High Content Screening-Analyse die toxikologischen Wirkungen von gefährlichen und potenziell gefährlichen Inhaltsstoffe (HPHC) zur Bewertung

Das übergeordnete Ziel dieses Ansatzes, der einen impedanzbasierten Echtzeit-Zellanalysator und eine High-Content-Screening-basierte Plattform kombiniert, besteht darin, Informationen über effektive Dosen, Toxizität und biologische Wirkungen bereitzustellen, um das Tox-Profil der getesteten Verbindungen zu erhalten. Dieser Ansatz kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Toxikologie zu beantworten. Befasst sich beispielsweise mit Zytotoxizität, Genotoxizität und zellulären Stressreaktionen.

Darüber hinaus liefern sie nicht nur Informationen über mehrere biochemische und morphologische Parameter gleichzeitig, sondern können auch auf eine Vielzahl von Zelltypen und Zellkulturmodellen angewendet werden. Aufgrund der Zuständigkeit und Beschränkung wird der gesamte Ansatz durchgeführt, wobei nur ein kurzes Stück Verbindung bewertet wird. Aus dem gleichen Grund wird nur ein Protokoll zur Demonstration des High Content Screening Assessment gezeigt.

Verfahren wird von Stefano Acali und Alexander Laurent, Technikern aus meinem Labor, vorgeführt. Um die normalen menschlichen Bronchialepithelzellen oder NHBE-Zellen zu sehen, programmieren Sie das Instrument so, dass die Anzahl und Dauer der Impedanzmessungen definiert wird. In dieser Studie werden die Daten 48 Stunden lang alle 15 Minuten aufgezeichnet.

Messen Sie den Plattenhintergrund, indem Sie 50 Mikroliter vorgewärmtes Medium in jede Vertiefung einer 96-Well-RTCA-Platte pipettieren. Dieser Schritt stellt eine technische Anforderung an das Gerät dar, um den elektrischen Mediumswiderstand zu berechnen, der als Basisreferenz für zellbasierte Berechnungen verwendet werden soll. Als nächstes fügen Sie 50 Mikroliter Zellsuspension in einer Konzentration von 144.000 Zellen pro Milliliter zu dem Medium hinzu, das sich bereits in jeder Vertiefung der RTCA-Platte befindet.

Sobald die Zelle erhitzt ist, ist es sehr wichtig, die Platte 40 Minuten lang bei Raumtemperatur zu belassen, damit sich die Zellen anheften und eine homogene Zellverteilung erreichen können. Inkubieren Sie die RTCA-Platten in der Wiege im Inkubator und beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Daten für die nächsten 24 plus oder minus zwei Stunden, bevor Sie dosieren. Für die Positivkontrolle verdünnen Sie die 10 millimolare Staurosporin-Stammlösung von eins zu 10 in DMSO.

Geben Sie fünf Mikroliter der Verdünnung auf 195 Mikroliter Medium, um eine 5-fach funktionierende Lösung zu erhalten. Die schädlichen und potenziell gesundheitsschädlichen Bestandteile werden jeweils im Fahrzeug aufgelöst, um eine einmolare Stammlösung zu erhalten. Verdünnen Sie dann jede Stammlösung der Prüfsubstanz eins bis 10 in Medium, um eine 100 millimolare Lösung zu erhalten.

Erzeugen Sie die zusammengesetzte Masterplatte, indem Sie zuerst Medium plus 10 %Vehikel in Vertiefungen von B nach F und die 100 millimolare Lösung in Vertiefung A hinzufügen. Führen Sie eine serielle Verdünnung in fünf Schritten von eins bis 10 durch, um die 5-fachen Arbeitslösungen zu erhalten. Halten Sie zum Dosieren das RTCA-Gerät an, öffnen Sie die Dockingstation, um die Belichtungsplatte zu entfernen, und legen Sie die Platte in das RTCA-Temperaturwerkzeug, um ein Abkühlen der Zellen zu vermeiden, das die Impedanzmessung beeinträchtigen könnte. Geben Sie 25 Mikroliter 5x Lösung aus der Compound-Masterplatte in dreifacher Ausfertigung in die Zellen und behalten Sie dabei die gleiche Dosierungsreihenfolge wie in der Compound-Masterplatte bei.

