Name: Cokultur Assays zur Untersuchung Makrophagen und Mikroglia Stimulation von Glioblastom-Invasion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Lernen Sie Cokultur-Assays zur Untersuchung der Interaktion zwischen Glioblastomzellen und Makrophagen sowie Mikroglia. Diese Methode modelliert Tumorinvasion in vitro und hilft bei der Identifizierung potenzieller Therapeutika.

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Wir danken Dr. Konstantin Dobrenis für die Bereitstellung von murinen Mikroglia für diese Studien.

1. Fluoreszenzmarkierung von Zellen HINWEIS: Label Glioblastomzelllinien und Mikroglia mit Fluoreszenzfarbstoffen 9. Alternativ erzeugen Zelllinien , die konstitutiv fluoreszierende Proteine wie GFP / RFP ausdrücken , wie in 14 beschrieben. <ol><li> 80% konfluent am Tag der Färbung - Plate Zellen auf einer 6-Well-Platte, so dass sie 70 sein. Für die Maus - Glioblastoma - Zelllinie GL261 und menschliche Glioblastomzelllinie U87, Platte 1 x 10 6 und 1,5 x 10 6 Zellen, die jeweils auf einer 6 cm - Schale 24 Stunden vor der Färbung. </li><li> Bereiten fluoreszierende Zelle Fleck Farbstofflösung in DMSO und mit 5 uM Farbstoff zu Medien, entweder Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) oder Makrophagen-Serum freiem Medium (MSFM), Vortex gut. </li><li> Inkubiere die Zellen mit Farbstoff für 30 min bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Entfernen Farbstoff enthaltenden Medien und fügen Sie frisches Medium (RPMI oder MSFM) zu den Zellen. </li><li> Inkubiere Zellen für 30 min. Hinweis: Die Zellen sind jetztgebeizt und bereit, in Experiment verwendet werden. </li></ol> 2. Vorbeschichtete Matrix Kammer Cokultur Invasion Assay <ol><li> Differenzieren THP-1 - Zellen unter Verwendung von Phorbolmyristatacetat (PMA) 15. <ol><li> Platte 2 - 3 x 10 5 THP-1 - Zellen in 1,5 ml RPMI / 10% FBS in einer 6 - Well - Kulturplatte. Unmittelbar nach 100 nM PMA bei 37 ° C, 5% CO 2 für 48 Stunden hinzufügen Ausplattieren und Inkubieren. HINWEIS: Nach 48 Stunden THP-1-Zellen, die eine Differenzierung erfolgreich durchlaufen haben, werden adhärenten sein und auf eine runde Morphologie auf den Boden des Bohrlochs unter verbreiten. </li><li> Entfernen PMA durch einmal mit 1x PBS gewaschen und ersetzen mit frischem RPMI / 10% FBS. Warten Sie weitere 48 Stunden, bis die Zellen bereit sind, in Assays verwendet werden. </li></ol></li><li> Äquilibrieren Matrix vorbeschichtet Kammern indem sie in einer Vertiefung mit 500 ul Medium allein (kein Serum) Plazieren und Zugabe von 500 &amp; mgr; l Medium allein nach oben. Inkubieren Kammern für 2 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. <br/&gt; Hinweis: Pre-beschichtete Kammern vom Hersteller bezogen wurden; siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung. </li><li> Um sanft Zellen lösen (fluoreszenzmarkierte Glioblastomzelllinien und die Mikroglia / Makrophagen), entfernen Sie Medien aus Zellen, die durch Aspiration. Wash-Zellen auf Teller mit 2 mM EDTA / PBS. Hinzufügen 500 ul 2 mM EDTA / PBS und Inkubation für 5 - 10 min in einem Zellinkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Die Zellen in 5 ml Medium, enthaltend 0,3% Rinderserumalbumin (BSA). </li><li> Zentrifuge für 5 min bei 120 x g. </li><li> Absaugen Überstand und Pellet in MSFM / 0,3% BSA Medien (GL261 - Zellen und Mikroglia) oder RPMI / 0,3% BSA (für U87 und THP-1 - Zellen) , so daß die Konzentration der Zellen ist gleich 1 x 10 6 Zellen / ml . Verwenden Sie ein Hämozytometer die Zellen zu zählen. </li><li> In 500 ul Medium / 0,3% BSA pro Vertiefung von 24-Well-Platte. </li><li> Entfernen Medien von Kammern, die für mindestens 2 Stunden (Schritt 2.2) equilibriert wurden. Platz chambers in gut 500 ul Medium / 0,3% BSA (Schritt 2.7) enthält. </li><li> Wenn Inhibitoren verwendet werden, um ihre Wirkung auf die Makrophagen zu studieren / Mikroglia stimuliert Gliom Invasion, fügen Sie die entsprechende Konzentration sowohl an den unteren und oberen Abschnitte der Kammer. HINWEIS: Die Konzentrationen von CSF-1R eingesetzten Inhibitor vollständig kann 9 in Bezug finden Mikroglia stimuliert GL261 Glioblastom - Invasion zu verhindern. </li><li> In Abhängigkeit von den verwendeten Zelllinien, fügen Sie Zellen in die obere Kammer, wie in den nächsten beiden Schritten beschrieben: Maus Glioblastom (2.10.1) und humanen Glioblastom (2.10.2). <ol><li> Mix 1,5 x 10 5 GL261 (Glioblastom) Zellen (150 &amp; mgr; l) und 5 x 10 4 Maus Mikroglia (50 ul) (siehe Schritt 2.6 für Medien Details). Bringen Volumen auf 500 ul durch Zugabe von 300 &amp; mgr; l MSFM / 0,3% BSA. Hinzufügen Zellmischung in die obere Kammer und inkubieren bei 37 ° C, 5% CO 2 für 48 Stunden. HINWEIS: Murine Mikrogliazellen sind aus neugeborenen Mäusen isoliert, wie ich beschriebenn 1 6. </li></ol></li></ol> Mischungs 7,5 x 10 4 U87 (Glioblastom) Zellen (75 ul) und 2,5 x 10 &amp; sup4 ; THP1 (Makrophagen) Zellen (25 ul). Bringen Volumen in 500 &amp; mgr; l durch Zugabe von 400 &amp; mgr; l RPMI / 0,3% BSA. Fügen Sie das Zellgemisch in die obere Kammer. Inkubiere Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 24 Std. <ol><li> Nach der Inkubation entfernen Zellen von der Oberseite der Kammer, die durch leichtes Ansaugen und fixieren Kammern durch in 3,7% Formaldehyd in PBS platzieren. Erlauben Kammern für 15 min bei Raumtemperatur in Fixativ zu bleiben (oder über Nacht bei 4 ° C). Entfernen Fixiermittel durch leichtes Ansaugen und ersetzen mit 500 ul 1x PBS. Fahren Sie mit Abschnitt 4 für die Bildanalyse. HINWEIS: Experiment kann in 1x PBS in diesem Moment und gespeichert für die Bildgebung pausiert. Fluoreszenzfarbstoff-Signale können für bis zu 2 Wochen nach der Fixierung nachgewiesen werden. </li></ol> 3. Invasion Assay &quot;3D&quot; Embedding Gliom und Makrophagen / Mikroglia in Matrix <ol><li>Thaw Matrix Mischung über Nacht bei 4 ° C. Führen Sie alle weiteren Manipulationen unter Verwendung von Matrix auf Eis in der Haube. </li><li> Herstellung von 10 mg / ml Konzentration von Matrix in Medien (MSFM oder RPMI) mit 0,3% BSA auf Eis. HINWEIS: Auf Konzentration von Matrix ist typischerweise bei etwa 15 mg / ml. </li><li> Zur Herstellung von Zellen (mit der Bezeichnung in Schritt 1) ​​für die Aufhängung in der Matrix, entfernen Sie Medien aus Zellen, die durch Aspiration. Wash-Zellen auf Teller mit 2 mM EDTA / PBS. Hinzufügen 500 ul 2 mM EDTA / PBS zu den Zellen und inkubiere für 5 - 10 min in Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Die Zellen in 5 ml Medium, enthaltend 0,3% BSA. </li><li> Zentrifuge für 5 min bei 120 x g. </li><li> Absaugen Überstand von Pellets. Pellet in Medium / 0,3% BSA , so dass die Konzentration der Zellen auf 1 × 10 6 Zellen / ml entspricht. Verwenden Sie ein Hämozytometer die Zellen zu zählen. </li><li> Hinzufügen 1,5 x 10 5 GL261 - Zellen (in 150 &amp; mgr; l) + 5 × 10 4 Mikroglia - Zellen (in 50 &amp; mgr; l) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.Fügen Sie 2 x 10 5 GL261 - Zellen (200 ul) in einem separaten 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Die GL261-Zellen allein ohne Mikroglia dient als Kontrolle. </li><li> Spin-Zellen in Mikrofuge für 5 min bei 120 x g. </li><li> Die Zellen in 200 ul kalten Matrix auf dem Eis. </li><li> Tafel 50 &amp; mgr; l (50.000 Zellen) auf die Mitte des oberen Abteil von 8 um Porengröße Raumeinsatz. </li><li> bei 37 ° C inkubieren 30 min für die Polymerisation stattfindet. </li><li> Mit 200 &amp; mgr; l serumfreiem Medium in die obere Kammer und 700 &amp; mgr; l Serum, das Zellwachstumsmedium mit dem unteren gut. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO 2 für 48 Stunden. </li><li> Nach der Inkubation entfernen Zellen von der Oberseite der Kammer, die durch leichtes Ansaugen und fixieren Kammern durch in 3,7% Formaldehyd in PBS platzieren. Erlauben Kammern für 15 min bei Raumtemperatur in Fixativ zu bleiben (oder über Nacht bei 4 ° C). Entfernen Fixiermittel durch leichtes Ansaugen und ersetzen mit 500 ul 1x PBS. Fahren Sie mit Abschnitt 4 for Bildanalyse. </li></ol> 4. Imaging-Assays <ol><li> Entfernen Kammern von 3,7% Formaldehyd und waschen in gut frisch 500 ul 1x PBS enthält. HINWEIS: Verwenden Sie Kammern nicht trocknen lassen. </li><li> Mit einem Wattestäbchen reinigen sanft die nicht-invasive Zellen aus dem oberen Teil des Filters (Seite die Innenseite der Kammer zugewandt ist) durch die Filteroberfläche kratzen. Beginnen Sie sanft und erhöhen den Druck nach. Tun Sie dies mindestens 3 mal pro Kammer. </li><li> Legen Kammern entweder in einem Glasbodenschale oder lassen in einer 24-Well-Platte. </li><li> Legen Sie Probe auf der Bühne eines Epifluoreszenz oder konfokalen Laser-Fluoreszenz - Mikroskop mit Kamera und Bildaufnahmesoftware 9,10. </li><li> Nehmen Sie mehrere 10X oder 20X Bilder von repräsentativen Bereichen. </li><li> Verwendung einer Bildanalysesoftware, wie ImageJ, zählen die Anzahl der Glioblastom - Zellen , die den Filter an der Unterseite 9,10 überschritten haben. </li><li> Wenn die Abbildung der &quot;3D. &quot;Invasionstest (beschrieben in Abschnitt 3), eine Z - Stack Serie erzeugen ein fluoreszierendes Laser konfokalen Mikroskop 5-6 Verwendung Um das Bild der invasiven Zellpopulation an der Unterseite des Filters, folgen Sie dem Protokoll die Schritte 4,2-4,6 oben beschrieben. </li></ol>

