Ein Leitfaden für Strukturierte Beleuchtung TIRF Mikroskopie bei hoher Geschwindigkeit mit mehreren Farben
30. Mai 2016
Dieser Artikel bietet eine detaillierte Anleitung für den Aufbau und Betrieb eines Mikroskops mit strukturierter Beleuchtung, das mit Totalreflexions-Fluoreszenzbeleuchtung (TIRF-SIM) arbeitet, um dynamische biologische Prozesse mit optischer Superauflösung in mehreren Farben abzubilden.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, ein Mikroskop mit strukturierter Beleuchtung zu konstruieren und auszurichten, das für die hochauflösende Hochgeschwindigkeitsbildgebung lebender Zellen geeignet ist und in TIRF- und optischen Schnittmodi mit mehreren Farben arbeiten kann. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Zellbiologie zu beantworten, die derzeit mit der standardmäßigen beugungsbegrenzten TIRF-Mikroskopie nicht beantwortet werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre schnelle Zeitauflösung im Vergleich zu anderen hochauflösenden Mikroskopietechniken, wodurch sie sich gut für die Abbildung dynamischer Prozesse in lebenden Zellen eignet.
Obwohl dieses Protokoll die Schritte zum Bau eines TIRF-SIM-Mikroskops beschreibt, ist der Aufbau flexibel und leicht zu modifizieren, um Bildgebungsmodalitäten wie 3D-SIM, multifokale SIM und nichtlineare SIM zu implementieren. Um den Anregungsweg für ein Mikroskop mit strukturierter Beleuchtung anzuordnen und auszurichten, markieren Sie zunächst die Positionen der Komponenten auf dem optischen Tisch, wie hier angegeben. Nachdem Sie den ersten dichroitischen Spiegel, DM4, in den Filterwürfelrevolver des Mikroskoprahmens eingesetzt haben, setzen Sie den zweiten dichroitischen Spiegel, DM3, in eine 1 Zoll quadratische kinematische Spiegelhalterung ein und positionieren Sie ihn eine Brennweite von der Kondensorlinse L5 entfernt. Um den optischen Zugang für das System genau zu definieren, entfernen Sie als Nächstes die Objektivlinse (OB) vom Revolver und schrauben Sie stattdessen ein Ausrichtungswerkzeug ein.
Verwenden Sie dann den dichroitischen Spiegel DM3 und einen temporären Ausrichtungsspiegel, der an der ungefähren endgültigen Position des SLM positioniert ist, um einen kollimierten Referenzstrahl vom ersten Laser durch die Mitte der Löcher in den beiden Ausrichtungsscheiben zu lenken. Mit drei Spiegeln und dem dichroitischen Spiegel DM2, wie hier abgebildet, richten Sie den Strahl vom ersten Laser auf den temporären Spiegel. Nachdem die grobe optische Achse bestimmt wurde, entfernen Sie das Ausrichtungswerkzeug.
Setzen Sie dann eine Blende in den Strahlengang ein, bevor sie in das Mikroskopgehäuse eintritt, und zentrieren Sie sie auf dem Strahl. Befestigen Sie ein Stück weißen Karton mit einem kleinen Loch in der Mitte der Iris und setzen Sie dann die Objektivlinse wieder ein. Nehmen Sie als Nächstes iterative Winkelanpassungen an den Spiegeln DM3 und an der SLM-Position vor, um die Rückreflexion auf der Karte mit dem einfallenden Strahl zu zentrieren.
Entfernen Sie dann vorübergehend die Objektivlinse und markieren Sie den Laserspot an der Decke, um eine Referenzposition zu erstellen. Setzen Sie die Tubuslinse L5 etwa eine Brennweite vom Objektiv entfernt ein und montieren Sie sie auf einen linearen Translationstisch, der so eingestellt ist, dass er entlang der Richtung des Referenzstrahls übersetzt. Stellen Sie die Position und den Winkel der Tubuslinse so ein, dass der Strahl, der das Objektiv verlässt, kollimiert wird und auf den Referenzpunkt an der Decke trifft.
