> Staurosporin </td><td> 40 mM </td><td> DMSO </td><td> 200 &lt;/ Td&gt; <td> 50 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Liste der positiven Kontrollen und Konzentrationen für jeden Test verwendet.

Ziel der Studie war es, die biologische Wirkung von 15 Zigarettenrauchbestandteilen mit einer Kombination aus einem impedanzbasierten Echtzeit-Zellanalysator und einer High-Content-Screening (HCS)-basierten Plattform für die toxikologische Bewertung in vitro zu bewerten. Diese Studie gibt Aufschluss über die wirksamen Dosen, die Toxizität und die Wirkungsweisen der getesteten Verbindungen.

High Content Screening-Analyse die toxikologischen Wirkungen von gefährlichen und potenziell gefährlichen Inhaltsstoffe (HPHC) zur Bewertung

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

Das übergeordnete Ziel dieses Ansatzes, der einen impedanzbasierten Echtzeit-Zellanalysator und eine High-Content-Screening-basierte Plattform kombiniert, besteht darin, Informationen über effektive Dosen, Toxizität und biologische Wirkungen bereitzustellen, um das Tox-Profil der getesteten Verbindungen zu erhalten. Dieser Ansatz kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Toxikologie zu beantworten. Befasst sich beispielsweise mit Zytotoxizität, Genotoxizität und zellulären Stressreaktionen.Darüber hinaus liefern sie nicht nur Informationen über mehrere biochemische und morphologische Parameter gleichzeitig, sondern können auch auf eine Vielzahl von Zelltypen und Zellkulturmodellen angewendet werden. Aufgrund der Zuständigkeit und Beschränkung wird der gesamte Ansatz durchgeführt, wobei nur ein kurzes Stück Verbindung bewertet wird. Aus dem gleichen Grund wird nur ein Protokoll zur Demonstration des High Content Screening Assessment gezeigt.Das Verfahren wird von Stefano Acali und Alexander Laurent, Technikern aus meinem Labor, vorgeführt. Um die normalen menschlichen Bronchialepithelzellen oder NHBE-Zellen zu sehen, programmieren Sie das Instrument so, dass die Anzahl und Dauer der Impedanzmessungen definiert wird. In dieser Studie werden die Daten 48 Stunden lang alle 15 Minuten aufgezeichnet.Messen Sie den Plattenhintergrund, indem Sie 50 Mikroliter vorgewärmtes Medium in jede Vertiefung einer 96-Well-RTCA-Platte pipettieren. Dieser Schritt stellt eine technische Anforderung an das Gerät dar, um den elektrischen Mediumswiderstand zu berechnen, der als Basisreferenz für zellbasierte Berechnungen verwendet werden soll. Als nächstes fügen Sie 50 Mikroliter Zellsuspension in einer Konzentration von 144.000 Zellen pro Milliliter zu dem Medium hinzu, das sich bereits in jeder Vertiefung der RTCA-Platte befindet.Sobald die Zelle erhitzt ist, ist es sehr wichtig, die Platte 40 Minuten lang bei Raumtemperatur zu belassen, damit sich die Zellen anheften und eine homogene Zellverteilung erreichen können. Inkubieren Sie die RTCA-Platten in der Wiege im Inkubator und beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Daten für die nächsten 24 plus oder minus zwei Stunden, bevor Sie dosieren. Für die Positivkontrolle verdünnen Sie die 10 millimolare Staurosporin-Stammlösung von eins zu 10 in DMSO.Geben Sie fünf Mikroliter der Verdünnung auf 195 Mikroliter Medium, um eine 5-fach funktionierende Lösung zu erhalten. Die schädlichen und potenziell gesundheitsschädlichen Bestandteile werden jeweils im Fahrzeug aufgelöst, um eine einmolare Stammlösung zu erhalten. Verdünnen Sie dann jede Stammlösung der Prüfsubstanz eins bis 10 in Medium, um eine 100 millimolare Lösung zu erhalten.Erzeugen Sie die zusammengesetzte Masterplatte, indem Sie zuerst Medium plus 10 %Vehikel in Vertiefungen von B nach F und die 100 millimolare Lösung in Vertiefung A hinzufügen. Führen Sie eine serielle Verdünnung in fünf Schritten von eins bis 10 durch, um die 5-fachen Arbeitslösungen zu erhalten. Halten Sie zum Dosieren das RTCA-Gerät an, öffnen Sie die Dockingstation, um die Belichtungsplatte zu entfernen, und legen Sie die Platte in das RTCA-Temperaturwerkzeug, um ein Abkühlen der Zellen zu vermeiden, das die Impedanzmessung beeinträchtigen könnte. Geben Sie 25 Mikroliter 5x Lösung aus der Compound-Masterplatte in dreifacher Ausfertigung in die Zellen und behalten Sie dabei die gleiche Dosierungsreihenfolge wie in der Compound-Masterplatte bei.Entfernen Sie nicht das vorhandene Zellkulturmedium. Geben Sie dann 25 Mikroliter 5x Positivkontrolllösung in die Zellen in der rechten Hälfte der unteren Reihe, ohne das vorhandene Kulturmedium zu entfernen. Geben Sie auf ähnliche Weise 25 Mikroliter Medium zu den Zellen in der linken Hälfte der unteren Reihe.Nachdem Sie die Platte mit dem Plattenversiegeler versiegelt haben, setzen Sie die Platte wieder in die RTCA-Halterung ein und verriegeln Sie sie. Starten Sie die Datenaufzeichnung für die gewünschte Belichtungszeit neu. Analysieren Sie nach der Datenaufzeichnung die RTCA-Zellviabilitätsdaten, um zu bestimmen, welche Testsubstanz in der HCS-Analyse verwendet werden soll.In diesem Experiment werden 1-Aminonaphtalin, Arsen, Chrom und Crotonaldehyd für die HCS-Analyse ausgewählt. Um die NHBE-Zellen zu sehen, fügen Sie 100 Mikroliter einer Zellsuspension mit 120.000 Zellen pro Milliliter in jede Vertiefung einer schwarzen 96-Well-Platte hinzu. Nachdem Sie die HCS-Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gelassen haben, damit sich die Zellen an den Vertiefungen anheften können, inkubieren Sie vor der Dosierung 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.Für die Positivkontrolle werden 40 Mikroliter der Stammlösung jeder Positivkontrolle in Spalte zwei abgegeben. Geben Sie dann 20 Mikroliter des Fahrzeugs in die Spalten drei und fünf ab. Und 40 Mikroliter des Fahrzeugs in Spalte vier.Entnehmen Sie 12 Mikroliter aus den Vertiefungen in Spalte zwei, geben Sie sie an die Vertiefungen in Spalte drei