<ol><li>Buckner, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clin+Proc%22%5BJournal%5D)">Central nervous system tumors.</a> Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).</li>
<li>Furnari, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+astrocytic+glioma%3A+genetics%2C+biology%2C+and+paths+to+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment.</a> Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).</li>
<li>Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The brain tumor microenvironment.</a> Glia. 60 (3), 502-514 (2012).</li>
<li>Li, W., Graeber, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+profile+of+microglia+under+the+influence+of+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro.+Oncol%22%5BJournal%5D)">The molecular profile of microglia under the influence of glioma.</a> Neuro. Oncol. 14 (8), 958-978 (2012).</li>
<li>Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+function+in+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglia function in brain tumors.</a> J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).</li>
<li>Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2Fmacrophages+promote+glioma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia/macrophages promote glioma progression.</a> Glia. 59 (3), 472-485 (2011).</li>
<li>Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+glioma+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Microglia promote glioma migration.</a> Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).</li>
<li>Wesolowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia-derived+TGF-beta+as+an+important+regulator+of+glioblastoma+invasion%3A+an+inhibition+of+TGF-beta-dependent+effects+by+shRNA+against+human+TGF-beta+type+II+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor.</a> Oncogene. 27 (7), 918-930 (2008).</li>
<li>Coniglio, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+stimulation+of+glioblastoma+invasion+involves+epidermal+growth+factor+receptor+%28EGFR%29+and+colony+stimulating+factor+1+receptor+%28CSF-1R%29+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling.</a> Mol Med. 18, 519-527 (2012).</li>
<li>Miller, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semapimod+sensitizes+glioblastoma+tumors+to+ionizing+radiation+by+targeting+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia.</a> PLoS One. 9 (5), (2014).</li>
<li>Goswami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+promote+the+invasion+of+breast+carcinoma+cells+via+a+colony-stimulating+factor-1%2Fepidermal+growth+factor+paracrine+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop.</a> Cancer Res. 65 (12), 5278-5283 (2005).</li>
<li>House, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+functional+S100A4+monomers+are+necessary+for+regulating+nonmuscle+myosin-IIA+and+HCT116+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion.</a> Biochemistry. 50 (32), 6920-6932 (2011).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activity+status+of+cofilin+is+directly+related+to+invasion%2C+intravasation%2C+and+metastasis+of+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors.</a> J Cell Biol. 173 (3), 395-404 (2006).</li>
<li>Zagzag, D. 1, Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+immunohistochemistry+as+a+novel+experimental+tool+for+the+detection+of+glioma+cell+invasion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo.</a> Brain Pathol. 13 (1), 34-37 (2003).</li>
<li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int. J. Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
<li>Dobrenis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+cell+culture+and+in+transplantation+therapy+for+central+nervous+system+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease.</a> Methods. 16 (3), 320-344 (1998).</li>
<li>Coniglio, S. J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+microglia+stimulated+glioblastoma+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion.</a> Matrix Biol. 32 (7-8), 372-380 (2013).</li>
<li>See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+regulatory+T+cells+and+microglia+in+glioblastoma-associated+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression.</a> J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die hoch invasive Art von hoher Astrozytomen und Glioblastomen machen diese Hirntumoren sehr tödlich. Es ist daher von größter Wichtigkeit, die molekularen und zellulären Mechanismen der Glioblastom-Invasion zu verstehen. Es wurde viel über den Prozess der Glioblastom - Invasion bereits gelernt , 17. Unter Verwendung der Testformate in diesem Dokument detailliert, unser Labor hat in Maus und Mensch-Modelle gezeigt, die damit verbundenen Tumor Makrophagen Gliom Zellinvasion durch 5 stimulieren - das 10-fache. ...