Überprüfen Sie, ob die Linse senkrecht zum Strahl steht, indem Sie die Rückreflexion mit der Blende und der weißen Karte erneut überprüfen. Entfernen Sie dann die Objektivlinse und setzen Sie die zweite Linse des Bildrelaisteleskops, L4, ein. Verwenden Sie den linearen Verschiebungstisch, um die Position und den Winkel dieser Linse anzupassen, um die Kollimation beizubehalten und sicherzustellen, dass der Referenzstrahl immer noch auf die markierte Stelle an der Decke trifft. Setzen Sie die Objektivlinse wieder ein und setzen Sie die erste Linse des Teleskops, L3, ein. Passen Sie die Position und den Winkel dieser Linse an, um eine Kollimation und Nichtablenkung zu gewährleisten, wie zuvor beschrieben.
Nachdem Sie den SLM-Chip gemäß dem Textprotokoll montiert und die Linsen ausgerichtet haben, setzen Sie den SLM anstelle des Spiegels ein. Passen Sie die Position des SLM so an, dass sich der Referenzstrahl in der Mitte des SLM-Chips befindet, und stellen Sie den Winkel so ein, dass der Strahl durch die beiden Relaislinsen geht. Überprüfen Sie dann, ob der Referenzstrahl noch auf der markierten Stelle zentriert ist.
Montieren Sie den variablen Flüssigkristall-Retarder (LCVR) mit seiner schnellen Achse in einem Winkel von 45 Grad zur einfallenden Polarisation. Nachdem Sie die Ausrichtung des Polarisationsrotators gemäß dem Textprotokoll unter Verwendung von Durchlicht durch die Okulare abgeschlossen haben, fokussieren Sie auf ein Absehen und fixieren Sie die Objektivlinse an dieser Position. Bereiten Sie dann eine Monoschicht aus fluoreszierenden Kügelchen vor, indem Sie einen Tropfen 100 Nanometer großer, mehrfarbiger Kügelchen auf ein Deckglas mit der Nummer 1,5 verteilen.
Lassen Sie die Kügelchen trocknen, damit sie am Glas adsorbieren, bevor Sie sie wieder in Wasser tauchen. Legen Sie die Bead-Probe mit Immersionsöl auf das Objektiv. Passen Sie die Position der Kamera so an, dass die fluoreszierende Perlenschicht scharf ist.
Nachdem Sie SIM-Binärgittermuster als Bitmap-Dateien generiert und gemäß dem Textprotokoll auf das SLM hochgeladen haben, laden Sie die SLM-Steuerungssoftware und klicken Sie auf Verbinden. Klicken Sie auf der Registerkarte "Repertoire" auf "Laden", um die Repertoire-Datei zu öffnen und die Anzahl der in der Datei enthaltenen Running Orders zu überprüfen. Klicken Sie auf "An Board senden", um die Repertoiredatei auf das SLM hochzuladen.
Wählen Sie anschließend die Registerkarte "Status" und geben Sie die Nummer der Running Order ein. Klicken Sie auf "Auswählen", um die Fahrreihenfolge auf das Ausrichtungsgitter zu ändern. Setzen Sie eine auf einem XY-Tisch montierte Raummaske (SM) in den Strahlengang in der Fokusposition von L3 ein und verschieben Sie ihre Position in Bezug auf die optische Achse, so dass nur die gewünschten ersten Ordnungen durchlaufen werden.
Direkt nach dem räumlichen Filter sind nur zwei kreisförmige Balken sichtbar. Überprüfen Sie das Bild der fluoreszierenden Perlenschicht auf der Kamera. Wenn sich die beiden kreisförmigen Strahlen nicht wie hier dargestellt überlappen, positionieren Sie die Probenebene neu, indem Sie die Position des Objektivs und der Kamera iterativ anpassen.
Nach der Feinabstimmung des Fokus und der Einstellung der Probenebene gemäß dem Textprotokoll bestätigen Sie die TIRF-Beleuchtung, indem Sie z. B. eine Lösung von 10 mikromolaren Rhodamin 6G-Farbstoffen abbilden, indem Sie den Farbstoff in den Fokus bringen. Wenn die beiden Strahlen im richtigen TIRF-Winkel einfallen, sind einzelne Moleküle ohne hohen Hintergrund sichtbar, und die Ränder der kreisförmigen Apertur sind scharf. Feinjustierungen an der Position der Strahlen können durch Justieren des dichroitischen Spiegels DM3 vorgenommen werden.