ab und mischen Sie. Fahren Sie fort, bis eine abschließende serielle Verdünnung mit drei Dosen und Vehikel für jede positive Kontrollverbindung erhalten ist. Zur Erzeugung der positiven Kontrollplatte wird eine Verdünnung von eins bis 40 der drei Dosen und des Vehikels in Medien vorbereitet.Zur Herstellung der zusammengesetzten Masterplatte werden die Stammlösungen der Prüfsubstanz erneut suspendiert und verdünnt, eins bis 10 in Medium für eine Konzentration von 100 Millimolar. Verdünnungen mit Medium mit 10 % Vehikel durchführen, um die ausgewählten 5x Dosen für jede Prüfsubstanz zu erhalten. Sowohl die Positivkontrollen als auch die Verbundplatte können nun über die Expositionsplatte dosiert werden.Geben Sie anschließend 25 Mikroliter 5x Lösungen aus der Compound-Masterplatte in dreifacher Ausfertigung in die Zellen und behalten Sie dabei die gleiche Dosierungsreihenfolge wie auf der Compound-Masterplatte bei. Entfernen Sie nicht das vorhandene Zellkulturmedium. Geben Sie dann 25 Mikroliter der 5-fachen Lösung aus der Positivkontrollplatte in die Zellen in der unteren Reihe, wobei Sie die gleiche Dosierungsreihenfolge wie auf der Positivkontrollplatte beibehalten.Bereiten Sie ein ausreichendes Volumen der Lebendzellfärbelösung vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Verdünnen Sie dann sowohl den Mitochondrienfarbstoff als auch den Membranpermeabilitätsfarbstoff in der Lebendzellfärbelösung gemäß den Anweisungen des Verkäufers. Geben Sie 50 Mikroliter der Lebendzellfärbelösung in jede Vertiefung der Platte, die als Zytotoxizitätsassay bezeichnet wird.Entfernen Sie das Zellkulturmedium nicht und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, 5 % CO2. Aspirieren Sie das Medium und die Färbelösung vorsichtig und fügen Sie 100 Mikroliter Fixierlösung in jede Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Platte dann 20 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.Nach der Inkubation die Fixierlösung vorsichtig ansaugen und einmal mit 100 Mikrolitern Waschpuffer pro Vertiefung waschen. Entfernen Sie den Waschpuffer und geben Sie 100 Mikroliter 1x Permeabilisierungspuffer pro Vertiefung in jede Vertiefung, bevor Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Aspirieren Sie den Permeabilisierungspuffer und waschen Sie die Platte zweimal mit 100 Mikrolitern Waschpuffer pro Vertiefung.Aspirieren Sie dann den Waschpuffer und geben Sie 100 Mikroliter 1x Blocking-Puffer in jede Vertiefung. Dann 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Verdünnen Sie den Anti-Cytochrom-C-Antikörper von eins auf 250 in Primärantikörperlösung.Als nächstes aspirieren Sie den Blockierungspuffer und fügen Sie 50 Mikroliter Primärantikörperlösung pro Vertiefung in jede Vertiefung hinzu, bevor Sie 60 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Verdünnen Sie den Anti-Maus-Antikörper von eins zu 500 in Sekundärantikörper und Kernlösung. Verdünnen Sie außerdem den Kernfarbstoff von eins bis 1.000 in Sekundärantikörper und Kernlösung.Nach dem Aspirieren der Primärantikörperlösung waschen Sie die Platte dreimal mit 100 Mikrolitern Waschpuffer pro Vertiefung mit der Plattenwaschmaschine. Aspirieren Sie den Waschpuffer und geben Sie 50 Mikroliter Sekundärantikörper und Kernlösung pro Vertiefung in jede Vertiefung der Platte. Inkubieren Sie die Platte nun 60 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.Nach der Aspiration des Sekundärantikörpers und der nuklearen Lösung wird die Platte dreimal mit 100 Mikrolitern Waschpuffer pro Vertiefung mit der Plattenwaschmaschine gewaschen. Fügen Sie dann 100 Mikroliter Waschpuffer pro Vertiefung hinzu. Die Platte kann nun auf dem HCS-Gerät ausgewertet werden und die Erfassung wird gestartet.Repräsentative RTCA-Zellviabilitätsergebnisse der Behandlung mit der Prüfsubstanz sind dargestellt. Eine toxische dosisabhängige Wirkung wird über 24 Stunden Exposition nur mit 1-Aminonaphtalin, Arsen, Chrom und Crotonaldehyd erzielt, da sie alle eine berechnete LD50 von weniger als 20 Millimolar aufwiesen. Bei den anderen Verbindungen wurde keine toxische Wirkung erzielt.Hier sind repräsentative HCS-Ergebnisse nur für die Behandlung mit 1-Aminonaphtalin dargestellt. Die toxische Wirkung von 1-Aminonaphtalin führt zu einer schweren Schädigung der Zellmembran, die nach vierstündiger Exposition dosisabhängig zu einer erhöhten Zellmembranpermeabilität führt. Die Verbindung wirkt sich auch auf die Mitochondrien aus und induziert nach vierstündiger Exposition eine Massenzunahme sowie die Freisetzung von Cytochrom C, das dann nach vier und 24 Stunden Exposition in den Zellkernen nachweisbar ist.Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von zwei bis drei Tagen ausgeführt werden, da die meisten von ihnen etwa eine Stunde pro Tag an praktischer Zeit zum Abbinden und Dosieren benötigen. Je nach gewähltem Protokoll benötigt das High Content Screening maximal dreieinhalb Stunden für die Durchführung des gesamten Färbevorgangs. Beachten Sie beim Versuch dieses Verfahrens, dass die Auswahl eines breiteren Bereichs von Endpunkten zwar die Komplexität des Workflows erhöht, die Zeit jedoch nicht wesentlich erhöht.Mit einem optimalen Arbeitsablauf können nämlich mehrere Platten parallel beurteilt werden. Die kontinuierliche Weiterentwicklung der High-Content-Screening-Plattform, einschließlich der vollautomatischen Zelleinstellung, der Verdünnung von Verbindungen, der Dosierung und Färbung sowie der Hinzufügung eines neuen Endpunkts, wird die Leistungsfähigkeit der High-Content-Screening-Plattform als leistungsstarkes Werkzeug für die toxikologische Profilerstellung weiter ausbauen. Darüber hinaus wird uns die Kombination mehrerer toxikologischer Endpunkte in einem so hohen Durchsatz einen Schritt weiter in unseren Bemühungen bringen, chemische Tests an Tieren zu reduzieren.