Glioblastoma multiforme ist eine aggressive menschliche Gehirn Krebs mit einer medianen Überlebenszeit von ca. 12 Monaten ab dem Zeitpunkt der Diagnose 1,2. Das Glioblastom ist eine der tödlichsten und klinisch herausfordernden Krebserkrankungen, wie es zu einer Standard-Chemotherapie und chirurgische Resektion resistent ist. Die diffuse Natur des Glioblastoms ermöglicht es Tumorzellen während der gesamten normalen Gehirn so dass die fortgeschrittenen Tumor praktisch unmöglich, chirurgisch reseziert vollständig zu verbreiten. Diese hochinvasive Aspekt ist ein Markenzeichen Merkmal von Glioblastomen und anderen fortgeschrittenen Astrozytome. Daher hat sich der Schwerpunkt von viel Forschung war auf dem molekularen Mechanismus der Glioblastomzellinvasion. Das Glioblastom Tumor - Mikroumgebung spielt eine wichtige Rolle bei der Malignität Festlegung 3-6. Tumor - assoziierte Makrophagen / Mikroglia wurden für die Förderung von Glioblastom - Invasion 7,8 verantwortlich sein gezeigt. Die meisten dieser Studien gemessen jedoch die Wirkung von Makrophagen / Mikroglia VerwendungAssays, die physisch von den Glioblastomzellen zu trennen. Unser Labor hat sich vorgenommen, verbesserte Tests zu erzeugen, die es uns erlauben, zu untersuchen, wie Glioblastom-Invasion auf Makrophagen / Mikroglia in Co-Kulturen abhängig ist und es uns ermöglichen, die dem Bild mit der physischen Interaktion zwischen ihnen während Invasion. Klassische Assays Zellinvasion sind die &quot;Standard&quot; Boyden-Kammer-Chemotaxis und Chemoinvasion Formate zu messen. Hier werden die Zellen untersucht werden sollen, werden in einer Kunststoffkammer plattiert, die ein Polycarbonat-Filter auf der Unterseite enthält, die Poren einer bestimmten Größe (in der Regel zwischen 0,4 und 8 um im Durchmesser) aufweist. Der Prozess der Zellinvasion beinhaltet eine physikalische Barriere, in der Regel von extrazellulärem Matrix-Protein zusammengesetzt ist. In der Chemoinvasion Assay verwendet die bevorzugte Matrix ist Matrigel (nachstehend als &quot;Matrix&quot;), eine extrazelluläre Matrixmischung Protein sezerniert von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) -Zellen der Maus Sarkom und besteht weitgehend aus colLag Typ IV und Laminin. Die Kammern werden dann in einer Gewebekulturvertiefung gelegt, die mit oder ohne Wachstumsfaktoren Zellkulturmedien enthält, die im Verdacht stehen, Invasion zu stimulieren. Zellen, die eine höhere invasive Kapazität haben wird bei einer höheren Frequenz durch die extrazelluläre Matrix beschichtete Filter einzudringen und an der Unterseite des Filters anhaften. Wir haben diesen Test modifiziert, um die Rolle der Mikroglia und Tumor-assoziierten Makrophagen auf Glioblastomzellinvasion zu beurteilen. Wir konnten in diesem Papier beschrieben unter Verwendung von Co - Kultur - Assays zu bestimmen , der die Mikroglia die Invasion von zwei Glioblastomzelllinien stimulieren kann von 5 bis 10 - fach 9,10. Dies spiegelt wider, was in Tiermodellen von Glioblastom beobachtet wird. Ferner entwickelten wir eine dreidimensionale Invasionsassay, wo die Wechselwirkungen zwischen Glioblastom-Zellen und Makrophagen / Mikroglia mehr direkt untersucht werden können. Das Ausmaß der Glioblastomzellinvasion durch macropha stimuliertges / Mikroglia im 3D-Test ist vergleichbar, was die Matrix beschichtete Kammer Ansatz gesehen verwendet. Ähnliche Tests wurden bisher entwickelten während Invasion 11-13 Mammakarzinoms Interaktionen mit Makrophagen zu untersuchen. Beide Methoden in diesem Dokument beschrieben werden, sollten in der Fähigkeit unterstützen, den molekularen Mechanismus (e) von Makrophagen / Mikroglia-stimulierten Invasion von Glioblastomzellen zu sezieren.

