Name: Ein Leitfaden für Strukturierte Beleuchtung TIRF Mikroskopie bei hoher Geschwindigkeit mit mehreren Farben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Lernen Sie den Aufbau und die Justage eines TIRF-SIM-Mikroskops für hochauflösende Live-Zellbildgebung in mehreren Farben. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung dynamischer biologischer Prozesse mit hoher Zeitauflösung.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Leverhulme Trust unterstützt wurde, der Engineering and Physical Sciences Research Council [EP / H018301 / 1, EP / G037221 / 1]; Alzheimer Research UK [ARUK-EG2012A-1]; Wellcome Trust [089703 / Z / 09 / Z] und Medical Research Council [MR / K015850 / 1, MR / K02292X / 1]. Wir danken E. Avezov und M. Lu zur Transfektion der LifeAct-GFP und cytosolische-GFP-Zellen sind, und W. Chen zur Herstellung der HEK293 Kultur. Wir danken auch K. O&#39;Holleran für die Unterstützung bei der Gestaltung des Mikroskops und L. Shao und R. Heintz für nützliche Diskussionen und Anregungen.

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<li>Esbjörner, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observations+of+amyloid+%CE%B2+Self-assembly+in+live+cells+provide+insights+into+differences+in+the+kinetics+of+A%CE%B2%281-40%29+and+A%CE%B2%281-42%29+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observations of amyloid β Self-assembly in live cells provide insights into differences in the kinetics of Aβ(1-40) and Aβ(1-42) aggregation.</a> Chem. Biol. 21 (6), 732-742 (2014).</li>
<li>Michel, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+monomeric+tau+protein+is+sufficient+to+initiate+the+spread+of+tau+protein+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Extracellular monomeric tau protein is sufficient to initiate the spread of tau protein pathology.</a> J. Biol. Chem. 289 (2), 956-967 (2014).</li>
<li>Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Super-Resolution+Imaging+of+%CE%B2-Amyloid+Aggregation+In+Vitro+and+In+Vivo%3A+Method+and+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Syst.+Biol.+Alzheimer%27s+Dis.+SE+-+6%22%5BJournal%5D)">Optical Super-Resolution Imaging of β-Amyloid Aggregation In Vitro and In Vivo: Method and Techniques.</a> Syst. Biol. Alzheimer's Dis. SE - 6. 1303, 125-141 (2016).</li>
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<li>Förster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+structured+illumination+microscope+setup+with+high+acquisition+speed+by+using+a+spatial+light+modulator%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Simple structured illumination microscope setup with high acquisition speed by using a spatial light modulator.</a> Opt. Express. 22 (17), 20663(2014).</li>
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<li>Ayuk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+illumination+fluorescence+microscopy+with+distorted+excitations+using+a+filtered+blind-SIM+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Structured illumination fluorescence microscopy with distorted excitations using a filtered blind-SIM algorithm.</a> Opt. Lett. 38 (22), 4723(2013).</li>
<li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMcheck%3A+a+Toolbox+for+Successful+Super-resolution+Structured+Illumination+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy.</a> Sci. Rep. 5, 15915(2015).</li>
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<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+live%2C+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

<html> Maßgeschneiderte TIRF-SIM-Systeme wie das detaillierte Setup in diesem Protokoll sind in der Lage mehrfarbige superauflösende Bildgebung mit hoher Geschwindigkeit im Vergleich zu handelsüblichen Mikroskope. Der inhärente Vorteil der SIM als Superauflösungstechnik besteht darin, dass die zeitliche Auflösung nicht durch die Photophysik des Fluorophors im Vergleich zu anderen Verfahren, wie beispielsweise Einzelmoleküllokalisierungsmikroskopie (SMLM) oder Punktscanverfahren wie stimulierte Emission Depletion Mikroskopie beschränkt ( STED). Im Gegensatz zu diesen anderen Techniken SIM benötigt keine photoschaltbarer oder abnutzbaren Fluorophore so mehrfarbige Bildgebung einfach ist. Non TIRF-SIM-Systeme, wie beispielsweise optische SIM und multifokale SIM sectioning kann üblicherweise Auflösung Verbesserungen von 1,7-fache oder weniger in der Praxis zu erzielen, als mit dem Faktor 2 Verbesserung gegen hier berichtet wird, und kommerzielle Systeme sind auch oft langsamer und weniger flexibel als das System in diesem Protokoll dargestellt. &quot;&gt; Die beiden Hauptprobleme bei dieser Technik die Umsetzung sind zum einen die Notwendigkeit für eine präzise Positionierung der sechs SIM Strahlen innerhalb des TIR Zone der hinteren Apertur das Ziel, die eine mühsame und zeitraubende optische Ausrichtungsprozedur erfordert. Zweitens, um hohe Musterkontrast erzeugen in der Probe ist Polarisationsdrehung wesentlich. für niedrige NA 2D-SIM - Systemen Polarisationsdrehung durch sorgfältige Auswahl der linearen Polarisationsrichtung kann vermieden werden, aber dies wird unmöglich für TIRF-SIM 25. für Hochgeschwindigkeits - Mehrfarben - Abbildungs, elektro optische Polarisationssteuerung ist notwendig, und dies erhöht die Komplexität und die Kosten des Systems. Einschränkungen der Technik TIRF-SIM, wie herkömmliche TIRF wird natürlich Beobachtung biologischer Strukturen und Prozesse an der basalen Zellmembran beschränkt, die von der 150-200 nm Eindringtiefe des evaneszenten Feldes beleuchtet werden kann. WährendSIM wird oft als weniger Schädigungs als entweder STED an Zellen notiert oder SMLM, immer noch laterale Auflösung Verdoppelung der erforderlichen Anzahl von Photonen , die von mindestens 4-fach - 5 im Vergleich zu herkömmlichen TIRF - Mikroskopie erhöhen. Für die Bildgebung bei hohen Bildraten mit kurzen