Um das System zu synchronisieren und zu kalibrieren, platzieren Sie die Bead-Monolayer-Probe auf dem Objektiv und stellen Sie sie in den Fokus. Verwenden Sie die SLM-Steuerungssoftware, um das SLM so zu programmieren, dass jedes der drei Phasenverschiebungsbilder nacheinander für die erste Musterausrichtung angezeigt wird. Wechseln Sie dann zur Running Order vier des Beispielrepertoires.
Konfigurieren Sie die Kamera in der Erfassungssoftware für die globale Belichtungszeit, indem Sie "Erweiterte Kameraeigenschaften" wählen und "Output Trigger Kind 1" auf positiv und Output Trigger Kind 2" auf negativ setzen. Wählen Sie im Sequenzbereich unter Scantyp die Option Festplattendatensatz aus, und legen Sie die Frameanzahl auf drei fest. Klicken Sie dann auf Start", um drei Frames zu erfassen.
Das SLM-Muster ändert sich bei jeder Belichtung. Nachdem Sie das System gemäß dem Textprotokoll kalibriert haben, schalten Sie in der SLM-Steuerungssoftware die SLM-Running Order auf die vollständige Serie von neun binären Gitterbildern um, die für TIRF-SIM benötigt werden. Dies ist die Running Order Null im Beispielrepertoire.
Nachdem Sie neun Bilder der Bead-Probe aufgenommen haben, wählen Sie im Sequenzbereich der Kamerasoftware "Festplattenaufzeichnung" als Scantyp aus und ändern Sie die Anzahl der Bilder auf neun. Klicken Sie dann auf Start", um Bilder aufzunehmen. Wählen Sie abschließend unter Gepufferte Bilder speichern die Option TIFF als Bildtyp aus und klicken Sie auf OK. Rekonstruieren Sie ein hochauflösendes Bild gemäß dem Textprotokoll.
Hier wurden mehrfarbige fluoreszierende Kügelchen mit einem Durchmesser von 100 Nanometern abgebildet, um Standard-TIRF mit TIRF-SIM zu vergleichen. TIRF-SIM hatte im Vergleich zu TIRF eine deutlich höhere laterale Auflösung. Die geschätzte Auflösung des Mikroskops beträgt 90 Nanometer bzw. 120 Nanometer für 488 bzw. 640 Nanometer TIRF-SIM.
Dies entspricht einer zweifachen Verbesserung der lateralen Auflösung für beide Wellenlängen im Vergleich zum theoretischen beugungsbegrenzten Fall. Wie hier zu sehen, wurden fluoreszenzmarkierte Amyloidfibrillen in vitro gebildet und auch als Testprobe zum Nachweis einer verdoppelten Auflösung verwendet. Subzelluläre Strukturen mit hohem Kontrast, wie z. B. emGFP-markierte Mikrotubuli oder LifeAct-GFP, sind ideal für die TIRF-SIM-Bildgebung und liefern kontrastreiche, hochauflösende Bilder.
Die TIRF-SIM-Bildgebung mit dem demonstrierten Aufbau ermöglicht die Beobachtung einer Subpopulation von Mikrotubuli, die sich in der Nähe der Basalzellrinde befindet, und die Polymerisation und Depolymerisation von Mikrotubuli kann im Laufe der Zeit beobachtet werden. Proben mit niedrigem Kontrast ohne diskrete Strukturen haben außer an den Rändern der Plasmamembran keine hochauflösenden Informationen und sind daher für die TIRF-SIM-Bildgebung suboptimal. Schließlich ist ein hoher Modulationskontrast für eine erfolgreiche SIM-Bildgebung unerlässlich.
Wie hier gezeigt, ermöglicht die Fourier-Transformation des rekonstruierten Bildes die Visualisierung der optischen Übertragungsfunktion der SIM. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa einer Woche abgeschlossen werden, wenn alle notwendigen Teile erworben wurden. Wenn man dieses Verfahren versucht, muss man sich der wichtigsten Punkte für eine erfolgreiche Implementierung von TIRF-SIM bewusst sein.