<table><tbody><tr><td>Corning BioCoat Matrigel Invasionskammer: Mit BD Matrigel Matrix</td><td>Corning/Fisher Scientific</td><td>Cat: 354481</td><td></td></tr><tr><td>Makrophagenserum Freie Medien (MSFM) (500 ml)</td><td>Life Technologies</td><td>12065-074</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Rot CMTPX Farbstoff</td><td>Life Technologies/Molekulare Sonden</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Grün CMFDA Farbstoff</td><td>Life Technologies/Molekulare Sonden</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>GL261 Zelllinie</td><td>National Cancer Institute (NCI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U87 Zelllinie</td><td>American Tissue Type Culture Collection</td><td>HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 Zelllinie</td><td>American Tissue Type Culture Collection</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (500 ml)</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehydlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell Polycarbonat-Membran-Zellkultureinsätze (8 & Mikro; M Pore) 48 pro Packung.</td><td>Corning</td><td>CLS3422</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 3-D-Kulturmatrix Basalmembranextrakt mit reduziertem Wachstumsfaktor, PathClear</td><td>Trevigen</td><td>3445-005-01</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>Cat: 10500064</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin, Fraktion V, mit Hitzeschock behandelt</td><td>Fisherscientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-Myristat-13-acetat (PMA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8139-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

cokultur assays zur untersuchung makrophagen und mikroglia stimulation von glioblastom-invasion