Belichtungszeiten, diese Photonen-Anstieg erfordert die Verwendung erhöhter Beleuchtungsintensitäten. Während jedes Fluorophor für die SIM-Bildgebung von festen oder sich langsam bewegenden Proben verwendet werden kann, hohe Helligkeit fluoreszierende Proteine ​​oder der nächsten Generation synthetischer Farbstoffe mit verbesserter Lichtstabilität sind für Live Cell Imaging empfohlen. Obwohl diese Implementierung der Bebilderung einer einzigen Farbe bei SIM Bildraten von über 20 Hz, Mehrfarben- Abbildungs ​​im vorliegenden System in der Lage ist, durch die Schaltzeit des motorisierten Emissions Filterrad begrenzt. Aufgrund der Größe des sCMOS Kamerachip, wäre die Verwendung eines Multiband-Emissionsfilter und Bildteileroptik möglich und gleichzeitige i ermöglichenMaging mit mehreren Wellenlängen ohne Geschwindigkeitsverlust. Eine andere Möglichkeit wäre es, die verschiedenen Anregungslaser abzuwechseln und ein Multiband-Sperrfilter verwenden, um das Anregungslicht abzuweisen. Die Verwendung eines ferroelektrischen binären SLM in dieser Implementierung ist auch nicht optimal. Der Beugungswirkungsgrad eines solchen SLM ist sehr gering, so dass die meisten der einfallenden Licht in der Reflexion nullter Ordnung ist, die durch die räumliche Maske herausgefiltert wird. Für Anwendungen, die sehr hohe Bildraten wird die Bilderzeugungsgeschwindigkeit daher durch die Ausgangsleistung der Laserdioden beschränkt. Der SLM führt auch einige Elliptizität der Polarisation für Wellenlängen von 550 nm Wellenlänge Design entfernt, wo die Pixel arbeiten nicht als ideal Halbwellenplatten. Obwohl dies durch Verwendung eines zusätzlichen LCVR kompensiert werden kann, kann die ideale Lösung ist die Verwendung einer digitalen Mikrospiegelvorrichtung (DMD) als Mustergenerator sein. Mögliche Änderungen Das Setup-Presented hier ist flexibel und leicht modifiziert als kommerzielle Instrumente , so dass andere Bildgebungsverfahren wie 3D-SIM, schnelle 2D-SIM, multifokale SIM (MSIM) und nichtlineare SIM (NL-SIM) 21,34,35 umgesetzt werden können. 2D-SIM kann zum Abbilden relativ flach gut geeignet sein, schnell Strukturen wie der periphere endoplasmatische Retikulum bewegt. Die periphere ER liegt tiefer innerhalb der Zelle, als man mit einem TIRF abklingende Feld beleuchtet werden, aber aufgrund seiner flachen Struktur kann unter Verwendung von Standard-2D-SIM mit vernachlässigbarer out-of-Focus Hintergrund abgebildet werden. Zusätzlich zu der Verwendung von verbesserten optischen Schneidens Rekonstruktionsalgorithmen unterdrücken out-of-Fokus Licht die Verwendung von 2D-SIM erweitern , um optisch dicken Proben, wenn auch , wo die axiale Auflösung Verdoppelung nicht 21 erforderlich. In MSIM wird die Probe durch eine sparse Gitter von Anregungs Foki 36 beleuchtet. Diese Modalität kann die räumliche Maske durch einfaches Entfernen implementiert werden (SM), Und es durch einen Polarisator zu ersetzen. Der SLM arbeitet nun als Amplitudenmodulator. Die binären SIM-Gitter auf dem SLM angezeigt werden, können durch ein 2D-Gitter von Punkten ersetzt werden, mit der Größe der zu sein, die gleich der Größe eines beugungsbegrenzten Fokus in der Bildebene gewählt Flecken. In 7A wird ein Gitter von 4 x 4 Pixel Quadrate wird auf dem SLM (Nebenbild) angezeigt , die , wenn angesichts der physischen SLM Pixelgröße von 13,62 &amp; mgr; m verkleinert Beugungs auf die Probe begrenzt Foci von 150 x 150 nm erzeugt. Die Anregungs Foci kann dann durch Verschieben des Gittermusters auf dem SLM übersetzt werden, und dies mehrmals, um wiederholt das gesamte Sichtfeld zu beleuchten. Die Bilder werden für jede übersetzte Musterposition erworben und der Stapel nachbearbeitet ein rekonstruiertes Bild zu ergeben, mit einer verbesserten Auflösung von bis zu einem Faktor <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq19.jpg" /> und reduzierte out-of-focus verglichen Licht auf die äquivalente Bild Weitfeld-30. Diese Modalität kann zur Abbildung dicken, dichten Proben , für die Standard - SIM ist nicht geeignet, zum Beispiel mit geringem Kontrast Strukturen wie gefärbten roten Blutkörperchen (7C) nützlich sein, obwohl die Erfassungszeit kann aufgrund der großen Anzahl von rohen Frames erhöht erforderlich je Sichtfeld (in diesem Fall N = 168). Schließlich kann die Einrichtung geändert werden , damit entweder qualitativ NA linear TIRF-SIM oder gemusterten Aktivierungsnichtlinearen SIM (PA NL-SIM), wie kürzlich von Li dargestellt et al., Unter Verwendung eines ultrahohen 1,7 NA - Objektiv oder Additions einer 405 nm Photoaktivierungs Laser und sorgfältige Optimierung der SLM Gittermuster 35. Zukünftige Anwendungen SIM ist immer noch ein sich schnell entwickelndes Technik und viele Anwendungen in den Lebenswissenschaften wird in Zukunft ermöglicht werden. Die Geschwindigkeit, Auflösung und Kontrast Verbesserungen der Technik und die Fähigkeit, unter Verwendung von Standard-Fluorophore mean, dass für Bioimaging, SIM eingestellt herkömmlichen viele Mikroskopsysteme, wie die konfokale und weites Feld Plattformen zu ersetzen. Kommerzielle SIM-Systeme sind bereits heute mit hervorragenden technischen Spezifikationen, sie aber über die finanziellen Möglichkeiten vieler Forschungslabors sind, und entscheidend ist, sind sie unflexibel modifiziert und die neuesten Entwicklungen in der Forschung auf dem Gebiet zur Umsetzung entwickelt werden. Es fehlt auch die wesentliche Fähigkeit zu &quot;für das Experiment zur Hand angepasst werden &#39;, die oft einen kritischen Engpass beim Schneiden von Science-Forschung Rand Leben. Das hier beschriebene System wird besonders gut geeignet , dynamische Prozesse in der Nähe der Zelloberfläche zu untersuchen, für in - vitro - Studien von rekonstituiertem bilayer Systeme, die Oberflächenchemie in den Materialien und physikalischen Wissenschaften zu untersuchen, beispielsweise. 2D Materialien und viele andere Anwendungen.