Zunächst ist eine präzise Ausrichtung der Balken unerlässlich. Dies kann schwierig sein, da sie sich an den Rändern der Blende des Objektivs befinden müssen. Zweitens ist es entscheidend, dass der Polarisationszustand des Lichts mit dem Muster mitgedreht wird.
Ohne dies ist der Musterkontrast der Probe gering und eine spätere Bildkonstruktion unmöglich. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für die wichtigsten Schritte bei der Konstruktion und Ausrichtung eines SLM-basierten TIRF-SIM-Mikroskops haben. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lasern der Klasse 3B äußerst gefährlich sein kann.
Die Laserleistung muss während des Ausrichtungsprozesses mit dem TIRF-Objektiv auf augensicherem Niveau gehalten werden.
Übersicht
Dieser Artikel bietet eine ausführliche Anleitung zum Aufbau und zur Justage eines Mikroskops mit strukturierter Beleuchtung für die schnelle Super-Auflösungs-Abbildung lebender Zellen mittels TIRF-SIM. Diese Methode eignet sich besonders zur Abbildung dynamischer biologischer Prozesse in mehreren Farben.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Mikroskopische Techniken
- Super-Auflösungs-Mikroskopie
Hintergrund
- Die Standard-TIRF-Mikroskopie weist Grenzen bei der Auflösung dynamischer Prozesse auf.
- Super-Auflösungstechniken verbessern die Abbildungsmöglichkeiten.
- Die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM) bietet eine schnellere zeitliche Auflösung.
- Dieses Protokoll ermöglicht flexible Modifikationen am Mikroskopaufbau.
Zweck der Studie
- Einen TIRF-SIM-Mikroskop für die fortgeschrittene Bildgebung aufzubauen.
- Die Untersuchung biologischer Prozesse, die eine hohe zeitliche Auflösung erfordern, zu ermöglichen.
- Eine detaillierte Anleitung bereitzustellen, damit Forscher die Einrichtung nachvollziehen können.
Verwendete Methoden
- Ausrichtung optischer Komponenten, einschließlich dichroischer Spiegel und Linsen.
- Verwendung eines variablen Verzögerungsglieds mit flüssigen Kristallen zur Polarisationskontrolle.
- Herstellung fluoreszierender Kügelchenproben zur Kalibrierung.
- Implementierung der SLM-Steuerungssoftware zur Mustererzeugung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Justierung des TIRF-SIM-Mikroskops.
- Nachweis der Abbildungsfähigkeiten mit fluoreszierenden Kügelchen.
- Überprüfung der TIRF-Beleuchtungsbedingungen.
- Entwicklung eines Protokolls für zukünftige Abbildungsstudien.
Schlussfolgerungen
- Der TIRF-SIM-Aufbau ermöglicht die schnelle Abbildung dynamischer Prozesse.
- Mit dieser Methode können Fragen der Zellbiologie beantwortet werden, die zuvor unerreichbar waren.
- Die Flexibilität des Aufbaus erlaubt verschiedene Bildgebungsmodalitäten.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Bildgebung mit hoher Geschwindigkeit und mehreren Farben auf Super-Auflösungsebene erfüllt die Anforderung an die Visualisierung dynamischer Prozesse in Lebendzellanalysen und ermöglicht die mechanistische Absicherung therapeutischer Zielstrukturen durch direkte Beobachtung subzellulärer Dynamiken. TIRF-SIM liefert eine vorhersagbare Sicherheit bei der Zielstrukturvalidierung, indem nanoskalige Proteinwechselwirkungen und Transportvorgänge mit zeitlicher Genauigkeit aufgelöst werden, was Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch in der frühen Entdeckungsphase unterstützt. Diese Fähigkeit verbessert die Assay-Entwicklung für phänotypische Bildschirme, indem quantitative, räumlich aufgelöste Messwerte bereitgestellt werden, die das Vertrauen in die Zielstruktur erhöhen und falsch-positive Ergebnisse bei der Identifizierung von Wirkstoffkandidaten verringern.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Visualisierung der Proteinlokalisation und -dynamik mit einer Auflösung von 90–120 nm in lebenden Zellen.
- Operationaler Wert: Unterstützt die funktionelle Zielstrukturvalidierung durch direkte Beobachtung der Mikrotubuli-Polymerisation und -Depolymerisation nahe der basalen Zellkortex.