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (Grad IV Gliom) ist eine sehr aggressive Krebs beim Menschen mit einem medianen Überleben von 1 Jahr nach der Diagnose. Trotz der erhöhten Verständnis der molekularen Ereignisse, die Anlass zu Glioblastomen geben, bleibt dieser Krebs immer noch sehr resistent gegen herkömmliche Behandlung. Die chirurgische Resektion von hochgradigen Hirntumoren ist selten vollständig aufgrund der stark infiltrative Art von Glioblastomzellen. Therapeutische Ansätze, die daher Glioblastomzellinvasion zu dämpfen ist eine attraktive Option. Unser Labor und andere haben gezeigt, dass Tumor-assoziierten Makrophagen und Mikroglia (resident Gehirn Makrophagen) gezeigt stark Glioblastom-Invasion zu stimulieren. Das Protokoll in diesem Dokument beschrieben wird , verwendet Glioblastom-Makrophagen / Mikroglia Interaktion zu modellieren mit in - vitro - Kultur - Assays. Dieser Ansatz kann die Entwicklung und / oder Entdeckung von Medikamenten erheblich erleichtern, die die Kommunikation mit den Makrophagen zu stören, dass diese bösartige behav ermöglichtIOR. Wir haben zwei robuste Kokultur Invasionsassays eingesetzt, wo eine Mikroglia / Makrophagen Gliom Zellinvasion durch 5 stimulieren - das 10-fache. Glioblastoma-Zellen mit einem fluoreszierenden Marker markiert oder konstitutiv ein fluoreszierendes Protein exprimieren, werden ohne und mit Makrophagen / Mikroglia auf matrix-beschichteten Polycarbonat Kammer Einsätze überzogen oder in einer dreidimensionalen Matrix eingebettet. Zellinvasion durch Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie Bild bewertet und nur invasive Zellen auf der Unterseite des Filter zählen. Unter Verwendung dieser Assays mehrere pharmakologische Inhibitoren (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitinib und Semapimod) identifiziert wurden, die Makrophagen blockieren / stimuliert Mikroglia Glioblastom-Invasion.

Mit den Methoden, die hier skizziert haben wir gezeigt, dass Mikroglia und Makrophagen im Wesentlichen Glioblastomzellinvasion stimulieren kann. Zwei verschiedene Invasionsassays eingesetzt werden und sind in Abbildung 1 dargestellt. In 2 GL261 - Zellen , die konstitutiv das fluoreszierende Protein exprimieren mCherry ausplattiert wurden auf vorbeschichteten Kammern mit und ohne Mikroglia für 48 Stunden. GL261-Zellen wurden minimal invasive auf ihre eige...

Um das bösartige Verhalten von Krebs zu verstehen, müssen genaue Modelle erstellt werden, wie Tumorzellen mit Komponenten der Tumormikroumgebung, wie z.B. Makrophagen, interagieren. Hier beschreiben wir zwei Methoden zur Untersuchung der Interaktion von Glioblastomzellen mit tumorassoziierten Makrophagen und Mikroglia, bei denen die Wirkung auf die Glioblastominvasion bewertet wird.