Im Laufe des letzten halben Jahrzehnt hat Super-Resolution-Mikroskopie gereift und bewegte sich von Fachoptik-Labors in die Hände des Biologen. Kommerzielle Mikroskop Lösungen existieren für die drei Hauptvarianten zur Erzielung optischer Super-Resolution: Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie (SMLM), Emission Depletion - Mikroskopie stimuliert (STED) und strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM) 1,2. SMLM wie photoaktivierte Lokalisierungsmikroskopie (PALM) und stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) sind die beliebtesten Techniken gewesen, vor allem wegen der Einfachheit des optischen Aufbaus und dem Versprechen hoher räumlicher Auflösung, leicht bis zu 20 nm. Allerdings superauflösende Mikroskopie über die Lokalisierung einzelner Moleküle kommt mit einer intrinsischen Trade-off: die räumliche Auflösung erreichbar auf Akkumulieren einer ausreichenden Anzahl von einzelnen Fluorophor Lokalisierungen abhängig ist, damit die zeitliche Auflösung zu begrenzen. Imaging dynamischer Prozessdaher es in lebenden Zellen wird problematisch, als eine ausreichend um die Bewegung der Struktur von Interesse Probe muss Bewegungsartefakte zu verhindern, während auch genug Lokalisierung Ereignisse in dieser Zeit den Erwerb eines Bildes zu rekonstruieren. Um diese Anforderungen, Live - Zelle SMLM Demonstrationen zu treffen haben die erforderliche Erhöhung der Fluorophore Photoschaltbarkeit Raten , die durch stark die Erregungsleistung erhöht wird , und dies führt wiederum zu Phototoxizität und oxidativen Stress, wodurch Probenüberlebenszeiten und biologische Relevanz 3 zu begrenzen. Ein klarer Vorteil von STED über beide SIM und SMLM ist , dass es Bild mit Superauflösung in dicken Proben, beispielsweise laterale Auflösung von etwa 60 nm wurde in einer Tiefe in organotypischen Hirnschnitten erreicht bis zu 120 &amp; mgr; m 4. Imaging in solchen Tiefen mit Einzel Ziel Implementierungen von SMLM oder SIM ist nicht machbar, aber möglich wird, entweder mit Einzelmolekül-Lichtbogen oder Gitterlichtblatt microscopy 5. Video-Rate STED hat auch das kleine Sichtfelder 6 Bildgebung beschränkt wurde synaptischen Vesikel Mobilität auf der Karte, obwohl bisher gezeigt und verwendet worden. Für Anwendungen in der Zellbiologie und der molekularen Selbstorganisation Reaktionen 7 bis 12 , die Bildgebung mit hoher zeitlicher Auflösung erfordern über viele Zeitpunkte, strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM) können gut geeignet , da sie nicht abhängig von den photophysikalischen Eigenschaften eines bestimmten fluoresziert Sonde. Trotz dieser inhärenten Vorteil von SIM, bis jetzt seine Verwendung ist im Wesentlichen beschränkt auf fixierte Zellen oder sich langsam bewegende Prozesse Bildgebung. Dies ist aufgrund der Beschränkungen von handelsüblichen SIM-Systeme: die Erfassungsbildrate dieser Instrumente wurde durch die Rotationsgeschwindigkeit der Gitter begrenzt die benötigten sinusförmigen Beleuchtungsmuster sowie die polarisationserhaltende Optiken verwendet, zu erzeugen. Die neueste Generation von kommerziellen SIMInstrumente sind schnelle Bildgebung geeignet, aber sie sind unerschwinglich für alle, aber zentrale Imaging Einrichtungen teuer. Dieses Protokoll stellt einen Leitfaden für den Aufbau eines flexiblen SIM-System zur Abbildung schnelle Prozesse in dünnen Proben und in der Nähe der Basisfläche von lebenden Zellen. Es beschäftigt Totalreflexions - Fluoreszenz (TIRF) ein Beleuchtungsmuster zu erzeugen , die 13 nicht tiefer als etwa 150 nm in die Probe eindringt , die in beträchtlichem Ausmaß die aus dem Fokus Hintergrund Signal reduziert. Die Idee der SIM mit TIRF Kombination ist fast so alt wie die SIM - 14 selbst wurde aber nicht experimentell realisiert vor 2006 15. Die erste in vivo erhaltenen Bilder mit TIRF-SIM wurden im Jahr 2009 16 zu erreichen Bildraten von 11 Hz zu visualisieren Tubulin und Kinesin berichtet Dynamik und zwei Farb TIRF-SIM - Systeme wurden 17,18 präsentiert. Zuletzt eine Führung für den Aufbau und die Verwendung einer einzigen Farbe Zweistrahl-SIM system wurde mit Bildraten von bis zu 18 Hz 19,20 dargestellt. Das Set-up hier präsentiert ist in der Lage SIM superauflösende Bildgebung bei 20 Hz in drei Farben, von denen zwei in TIRF-SIM betrieben werden. Das ganze System ist um ein inverses Mikroskop Rahmen aufgebaut und verwendet eine motorisierte XY - Translationsstufe mit einem piezobetätigten Z - Stufe. Um die sinusförmigen Erregungsmuster, die für TIRF-SIM generieren, präsentiert das System einen ferroelektrischen räumlichen Lichtmodulator (SLM). Binäre Gitterstrukturen sind auf dem SLM angezeigt und die resultierenden ± 1 Beugungsordnungen werden gefiltert, weitergeleitet und fokussiert in das TIR-Ring der Objektivlinse. Die erforderlichen Phasenverschiebungen und Drehungen der Gitter werden durch Ändern der angezeigten SLM Bild angewendet. Dieses Protokoll beschreibt, wie zu bauen, und eine solche Anregungspfad auszurichten, beschreibt die Ausrichtung der Emissionspfad und zeigt Testproben für eine optimale Ausrichtung gewährleistet ist. Es de auch<html> ritzt die Probleme und Herausforderungen, insbesondere für High-Speed-TIRF-SIM in Bezug auf eine Polarisationssteuerung und Synchronisation von Komponenten. Design-Überlegungen und Einschränkungen Vor der Montage in diesem Protokoll das TIRF-SIM-System präsentiert, gibt es mehrere Designbeschränkungen zu berücksichtigen, die die Wahl von optischen Komponenten bestimmen. Alle Abkürzungen von optischen Komponenten siehe Abbildung 1. Spatial Light Modulator (SLM) Eine binäre ferroelektrischen SLM ist in dieser Konfiguration verwendet, wie es in der Lage Musterschalt Sub-Millisekunden ist. Graustufen-nematischen SLMs verwendet werden, aber diese bieten stark reduzierte Schaltzeiten. Jeweils ein oder aus Pixel in einem binären Phasen SLM wird verleihen entweder ein π oder 0-Phase zu der einfallenden ebenen Wellenfront versetzt, also wenn ein periodisches Gittermuster auf