Entfernen Sie nicht das vorhandene Zellkulturmedium. Geben Sie dann 25 Mikroliter 5x Positivkontrolllösung in die Zellen in der rechten Hälfte der unteren Reihe, ohne das vorhandene Kulturmedium zu entfernen. Geben Sie auf ähnliche Weise 25 Mikroliter Medium zu den Zellen in der linken Hälfte der unteren Reihe.

Nachdem Sie die Platte mit dem Plattenversiegeler versiegelt haben, setzen Sie die Platte wieder in die RTCA-Halterung ein und verriegeln Sie sie. Starten Sie die Datenaufzeichnung für die gewünschte Belichtungszeit neu. Analysieren Sie nach der Datenaufzeichnung die RTCA-Zellviabilitätsdaten, um zu bestimmen, welche Testsubstanz in der HCS-Analyse verwendet werden soll.

In diesem Experiment werden 1-Aminonaphtalin, Arsen, Chrom und Crotonaldehyd für die HCS-Analyse ausgewählt. Um die NHBE-Zellen zu sehen, fügen Sie 100 Mikroliter einer Zellsuspension mit 120.000 Zellen pro Milliliter in jede Vertiefung einer schwarzen 96-Well-Platte hinzu. Nachdem Sie die HCS-Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gelassen haben, damit sich die Zellen an den Vertiefungen anheften können, inkubieren Sie vor der Dosierung 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.

Für die Positivkontrolle werden 40 Mikroliter der Stammlösung jeder Positivkontrolle in Spalte zwei abgegeben. Geben Sie dann 20 Mikroliter des Fahrzeugs in die Spalten drei und fünf ab. Und 40 Mikroliter des Fahrzeugs in Spalte vier.

Entnehmen Sie 12 Mikroliter aus den Vertiefungen in Spalte zwei, geben Sie sie an die Vertiefungen in Spalte drei ab und mischen Sie. Fahren Sie fort, bis eine abschließende serielle Verdünnung mit drei Dosen und Vehikel für jede positive Kontrollverbindung erhalten ist. Zur Erzeugung der positiven Kontrollplatte wird eine Verdünnung von eins bis 40 der drei Dosen und des Vehikels in Medien vorbereitet.

Zur Herstellung der zusammengesetzten Masterplatte werden die Stammlösungen der Prüfsubstanz erneut suspendiert und verdünnt, eins bis 10 in Medium für eine Konzentration von 100 Millimolar. Verdünnungen mit Medium mit 10 % Vehikel durchführen, um die ausgewählten 5x Dosen für jede Prüfsubstanz zu erhalten. Sowohl die Positivkontrollen als auch die Verbundplatte können nun über die Expositionsplatte dosiert werden.

Geben Sie anschließend 25 Mikroliter 5x Lösungen aus der Compound-Masterplatte in dreifacher Ausfertigung in die Zellen und behalten Sie dabei die gleiche Dosierungsreihenfolge wie auf der Compound-Masterplatte bei. Entfernen Sie nicht das vorhandene Zellkulturmedium. Geben Sie dann 25 Mikroliter der 5-fachen Lösung aus der Positivkontrollplatte in die Zellen in der unteren Reihe, wobei Sie die gleiche Dosierungsreihenfolge wie auf der Positivkontrollplatte beibehalten.

Bereiten Sie ein ausreichendes Volumen der Lebendzellfärbelösung vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Verdünnen Sie dann sowohl den Mitochondrienfarbstoff als auch den Membranpermeabilitätsfarbstoff in der Lebendzellfärbelösung gemäß den Anweisungen des Verkäufers. Geben Sie 50 Mikroliter der Lebendzellfärbelösung in jede Vertiefung der Platte, die als Zytotoxizitätsassay bezeichnet wird.

Entfernen Sie das Zellkulturmedium nicht und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, 5 % CO2. Aspirieren Sie das Medium und die Färbelösung vorsichtig und fügen Sie 100 Mikroliter Fixierlösung in jede Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Platte dann 20 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Nach der Inkubation die Fixierlösung vorsichtig ansaugen und einmal mit 100 Mikrolitern Waschpuffer pro Vertiefung waschen. Entfernen Sie den Waschpuffer und geben Sie 100 Mikroliter 1x Permeabilisierungspuffer pro Vertiefung in jede Vertiefung, bevor Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Aspirieren Sie den Permeabilisierungspuffer und waschen Sie die Platte zweimal mit 100 Mikrolitern Waschpuffer pro Vertiefung.