Cokultur Assays zur Untersuchung Makrophagen und Mikroglia Stimulation von Glioblastom-Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Interaktion von Glioblastomzellen mit Mikroglia und Makrophagen während der Invasion in einem In-vitro-Assay zu modellieren. Daher kann diese Methode dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Tumormikroumgebung zu beantworten, beispielsweise, welche Verbindungen oder Behandlungen die Interaktion von Krebszellen mit Makrophagen – einem Zelltyp der Mikroumgebung – während des Fortschreitens zur Malignität beeinflussen können. Einer der Hauptvorteile dieser Technik liegt darin, dass sie relativ einfach durchzuführen ist, in angemessener Zeit abgeschlossen werden kann und eine genaue Modellierung der Glioblastom-Invasion in vivo zu ermöglichen scheint.Beginnen Sie mit der Differenzierung der gewünschten Zelllinie mittels Phorbolmyristatacetat wie folgt. Zunächst werden zwei bis drei Mal 10 hoch 5 THP-1-Zellen in 1,5 Milliliter Medium in einer sechswelligen Kulturplatte ausgesät. Unmittelbar nach dem Aussäen werden 100 Nanomolar PMA zugegeben und die Zellen für 48 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubiert.Nach 48 Stunden entfernen Sie die PMA, indem Sie das Medium abpipettieren, einmal mit 1× PBS waschen und frisches Medium hinzufügen. Inkubieren Sie weitere 48 Stunden, bis die Zellen für den Assay bereit sind. Anschließend bringen Sie die mit Matrix beschichteten Kammern ins Gleichgewicht, indem Sie sie in eine Vertiefung mit 500 Mikrolitern Medium ohne Serum stellen und dann 500 Mikroliter serumfreies Medium auf die Oberseite geben.Inkubieren Sie die Kammern zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Danach pipettieren Sie vorsichtig das Medium aus den Kulturgefäßen, die die fluoreszenzmarkierten Glioblastom-Zelllinien sowie die Mikroglia und Makrophagen enthalten. Geben Sie anschließend 500 Mikroliter einer zweimillimolaren EDTA-Lösung in PBS hinzu und inkubieren Sie für fünf bis zehn Minuten im Zellkultur-Inkubator.Sammeln Sie die Zellen in fünf Millilitern Medium, das 0,3 % Rinderserumalbumin enthält, und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 120 × g. Nach der Zentrifugation saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren das Zellpellet in geeignetem Medium auf eine Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Geben Sie anschließend 500 µL des geeigneten Mediums mit 0,3 % BSA in die Vertiefungen einer 24-Loch-Platte.Entfernen Sie dann das Medium aus den equilibrierten Kammern und stellen Sie die Kammern in die Vertiefungen der 24-Loch-Platte. Wenn Inhibitoren verwendet werden, um deren Einfluss auf die von Makrophagen oder Mikroglia stimulierten Gliom-Invasion zu untersuchen, geben Sie die entsprechende Konzentration sowohl in den unteren als auch in den oberen Teil der Kammer. Je nach verwendeter Zelllinie mischen Sie Glioblastomzellen und murine Mikroglia oder Gliomzellen und Makrophagenzellen gemäß den Angaben im schriftlichen Teil des Protokolls.Geben Sie die Zellmischung in die obere Kammer und inkubieren Sie 24 bis 48 Stunden, abhängig vom Zelltyp. Entfernen Sie nach der Inkubation die Zellen von der Oberseite der Kammer durch vorsichtige Aspiration. Anschließend bringen Sie die Kammern zur Fixierung in 3,7 % Formaldehyd in PBS.Lassen Sie die Kammern 15 Minuten bei Raumtemperatur in der Fixierlösung stehen. Entfernen Sie abschließend die Fixierlösung vorsichtig durch Absaugen und ersetzen Sie sie durch 500 µL einmaliger PBS. Tauen Sie zunächst die Matrixmischung über Nacht bei vier Grad Celsius auf.Bereiten Sie als Nächstes eine Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter Matrix in geeignetem Medium auf Eis vor. Anschließend gewinnen Sie die markierten Zellen zur Suspension in der Matrix, wie zuvor gezeigt. Pipettieren Sie dann 1,5 × 10⁵ GL261-Zellen in einem Volumen von 150 µL sowie 5 × 10⁴ Mikrogliazellen in 50 µL in ein 1,5-mL-Mikrofugegefäß.Geben Sie zweimal 10 hoch 5 GL261-Zellen in einem Volumen von 200 Mikroliter in ein separates 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten bei 120 × g in einer Mikrozentrifuge. Resuspendieren Sie die Zellen anschließend in 200 Mikrolitern kalter Matrix auf Eis. Für diesen Schritt ist es entscheidend, ein Eisbad im Sicherheitswerkbank bereitzuhalten, die Röhrchen stets auf Eis zu lagern, die Pipettenspitzen im Kühlschrank aufzubewahren und sicherzustellen, dass alle Materialien gekühlt sind, um eine vorzeitige Polymerisation des fertigen Gels zu verhindern.Nach der Resuspension 50.000 Zellen in einem Volumen von 50 µL in die Mitte des oberen Kompartiments eines Kammerinserts mit einer Porengröße von acht µm aufpipettieren. Anschließend 30 Minuten bei 37 °C inkubieren, um die Polymerisation zu ermöglichen. Nach 30 Minuten 200 µL serumfreies Medium in die obere Kammer und 700 µL serumhaltiges Zellkulturmedium in das untere Reservoir geben.Nach einer Inkubation von 48 Stunden entfernen Sie die Zellen vorsichtig durch Aspiration aus dem oberen Teil der Kammer. Fixieren Sie die Kammern wie zuvor und ersetzen Sie das Fixierungsmittel durch 500 µL 1× PBS, bevor Sie die Zellen abbilden. Dieses repräsentative Bild zeigt eindringende mCherry-exprimierende GL261-Zellen in Abwesenheit von Mikroglia.Die Zellen wurden auf mit Matrix beschichteten Kammerobjekten ausgesät und für 48 Stunden inkubiert. Die Aufnahmen wurden mit einem 10X-Objektiv angefertigt, und die Maßstabsleiste entspricht 400 Mikrometern. Hier wurden die GL261-Zellen mit Mikroglia kombiniert.Die Anzahl der invasiven GL261-Zellen, die den Filter durchqueren, wurde quantifiziert. Wie hier zu sehen ist, verstärkt die Kokultivierung der murinen Glioblastomzelllinie GL261 mit Mikroglia deren Invasion im 2D-Assay bis zu zehnfach. Dieses Bild zeigt die Wirkung pharmakologischer Inhibitoren auf die von Mikroglia stimulierten GL261-Invasion im Vergleich zur DMSO-Kontrolle.Die gezeigten Daten stammen aus sechs unabhängigen Experimenten. Dieser Assay wurde erfolgreich auch mit humanen Zelllinien durchgeführt. U87-Zellen, die auf matrixbeschichteten Kammerobjektträgern kultiviert und mit CMFDA grün gefärbt wurden, sind nach einer 24-stündigen Inkubation dargestellt.Hier wurden U87-Zellen zusammen mit differenzierten THP1-Makrophagen ausgesät. Diese Abbildung zeigt die Quantifizierung des Assays, bei der ausschließlich invasive U87-Zellen gezählt wurden. Die humane Makrophagen-Zelllinie THP1 stimuliert die Invasion von U87-Glioblastomzellen.Die dargestellten Daten sind Mittelwerte aus 10 unabhängigen Experimenten. Diese Aufnahme aus einem 3D-Invasionsassay einer GL261- und Mikroglia-Kokultur ist eine Zusammenschau aus einer Z-Serie von Bildern und zeigt GL261-Zellen, die mit CMFDA grün gefärbt und allein in der Matrix eingebettet sind. Hier wurden die GL261-Zellen mit murinen Mikroglia, die mit CMPTX rot markiert waren, kokultiviert.Hier werden GL261-Zellen auf der Unterseite des Filters gezeigt, die als invasiv bestimmt wurden. Die Gesamtanzahl der eindringenden GL261-Zellen wurde ermittelt und auf die Anzahl der GL261-Zellen in Monokultur normalisiert. Die dargestellten Daten repräsentieren den Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten, die jeweils im Duplikat durchgeführt wurden.Nachdem die Technik einmal beherrscht ist, kann sie von Anfang bis Ende in etwa zwei Stunden durchgeführt werden. Die endgültigen Ergebnisse des Experiments liegen nach 48 Stunden vor. Während der Durchführung dieser Technik ist es sehr wichtig, dass alles gekühlt und auf vier Grad Celsius ist, einschließlich der Röhrchen und der Pipetten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Glioblastome in Makrophagen-Mikroglia-Kokultur-Invasionsassays etabliert.