dem SLM angezeigt wird Gitter als Phasenbeugungs arbeitet. ent &quot;&gt; Total Internal Reflection (TIR) Um TIR erreichen und eine abklingende Feld erzeugen, der Einfallswinkel der Anregungsstrahlen an der Glasprobe Schnittstelle muss größer sein als der kritische Winkel <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq1.jpg" /> . Dies legt die minimale Einfallswinkel erforderlich und damit auch den maximalen Abstand oder Zeit des abklingenden Beleuchtungsmusters. Der maximale Einfallswinkel <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq2.jpg" /> (Akzeptanzwinkel) wird durch die numerische Apertur (NA) der Objektivlinse begrenzt, die von der Definition berechnet werden kann, <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq3.jpg" /> . Dies bestimmt die minimale Muster erreichbare Abstand entsprechend der Abbe Formel <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq4.jpg" /> welche Links NA und Wellenlänge <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq5.jpg" /> auf den minimalen Musterabstand <imgalt = &quot;Gleichung&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53988 / 53988eq6.jpg&quot; /&gt;. In der Praxis ergibt eine 1,49 NA Ölkapselung TIRF Ziel einen maximalen Einfallswinkel von etwa 79 ° und einer minimalen Musterperiode auf der Probe von 164 nm eine Anregungswellenlänge von 488 nm verwendet wird. Diese beiden Winkel definieren , um einen Ring in der hinteren Öffnung des Objektivs über die das Gerät erreicht TIR Beleuchtungs (dh. Der TIR - Ring) , und in dem die zwei Anregungs Brennpunkte genau positioniert werden müssen und exakt jeden Beleuchtungsmuster zu erzeugen , gedreht wird . Die Rekonstruktion der TIRF-SIM - Bilder erfordert der Erwerb von mindestens drei Phasenverschiebungen pro Musterrotation daher die Musterperiode SLM muss von 3 (siehe Abbildung 1) teilbar sein. Beispielsweise einen Zeitraum von 9 Pixeln für 488 nm Beleuchtung und 12 Pixel für 640 nm Licht. Für eine umfassende Diskussion des SLM-Musterentwurf, einschließlich Subpixel-Optimierung des Musters mit gescherten Gitter AbstandZu sehen, die bisherige Arbeit von Kner et al. 16 und Lu-Walther et al. 20 , um die Position der beiden Erregungsherde innerhalb des TIR - Ring sein muss für alle Wellenlängen, jedoch den Beugungswinkel der ± 1 Aufträge von der SLM Wellenlänge abhängig. Für Standard-SIM, Multicolor-Bildgebung kann durch eine Optimierung der Gitterperiode für die längste Wellenlänge, und Tolerierung einen Verlust in der Leistung für die kürzeren Kanäle erreicht werden. jedoch für TIRF-SIM, bedeutet für eine Wellenlänge zu optimieren, dass die andere Wellenlänge Brennpunkte sind nicht mehr im TIR-Ring. Zum Beispiel ist eine Gitterperiode von 9 Pixeln ausreichend TIRF bereitzustellen, um 488 nm, da die Schwerpunkte bei 95% des Durchmessers der hinteren Öffnung und innerhalb des TIR-Ring sind, aber für 640 nm dieser Zeit würde die Foci Außenposition die Öffnung. Aus diesem Grund verschiedene Pixelmuster Abstände müssen für jede Anregungswellenlänge verwendet werden. Die Ausrichtung der TIRF-SIM-Anregungspfadist extrem empfindlich gegenüber kleinen Veränderungen in der Position des dichroitischen Spiegels (DM4 in 1) in dem Mikroskopkörper, viel mehr als in herkömmlichen SIM. Verwendung eines rotierenden Filterwürfel Revolvers ist nicht zu empfehlen, kann stattdessen eine einzige Mehrband dichroitischer Spiegel, der in einer festen Position gehalten wird und zwar für die Anregungswellenlängen verwendet ausgelegt. Es ist wesentlich, dass nur die höchsten Qualitäts dichroitische Spiegel verwendet werden. Diese erfordern dicke Substrate von mindestens 3 mm und sind als &quot;Imaging-flat&quot; von den Herstellern oft bezeichnet. Alle anderen Substrate führen zu unerträglichen Aberration und Bildverschlechterung in TIRF-SIM. polarisations~~POS=TRUNC Zu erreichen TIRF-SIM ist es wesentlich , den Polarisationszustand des Anregungslichts in Synchronität mit dem Beleuchtungsmuster zu drehen , so dass sie azimutal polarisierter in der Objektivpupille Ebene in Bezug auf die optische Achse bleibt (dh. s-polarisiert). Ausrichtung der Polarisationssteuerungsoptik hängt von der spezifischen optischen Elements abhängen eingesetzt, beispielsweise eine Pockels - Zelle 21 oder eine Halbwellenplatte in einem motorischen Rotationsstufe 22. In diesem Protokoll eine benutzerdefinierte Flüssigkristall variablen Verzögerer (LCVR) verwendet wird, entworfen Vollwellen (2π) Retardierung über den Wellenlängenbereich von 488 bis 640 nm zur Verfügung zu stellen, wie es schnell (~ ms) Schalt ermöglicht. Wenn ein Flüssigkristall-Retarder Verwendung ist es wesentlich, eine hohe Qualität Komponente zu verwenden: Standardkomponenten sind in der Regel nicht stabil genug, um eine konstante Verzögerung über die Länge der Kamerabelichtungszeit zu geben, die auf eine aus dem Beleuchtungsmuster Unschärfen führt und niedrigen Modulationskontrast . Flüssigkristall Verzögerer sind auch stark temperaturabhängig und erfordern bei der Temperaturregelung eingebaut. Synchronisation Die Laser müssen mit dem SLM synchronisiert werden. Binary ferroelektrischen SLMs werden intern von s ausgeglichenwitching zwischen einem Ein-Zustand und Aus-Zustand. Die Pixel wirken nur als Halbwellenplatten entweder in ihre ein- oder ausgeschalteten Zustand, aber nicht während der Zwischenbildschaltzeit. Deshalb sollte der Laser nur während der Ein / Aus-Zuständen über die LED Freigabesignal von dem SLM eingeschaltet werden, um eine Verringerung der Musterkontrast zu verhindern aufgrund der Zwischenzustand der Pixel. Ein akustooptischer Modulator (AOM) könnte alternativ als schneller Shutter verwendet werden, wenn die Laser nicht digital moduliert werden kann. Wahl der Objektive Auf der Grundlage dieser Randbedingungen zu erzeugen, die erforderliche Verkleinerungs der SLM Ebene auf die Probenebene die gewünschte Beleuchtungsmuster bestimmt werden kann. Dies ermöglicht die Berechnung der Brennweiten der beiden Linsen L3 und L4 in dem