- Predictiver Wert: Erhöht die Zuverlässigkeit von Target-Engagement-Studien, indem Subpopulationen von Mikrotubuli und Amyloid-Fibrillen mit doppelter lateraler Auflösung gegenüber der Beugungsgrenze aufgelöst werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Workflows vor, indem mit fluoreszierenden Perlen-Monolagen kalibriert wird, um Auflösungsstandards zu etablieren.
- Operativer Wert: Stellt Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays sicher durch synchronisierte Erzeugung von SLM-Mustern, Wellenlängensteuerung und Kameratriggerung für eine konsistente Aufnahme von Einzelbildern.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform über verschiedene Anregungswellenlängen (488 nm, 640 nm) und bildgebende Verfahren hinweg, einschließlich TIRF und optischer Schnittbildgebung.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationaler Zusammenhang: Verbindet Entdeckungsbeobachtungen subzellulärer Strukturen (z. B. emGFP-Mikrotubuli, LifeAct-GFP) mit der präklinischen Validierung durch hochkontrastreiche, superauflösende Bildgebung.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht die mechanistische Absicherung durch Visualisierung dynamischer Prozesse in lebenden Zellen, die für herkömmliche TIRF-Verfahren unsichtbar sind, und unterstützt so die Zielstrukturauswahl.
- Krankheitsrelevante Systeme: Zeigt die Anwendbarkeit an lebenden Zellmodellen auf und unterstützt die Biomarkerabstimmung für Prozesse wie die Mikrotubulindynamik bei Neurodegeneration oder Krebs.
Pipeline- und Workflow-Integration
Platziert die Methode im Bereich der frühen Entdeckung bis zur Identifizierung von Leitverbindungen, wo die nanoskalige Auflösung dynamischer Prozesse die Zielvalidierung und die Bereitschaft von Assays für die Verbindungsscreening unterstützt.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch die Auflösung nanoskaliger Proteinverteilungen und -dynamiken in lebenden Zellmodellen.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch quantitative, hochfrequente Bildgebung (bis zu 10 Hz) mit Multifarb-Fähigkeit zur zuverlässigen Evaluierung von Substanzen.
- Analytik: Liefert statistische Auswertungen anhand rekonstruierter Super-Auflösungs-Bilder und Validierung mittels optischer Transferfunktion auf Basis der Fourier-Transformation zum Vergleich verschiedener Bedingungen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Forschung durch die abbildungsbasierte Analyse krankheitsrelevanter subzellulärer Strukturen mit hohem Kontrast und hoher Auflösung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Positioniert das System als wiederverwendbare Technologie für mehrere Bildgebungsmodalitäten (TIRF-SIM, 3D-SIM, multifokale SIM) über verschiedene Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung und Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten in der Live-Cell-Bildgebung.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch automatisierte Steuerung von Polarisation, räumlicher Struktur und Wellenlängensynchronisation.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitaleffizienz und geringeres biologisches Risiko in fortgeschrittenen Entwicklungsstadien durch frühzeitige Visualisierung der Zielmolekül-Dynamik.
- Portfolio-Implikationen: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Weiterentwicklungsentscheidungen basierend auf direkter Beobachtung des Verhaltens therapeutischer Zielstrukturen in physiologisch relevanten Kontexten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in optischer Justage, Lasersicherheit (Klasse 3B) und Mustererzeugung mittels SLM für strukturierte Beleuchtung.
- Benötigt Instrumentierung zur Polarisationskontrolle (flüssigkristalliner variabler Retarder), Hochgeschwindigkeitskamera-Auslösung und Integration von Mehrwellenlängenlasern.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg voraus, bezüglich Aufbaus auf dem optischen Tisch, Positionierung der Komponenten und Kalibrierungsprotokollen unter Verwendung fluoreszierender Einzelschicht-Perlen.
- Erfordert Anpassungen je nach Probentyp, da kontrastarme Proben außer an Membranrändern keine hochauflösenden Informationen enthalten.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen wie die Notwendigkeit eines hohen Modulationskontrasts für erfolgreiche SIM-Aufnahmen sowie eine präzise Ausrichtung der Strahlen auf den Objektivaperturen.