coculture-assays-to-study-macrophage-microglia-stimulation

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

In diesem Video führen wir den mikroglialen Phagozytose-Assay für Neuroblastome mit induzierten pluripotenten Stammzellen durch. Der Assay hilft bei der Beurteilung der Beeinträchtigung der Mikrogliafunktion bei neurodegenerativen Erkrankungen.

Mikroglia-Phagozytose-Assay: Ein In-vitro-Assay zur Etablierung eines Mikroglia-Phagozytose-Modells für Neuroblastomzellen unter Verwendung von iPSC-Makrophagen

Dieses Video beschreibt einen Co-Kultur-Assay von Glioblastomzellen auf mikrostrukturierten Neuronen, die die Invasion der myelinisierten neuronalen Bahnen durch die Glioblastom-Stammzellen nachahmen, während sie auf Neuronen in den peritumoralen Räumen wandern. Dieser Assay kann helfen, die Auswirkungen von pharmakologischen Arzneimitteln zu analysieren, die die Wanderung von Glioblastomzellen auf Neuronen in einem Gliom hemmen.

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Bewertung der Interaktionen zwischen glutamatergen Neuronen und Gliomzellen in einer Co-Kultur

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Die organotypischen Hirnschnitt Co-Kultur mit Karzinomzellen ermöglicht die Visualisierung morphologische Veränderungen durch Fluoreszenz sowie Hellfeld-(Video)-Mikroskopie während des Prozesses der Karzinomzellinvasion von Hirngewebe. Dieses Modellsystem ermöglicht auch für die Zellaustausch und die Wiederauffüllung Ansätze und bietet eine Vielzahl von Manipulationen und Analysen.

Co-Kultur-System mit einer Scheibe Organotypische Gehirn-und 3D-Sphäroid von Karzinomzellen

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Ein Makrophagen-Tumor-Sphäroid-Co-Invasions-Assay

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Cokultur Assays zur Untersuchung Makrophagen und Mikroglia Stimulation von Glioblastom-Invasion

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