Bild Umsetzteleskop und der Anregungs Kondensorlinse L5. In diesem System wird ein 100x / 1.49NA -Ölimmersionsobjektiv Objektiv mit 488 nm und 640 nm Anregung verwendet wird, verwendet daher Brennweiten von 300 und 140 mmfür L4 und L3 und 300 mm für L5, insgesamt Verkleinerungs von 357x, das entspricht einem SLM Pixelgröße von 38 nm auf der Probenebene geben. Unter Verwendung dieser Kombination von Linsen, Gitter SLM Perioden von 9 für 488 nm Beleuchtung und 12 Pixel für 640 nm Muster geben Abständen von 172 und 229 nm an der Probe, entsprechend Einfallswinkel von 70 ° und 67 ° sind. Für ein Glas-Wasser-Grenzfläche, ist der kritische Winkel 61 °, und ist unabhängig von der Wellenlänge, daher sind diese zwei Musterabstände TIRF Anregungs für beide Wellenlängen ermöglichen. Eine Objektivlinse mit einem Korrekturring ausgestattet ist, zur Korrektur der sphärischen Aberrationen nützlich durch Variationen in Deck Dicke eingeführt, oder wenn bei 37 ° C arbeitet. Bildrekonstruktion Sobald raw SIM-Daten erworben worden ist, ist es eine Frage der Rechenaufwand super-aufgelöste Bilder in einem zweistufigen Verfahren zu erzeugen. Erstens hat das Beleuchtungsmuster für die zu bestimmendejedes Bild und zum anderen müssen die Komponenten des SIM - Spektrum entsprechend getrennt und rekombiniert werden als die effektive OTF Unterstützung zu verdoppeln (siehe Abbildung 6, Einschübe). Die genaue Kenntnis der projizierten Beleuchtungsmuster ist von größter Bedeutung, da die superaufgelöste Frequenzkomponenten ungemischt sein müssen, so genau wie möglich Artefakte, die durch die restlichen Teile von überlappenden Komponenten zu verhindern. Wir bestimmen das Beleuchtungsmuster nach dem Verfahren a posteriori aus der rohen Bilddaten Parameter , die von Gustafsson eingeführt et al. 23 Kurz gesagt, eine Reihe von Beleuchtungsparameter , die eine normalisierte zweidimensionale Sinuskurve beschreibt hat für jede der gefunden werden <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq7.jpg" /> Erregungsmuster <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq8.jpg" /> : <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq9.jpg" /> Hiermit <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" /> und <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq11.jpg" /> beschreiben den Streifenkontrast und die Musterphase jedes m Einzelbild beginnend jeweils. Die Komponenten des Wellenvektors, <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq12.jpg" /> und <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq13.jpg" /> , Nur mit unterschiedlichen Orientierungen ändern <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq14.jpg" /> des Musters und kann angenommen ansonsten konstant. Um zu bestimmen, grob die Komponenten des Wellenvektors eine Kreuzkorrelation von Rohbild Spektren durchgeführt wird, die durch Anlegen Subpixel Verschiebungen zu einer der kreuzkorrelierten Bildern verfeinert wird als Überlappungs zu optimieren. Dies wird durch Multiplikation des Realraum Phasengradienten getan <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq15.jpg" /> dass eine Subpixel-Verschiebung in fre induzierenquenz-Raum. Man beachte, dass es nützlich ist, eine gute Schätzung der Wellenvektoren zu haben, vor dem eigentlichen Muster Schätzung und dies kann durch Abbilden einer fluoreszierenden Perlenschicht gefunden werden. Da der Phasenschritt zwischen verschobenen Muster ist <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq16.jpg" /> , Dh. <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq17.jpg" /> Kann die Trennung von Frequenzkomponenten durch eine Fourier entlang der &quot;Phasenachse&quot; Transformation durchgeführt werden. Die globale Phase <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq18.jpg" /> und der Streifenkontrast <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" /> kann dann komplexe lineare Regression von verschiedenen Komponenten bestimmt werden. Die einzelnen getrennten Komponenten werden dann ein generalisiertes Wiener-Filter kombiniert werden. Für eine detaillierte Beschreibung der beiden Parameterextraktion und Implementierung des verallgemeinerten Wiener-Filters verweisen wir den Leser auf Gustafssonet al. 23 , wo der gleiche Algorithmus verwendet wird.

<table><tbody><tr><td>488-nm-Laser</td><td>Toptica</td><td>iBeam SMART</td><td>mit digitaler Modulation</td></tr><tr><td>561-nm-Laser</td><td>Coherent</td><td>OBIS LS</td><td>mit digitaler Modulation</td></tr><tr><td>640-nm-Laser</td><td>Cobolt</td><td>MLD</td><td>mit digitaler Modulation</td></tr><tr><td>Siegroitische Langpassspiegel</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>zum Kombinieren von Anregungsstrahlen</td></tr><tr><td>Quad-Band-dichroitischer Spiegel</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>3 mm dick, TIRF-Bildgebung flach, montiert in Olympus BX-Filterwürfel</td></tr><tr><td>Quad-Band-dichroitischer Spiegel</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>Aus der gleichen Charge wie oben, 25 x 25 mm</td></tr><tr><td>1" quadratische kinematische Halterung</td><td>Edmund Optics</td><td>58-860</td><td></td></tr><tr><td>Glan-Taylor Calcit Polarisatoren</td><td>Thorlabs</td><td>GT5-A</td><td>Zum Ausrichten von LCVR</td></tr><tr><td>Glan-Taylor Halterung</td><td>Thorlabs</td><td>SM05PM5</td><td></td></tr><tr><td>Achromatische Halbwellenplatte</td><td>Thorlabs</td><td>AHWP05M-600</td><td>400-800 nm</td></tr><tr><td>Rotationskäfighalterung</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1/M</td><td>Für HWP</td></tr><tr><td>Flüssigkristall Variabler Retarder</td><td>Meadowlark Optics</td><td>SWIFT</td><td>Speziell entwickelt, um eine volle Wellenverzögerung über den Bereich von 488 bis 640 nm zu bieten.