high-content-screening-analysis-to-evaluate-toxicological-effects

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Quantifizierung von dsDNA mit dem Hitachi F-7000 Fluoreszenz-Spektralphotometer und PicoGreen Dye

Ein High-Content-Screening-Verfahren zur Identifizierung von neuartigen Signalisierung zuständigen Transmembranrezeptoren beschrieben. Diese Methode ist zugänglich für großflächige Automatisierung und ermöglicht Vorhersagen...

Ein High-Content-Imaging Workflow Grb2 Signaling-Komplexe durch Expression Cloning Studie

Es wird ein Protokoll entwickelt, um die Auswirkungen eines epigenetischen Medikaments DZNep auf die Entwicklung, Fruchtbarkeit und Überlebensfähigkeit von Mücken zu untersuchen.  In diesem Artikel beschreiben wir Verfahren für die wässrige Exposition von DZNep gegenüber unreifen Mücken und eine blutbasierte Exposition von DZNep gegenüber adulten Mücken zusätzlich zur Messung der SAH-Hydrolase-Hemmung.

Toxikologische Tests zur Prüfung Auswirkungen eines Epigenetische Drug für Entwicklung, Fruchtbarkeit und Hinterbliebenen von Malariamücken

Erfahren Sie die Hochdurchsatz-Toxizitätsanalyse von Zigarettenrauch-Inhaltsstoffen mittels Impedanz-basierter Echtzeitzellanalyse und High-Content-Screening. Diese Methode ermöglicht die Bewertung zytotoxischer Effekte an humanen Bronchialepithelzellen.

High Content Screening-Analyse die toxikologischen Wirkungen von gefährlichen und potenziell gefährlichen Inhaltsstoffe (HPHC) zur Bewertung (Video) | JoVE Journal

High Content Screening-Analyse die toxikologischen Wirkungen von gefährlichen und potenziell gefährlichen Inhaltsstoffe (HPHC) zur Bewertung

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