Aspirieren Sie dann den Waschpuffer und geben Sie 100 Mikroliter 1x Blocking-Puffer in jede Vertiefung. Dann 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Verdünnen Sie den Anti-Cytochrom-C-Antikörper von eins auf 250 in Primärantikörperlösung.

Als nächstes aspirieren Sie den Blockierungspuffer und fügen Sie 50 Mikroliter Primärantikörperlösung pro Vertiefung in jede Vertiefung hinzu, bevor Sie 60 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Verdünnen Sie den Anti-Maus-Antikörper von eins zu 500 in Sekundärantikörper und Kernlösung. Verdünnen Sie außerdem den Kernfarbstoff von eins bis 1.000 in Sekundärantikörper und Kernlösung.

Nach dem Aspirieren der Primärantikörperlösung waschen Sie die Platte dreimal mit 100 Mikrolitern Waschpuffer pro Vertiefung mit der Plattenwaschmaschine. Aspirieren Sie den Waschpuffer und geben Sie 50 Mikroliter Sekundärantikörper und Kernlösung pro Vertiefung in jede Vertiefung der Platte. Inkubieren Sie die Platte nun 60 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Nach der Aspiration des Sekundärantikörpers und der nuklearen Lösung wird die Platte dreimal mit 100 Mikrolitern Waschpuffer pro Vertiefung mit der Plattenwaschmaschine gewaschen. Fügen Sie dann 100 Mikroliter Waschpuffer pro Vertiefung hinzu. Die Platte kann nun auf dem HCS-Gerät ausgewertet werden und die Erfassung wird gestartet.

Repräsentative RTCA-Zellviabilitätsergebnisse der Behandlung mit der Prüfsubstanz sind dargestellt. Eine toxische dosisabhängige Wirkung wird über 24 Stunden Exposition nur mit 1-Aminonaphtalin, Arsen, Chrom und Crotonaldehyd erzielt, da sie alle eine berechnete LD50 von weniger als 20 Millimolar aufwiesen. Bei den anderen Verbindungen wurde keine toxische Wirkung erzielt.

Hier sind repräsentative HCS-Ergebnisse nur für die Behandlung mit 1-Aminonaphtalin dargestellt. Die toxische Wirkung von 1-Aminonaphtalin führt zu einer schweren Schädigung der Zellmembran, die nach vierstündiger Exposition dosisabhängig zu einer erhöhten Zellmembranpermeabilität führt. Die Verbindung wirkt sich auch auf die Mitochondrien aus und induziert nach vierstündiger Exposition eine Massenzunahme sowie die Freisetzung von Cytochrom C, das dann nach vier und 24 Stunden Exposition in den Zellkernen nachweisbar ist.

Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von zwei bis drei Tagen ausgeführt werden, da die meisten von ihnen etwa eine Stunde pro Tag an praktischer Zeit zum Abbinden und Dosieren benötigen. Je nach gewähltem Protokoll benötigt das High Content Screening maximal dreieinhalb Stunden für die Durchführung des gesamten Färbevorgangs. Beachten Sie beim Versuch dieses Verfahrens, dass die Auswahl eines breiteren Bereichs von Endpunkten zwar die Komplexität des Workflows erhöht, die Zeit jedoch nicht wesentlich erhöht.

Mit einem optimalen Arbeitsablauf können nämlich mehrere Platten parallel beurteilt werden. Die kontinuierliche Weiterentwicklung der High-Content-Screening-Plattform, einschließlich der vollautomatischen Zelleinstellung, der Verdünnung von Verbindungen, der Dosierung und Färbung sowie der Hinzufügung eines neuen Endpunkts, wird die Leistungsfähigkeit der High-Content-Screening-Plattform als leistungsstarkes Werkzeug für die toxikologische Profilerstellung weiter ausbauen. Darüber hinaus wird uns die Kombination mehrerer toxikologischer Endpunkte in einem so hohen Durchsatz einen Schritt weiter in unseren Bemühungen bringen, chemische Tests an Tieren zu reduzieren.