</td></tr><tr><td>LCVR-Controller</td><td>Meadowlark Optics</td><td>D3060HV</td><td>Zweikanal-Hochspannungsregler für Flüssigkristallverzögerer</td></tr><tr><td>Achromatische Viertelwellenplatte</td><td>Meadowlark Optics</td><td>AQM-100-0545</td><td></td></tr><tr><td>Rotationskäfighalterung</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1P/M</td><td>Für QWP</td></tr><tr><td>10 mm achromatisches Doublet</td><td>Thorlabs</td><td>AC080-010-A-ML</td><td>Für Strahlaufweiter</td></tr><tr><td>200 mm achromatisch Dublett</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>Für Strahlaufweiter</td></tr><tr><td>Käfig XY Translatoren</td><td>Thorlabs</td><td>CXY1</td><td></td></tr><tr><td>Ferroelektrischer Raumlichtmodulator</td><td>Forth Dimension Displays</td><td>M0787-00249&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>SXGA-3DM (IFF) Mikrodisplay Typ M249, 1.280 x 1.024 Pixel, mit Treiberplatine</td></tr><tr><td>SLM-Montagerahmen</td><td>Forth Dimension Displays</td><td>M0787-10014</td><td>Befestigung an speziell angefertigter Aluminiumhalterung</td></tr> <tr><td>& Oslash; 50,8 mm Gimbal-Spiegelhalterung</td><td>Thorlabs</td><td>GM200/M</td><td>Für SLM-Montage</td></tr><tr><td>Zweiachsiger linearer Verschiebungstisch mit drehbarer Plattform</td><td>Thorlabs</td><td>XYR1/M</td><td>Für SLM-Montage</td></tr><tr><td>Schienenträger</td><td>Newport</td><td>M-PRC-3</td><td>Für SLM-Montage</td></tr><tr><td>Optische Präzisionsschiene</td><td>Newport</td><td>PRL-6</td><td>Für SLM-Montage</td></tr><tr><td>300 mm achromatisches Doublet-Objektiv</td><td>Qioptiq</td><td>G322 273 322&nbsp;</td><td>f = 300 mm, 31,5 mm Durchmesser</td></tr><tr><td>140 mm achromatisches Doublet-Objektiv</td><td>Qioptiq</td><td>G322 239 322</td><td>f = 140 mm, 31,5 mm Durchmesser</td></tr><tr><td>Präzisions-XY-Translationshalterungen</td><td>Thorlabs</td><td>LM2XY</td><td></td></tr><tr><td>Objektivhalterungen</td><td>Thorlabs</td><td>SM2AD32</td><td>Zur Montage von 31,5 mm Objektiven in 2"-Fassungen</td></tr><tr><td>Translationstische</td><td>Comar</td><td>12XT65</td><td>Prismenschwanz, Seitenantrieb</td></tr><tr><td>XY-Übersetzer mit Differentialantrieben</td><td>Thorlabs</td><td>ST1XY-D/M</td><td>für Raumfilter</td></tr><tr><td>Rotationskäfighalterung</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1/M</td><td>für Raumfilter</td></tr><tr><td>300 mm achromatisches Dublett</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-300-A-ML</td><td>Anregungsröhrenlinse</td></tr><tr><td>Automatisierter XY-Tisch mit Z-Piezo-Deckplatte</td><td>ASI</td><td>PZ-2150-XYFT-PZ-IX71&nbsp;</td><td>mit MS-2000 Controller</td></tr><tr><td>Inverser Mikroskoprahmen</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>Olympus</td><td>UAPON100XOTIRF</td><td>100X/1.49NA</td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeits-Filterrad</td><td>Prior Scientific</td><td>HF110A</td><td>mit Prior ProScan III Controller</td></tr><tr><td>Bandpass-Emissionsfilter</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/30, FF01-676/29</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS-Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA Flash v4.0</td><td></td></tr><tr><td>Tisch-Inkubator</td><td>OKO Lab</td><td>H301-K-FRAME</td><td>Für die Bildgebung lebender Zellen, mit Bold Line Temperatur und CO2 Controllern</td></tr><tr><td>Optische Stifte aus Edelstahl</td><td>Thorlabs</td><td>TR-Serie</td><td>für die Aufnahme optischer Komponenten</td></tr><tr><td>Pfostenhalter</td><td>Thorlabs</td><td>PH-Serie</td><td>für die Aufnahme optischer Komponenten</td></tr><tr><td>Kinematische Spiegelhalterungen</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td>zur Montage von 1" Spiegeln</td></tr><tr><td>Scherinterferometer</td><td>Thorlabs</td><td>SI100</td><td></td></tr><tr><td>100 nm fluoreszierende Mikrosphären</td><td>Life Technologies</td><td>T-7279</td><td>Tetraspeck</td></tr><tr><td>Rhodamin 6G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83697-250MG</td><td></td></tr><tr><td>8 Well Glasbodenschalen</td><td>ibidi</td><td>80827</td><td>mit #1,5 Deckglas</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Kammer-Deckglas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155409</td><td>mit #1,5 Deckglas</td></tr><tr><td>0,01 mm Objektträger</td><td>EMS</td><td>68039-22</td><td></td></tr><tr><td>CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10613</td><td></td></tr></tbody></table>

ein leitfaden für strukturierte beleuchtung tirf mikroskopie bei hoher geschwindigkeit mit mehreren farben

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Optische Super-Resolution-Bildgebung mit strukturierter Beleuchtung Mikroskopie (SIM) ist eine Schlüsseltechnologie für die Visualisierung von Prozessen auf molekularer Ebene in der chemischen und biomedizinischen Wissenschaften. Obwohl kommerzielle SIM-Systeme verfügbar sind, Systeme, die benutzerdefinierte im Labor entwickelt werden können kommerzielle Systeme entwickeln, die diese in der Regel für einfache Bedienung und allgemeine Anwendungen, sowohl im Hinblick auf Abbildungstreue und Schnelligkeit. Dieser Artikel stellt eine ausführliche Anleitung zur SIM-System aufzubauen, die interne Totalreflexion (TIR) ​​Beleuchtung verwendet und ist in der Lage Bildgebung bei bis zu 10 Hz in drei Farben bei einer Auflösung erreicht 100 nm. Durch die Kombination von SIM und TIRF liefert das System eine bessere Bildkontrast als konkurrierende Technologien. Um das zu erreichen sind diese Spezifikationen, mehrere optische Elemente verwendet, um automatisierte Kontrolle über den Polarisationszustand und die räumliche Struktur des Beleuchtungslichts ermöglichen für alle verfügbaren Anregung wavelengths. Ausführliche Informationen über Hardware-Implementierung und Steuerung gegeben zu erreichen Synchronisation zwischen Anregungslicht Mustererzeugung, Wellenlänge, Polarisationszustand, und die Kamerasteuerung mit einem Schwerpunkt auf maximalen Erwerbsframerate zu erreichen. Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die System Ausrichtung und Kalibrierung wird vorgestellt und die erreichbare Auflösungsverbesserung wird auf ideale Testproben validiert. Die Fähigkeit zur Video-Rate superauflösende Bildgebung mit lebenden Zellen nachgewiesen werden.

Dieser Artikel bietet eine detaillierte Anleitung für den Aufbau und Betrieb eines Mikroskops mit strukturierter Beleuchtung, das mit Totalreflexions-Fluoreszenzbeleuchtung (TIRF-SIM) arbeitet, um dynamische biologische Prozesse mit optischer Superauflösung in mehreren Farben abzubilden.

Ein Leitfaden für Strukturierte Beleuchtung TIRF Mikroskopie bei hoher Geschwindigkeit mit mehreren Farben

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, ein Mikroskop mit strukturierter Beleuchtung zu konstruieren und auszurichten, das für die hochauflösende Hochgeschwindigkeitsbildgebung lebender Zellen geeignet ist und in TIRF- und optischen Schnittmodi mit mehreren Farben arbeiten kann. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Zellbiologie zu beantworten, die derzeit mit der standardmäßigen beugungsbegrenzten TIRF-Mikroskopie nicht beantwortet werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre schnelle Zeitauflösung im Vergleich zu anderen hochauflösenden Mikroskopietechniken, wodurch sie sich gut für die Abbildung dynamischer Prozesse in lebenden Zellen eignet.Obwohl dieses Protokoll die Schritte zum Bau eines TIRF-SIM-Mikroskops beschreibt, ist der Aufbau flexibel und leicht zu modifizieren, um Bildgebungsmodalitäten wie 3D-SIM, multifokale SIM und nichtlineare SIM zu implementieren. Um den Anregungsweg für ein Mikroskop mit strukturierter Beleuchtung anzuordnen und auszurichten, markieren Sie zunächst die Positionen der Komponenten auf dem optischen Tisch, wie hier angegeben. Nachdem Sie den ersten dichroitischen Spiegel, DM4, in den Filterwürfelrevolver des Mikroskoprahmens eingesetzt haben, setzen Sie den zweiten dichroitischen Spiegel, DM3, in eine 1 Zoll quadratische kinematische Spiegelhalterung ein und positionieren Sie ihn eine Brennweite von der Kondensorlinse L5 entfernt. Um den optischen Zugang für das System genau zu definieren, entfernen Sie als Nächstes die Objektivlinse (OB) vom Revolver und schrauben Sie stattdessen ein Ausrichtungswerkzeug ein.Verwenden Sie dann den dichroitischen Spiegel DM3 und einen temporären Ausrichtungsspiegel, der an der ungefähren endgültigen Position des SLM positioniert ist, um einen kollimierten Referenzstrahl vom ersten Laser durch die Mitte der Löcher in den beiden Ausrichtungsscheiben zu lenken. Mit drei Spiegeln und dem dichroitischen Spiegel DM2, wie hier abgebildet, richten Sie den Strahl vom ersten Laser auf den temporären Spiegel. Nachdem die grobe optische Achse bestimmt wurde, entfernen Sie das Ausrichtungswerkzeug.Setzen Sie dann eine Blende in den Strahlengang ein, bevor sie in das Mikroskopgehäuse eintritt, und zentrieren Sie sie auf dem Strahl. Befestigen Sie ein Stück weißen Karton mit einem kleinen Loch in der Mitte der Iris und setzen Sie dann die Objektivlinse wieder ein. Nehmen Sie als Nächstes iterative Winkelanpassungen an den Spiegeln DM3 und an der SLM-Position vor, um die Rückreflexion auf der Karte mit dem einfallenden Strahl zu zentrieren.Entfernen Sie dann vorübergehend die Objektivlinse und markieren Sie den Laserspot an der Decke, um eine Referenzposition zu erstellen. Setzen Sie die Tubuslinse L5 etwa eine Brennweite vom Objektiv entfernt ein und montieren Sie sie auf einen linearen Translationstisch, der so eingestellt ist, dass er entlang der Richtung des Referenzstrahls übersetzt. Stellen Sie die Position und den Winkel der Tubuslinse so ein, dass der Strahl, der das Objektiv verlässt, kollimiert wird und auf den Referenzpunkt an der Decke trifft.Überprüfen Sie, ob die Linse senkrecht zum Strahl steht, indem Sie die Rückreflexion mit der Blende und der weißen Karte erneut überprüfen. Entfernen Sie dann die Objektivlinse und setzen Sie die zweite Linse des Bildrelaisteleskops, L4, ein. Verwenden Sie den linearen Verschiebungstisch, um die Position und den Winkel dieser Linse anzupassen, um die Kollimation beizubehalten und sicherzustellen, dass der Referenzstrahl immer noch auf die markierte Stelle an der Decke trifft. Setzen Sie die Objektivlinse wieder ein und setzen Sie die erste Linse des Teleskops, L3, ein. Passen Sie die Position und den Winkel dieser Linse an, um eine Kollimation und Nichtablenkung zu gewährleisten, wie zuvor beschrieben.Nachdem Sie den SLM-Chip gemäß dem Textprotokoll montiert und die Linsen ausgerichtet haben, setzen Sie den SLM anstelle des Spiegels ein. Passen Sie die Position des SLM so an, dass sich der Referenzstrahl in der Mitte des SLM-Chips befindet, und stellen Sie den Winkel so ein, dass der Strahl durch die beiden Relaislinsen geht. Überprüfen Sie dann, ob der Referenzstrahl noch auf der markierten Stelle zentriert ist.Montieren Sie den variablen Flüssigkristall-Retarder (LCVR) mit seiner schnellen Achse in einem Winkel von 45 Grad zur einfallenden Polarisation. Nachdem Sie die Ausrichtung des Polarisationsrotators gemäß dem Textprotokoll unter Verwendung von Durchlicht durch die Okulare abgeschlossen haben, fokussieren Sie auf ein Absehen und fixieren Sie die Objektivlinse an dieser Position. Bereiten Sie dann eine Monoschicht aus fluoreszierenden Kügelchen vor, indem Sie einen Tropfen 100 Nanometer großer, mehrfarbiger Kügelchen auf ein Deckglas mit der Nummer 1,5 verteilen.Lassen Sie die Kügelchen trocknen, damit sie am Glas adsorbieren, bevor Sie sie wieder in Wasser tauchen. Legen Sie die Bead-Probe mit Immersionsöl auf das Objektiv. Passen Sie die Position der Kamera so an, dass die fluoreszierende Perlenschicht scharf ist.Nachdem Sie SIM-Binärgittermuster als Bitmap-Dateien generiert und gemäß dem Textprotokoll auf das SLM hochgeladen haben, laden Sie die SLM-Steuerungssoftware und klicken Sie auf Verbinden. Klicken Sie auf der Registerkarte "Repertoire" auf "Laden", um die Repertoire-Datei zu öffnen und die Anzahl der in der Datei enthaltenen Running Orders zu überprüfen. Klicken Sie auf "An Board senden", um die Repertoiredatei auf das SLM hochzuladen.Wählen Sie anschließend die Registerkarte "Status" und geben Sie die Nummer der Running Order ein. Klicken Sie auf "Auswählen", um die Fahrreihenfolge auf das Ausrichtungsgitter zu ändern. Setzen Sie eine auf einem XY-Tisch montierte Raummaske (SM) in den Strahlengang in der Fokusposition von L3 ein und verschieben Sie ihre Position in Bezug auf die optische Achse, so dass nur die gewünschten ersten Ordnungen durchlaufen werden.Direkt nach dem räumlichen Filter sind nur zwei kreisförmige Balken sichtbar. Überprüfen Sie das Bild der fluoreszierenden Perlenschicht auf der Kamera. Wenn sich die beiden kreisförmigen Strahlen nicht wie hier dargestellt überlappen, positionieren Sie die Probenebene neu, indem Sie die Position des Objektivs und der Kamera iterativ anpassen.Nach der Feinabstimmung des Fokus und der Einstellung der Probenebene gemäß dem Textprotokoll bestätigen Sie die TIRF-Beleuchtung, indem Sie z. B. eine Lösung von 10 mikromolaren Rhodamin 6G-Farbstoffen abbilden, indem Sie den Farbstoff in den Fokus bringen. Wenn die beiden Strahlen im richtigen TIRF-Winkel einfallen, sind einzelne Moleküle ohne hohen Hintergrund sichtbar, und die Ränder der kreisförmigen Apertur sind scharf. Feinjustierungen an der Position der Strahlen können durch Justieren des dichroitischen Spiegels DM3 vorgenommen werden.Um das System zu synchronisieren und zu kalibrieren, platzieren Sie die Bead-Monolayer-Probe auf dem Objektiv und stellen Sie sie in den Fokus. Verwenden Sie die SLM-Steuerungssoftware, um das SLM so zu programmieren, dass jedes der drei Phasenverschiebungsbilder nacheinander für die erste Musterausrichtung angezeigt wird. Wechseln Sie dann zur Running Order vier des Beispielrepertoires.Konfigurieren Sie die Kamera in der Erfassungssoftware für die globale Belichtungszeit, indem Sie "Erweiterte Kameraeigenschaften" wählen und "Output Trigger Kind 1" auf positiv und Output Trigger Kind 2" auf negativ setzen. Wählen Sie im Sequenzbereich unter Scantyp die Option Festplattendatensatz aus, und legen Sie die Frameanzahl auf drei fest. Klicken Sie dann auf Start", um drei Frames zu erfassen.Das SLM-Muster ändert sich bei jeder Belichtung. Nachdem Sie das System gemäß dem Textprotokoll kalibriert haben, schalten Sie in der SLM-Steuerungssoftware die SLM-Running Order auf die vollständige Serie von neun binären Gitterbildern um, die für TIRF-SIM benötigt werden. Dies ist die Running Order Null im Beispielrepertoire.Nachdem Sie neun Bilder der Bead-Probe aufgenommen haben, wählen Sie im Sequenzbereich der Kamerasoftware "Festplattenaufzeichnung" als Scantyp aus und ändern Sie die Anzahl der Bilder auf neun. Klicken Sie dann auf Start", um Bilder aufzunehmen. Wählen Sie abschließend unter Gepufferte Bilder speichern die Option TIFF als Bildtyp aus und klicken Sie auf OK. Rekonstruieren Sie ein hochauflösendes Bild gemäß dem Textprotokoll.Hier wurden mehrfarbige fluoreszierende Kügelchen mit einem Durchmesser von 100 Nanometern abgebildet, um Standard-TIRF mit TIRF-SIM zu vergleichen. TIRF-SIM hatte im Vergleich zu TIRF eine deutlich höhere laterale Auflösung. Die geschätzte Auflösung des Mikroskops beträgt 90 Nanometer bzw. 120 Nanometer für 488 bzw. 640 Nanometer TIRF-SIM.Dies entspricht einer zweifachen Verbesserung der lateralen Auflösung für beide Wellenlängen im Vergleich zum theoretischen beugungsbegrenzten Fall. Wie hier zu sehen, wurden fluoreszenzmarkierte Amyloidfibrillen in vitro gebildet und auch als Testprobe zum Nachweis einer verdoppelten Auflösung verwendet. Subzelluläre Strukturen mit hohem Kontrast, wie z. B. emGFP-markierte Mikrotubuli oder LifeAct-GFP, sind ideal für die TIRF-SIM-Bildgebung und liefern kontrastreiche, hochauflösende Bilder.Die TIRF-SIM-Bildgebung mit dem demonstrierten Aufbau ermöglicht die Beobachtung einer Subpopulation von Mikrotubuli, die sich in der Nähe der Basalzellrinde befindet, und die Polymerisation und Depolymerisation von Mikrotubuli kann im Laufe der Zeit beobachtet werden. Proben mit niedrigem Kontrast ohne diskrete Strukturen haben außer an den Rändern der Plasmamembran keine hochauflösenden Informationen und sind daher für die TIRF-SIM-Bildgebung suboptimal. Schließlich ist ein hoher Modulationskontrast für eine erfolgreiche SIM-Bildgebung unerlässlich.Wie hier gezeigt, ermöglicht die Fourier-Transformation des rekonstruierten Bildes die Visualisierung der optischen Übertragungsfunktion der SIM. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa einer Woche abgeschlossen werden, wenn alle notwendigen Teile erworben wurden. Wenn man dieses Verfahren versucht, muss man sich der wichtigsten Punkte für eine erfolgreiche Implementierung von TIRF-SIM bewusst sein.Zunächst ist eine präzise Ausrichtung der Balken unerlässlich. Dies kann schwierig sein, da sie sich an den Rändern der Blende des Objektivs befinden müssen. Zweitens ist es entscheidend, dass der Polarisationszustand des Lichts mit dem Muster mitgedreht wird.Ohne dies ist der Musterkontrast der Probe gering und eine spätere Bildkonstruktion unmöglich. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für die wichtigsten Schritte bei der Konstruktion und Ausrichtung eines SLM-basierten TIRF-SIM-Mikroskops haben. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lasern der Klasse 3B äußerst gefährlich sein kann.Die Laserleistung muss während des Ausrichtungsprozesses mit dem TIRF-Objektiv auf augensicherem Niveau gehalten werden.

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Biotechnik

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