Name: In - vivo - Biosensor - Spuren Non-apoptotischen Caspase - Aktivität in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Lernen Sie die Verwendung des CaspaseTracker-Biosensors zur Detektion nicht-apoptotischer Caspase-Aktivität in lebenden Drosophila. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung gesunder Zellfunktionen.

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Wir danken Polan Santos und Darren Obbard für Drosophila Abbildungen in Fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena für die Verwendung des JHMRI Insektarium. Diese Arbeit wurde von der Life Science Research Foundation Fellowship (HLT), University Grants Committee der Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF) unterstützt wurde, und NIH gewährt NS096677, NS037402 und NS083373 (JMH). Ho Lam Tang ist ein Shurl und Kay Curci Foundation Fellow der Life Sciences Research Foundation.

1. Herstellung von CaspaseTracker Flies <ol><li> Zur Vorbereitung CaspaseTracker (DQVD) fliegt für Experimente, führen Sie diese Quer: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP; Ubi&gt; Stop&gt; GFP-nls), durch die Übertragung von 7-10 jungfräulichen Weibchen (oder männlich) die Caspase Biosensor Substrat mCD8-DIAP1-Gal4 durch den Ubiquitin - Promotor 35 zusammen mit der gleichen Anzahl von männlichen (bzw. weiblichen) angetrieben G-TRACE Fliegen, die das zweite Chromosom cyo Ausgleicher haben zu vermeiden Letalität der homozygoten Kombination von G- Fliegen Trage TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP und Ubi&gt; Stop&gt; GFP-nls) 34. Platz fliegt in einem frischen Lebensmittel Fläschchen mit frischer Hefe-Paste als Proteinquelle. </li><li> Inkubieren Dateien bei 18 ° C für 5 bis 7 Tage (maximal 2 Wochen) und entfernen Sie dann die Eltern aus dem Fläschchen fliegt mit neuen Nachkommen zu vermeiden, Überfüllung und neue Zucht Fläschchen einzurichten. </li><li> Weiter Inkubation bei 18 ° C bis Nachkommen eclose fliegt. Wählen Sie das nicht Cyo [non-curly Flügel] Nachkommen des korrekten Genotyp von CaspaseTracker, die 35 für CaspaseTracker und G-TRACE Elemente transgen sind. </li><li> Gleichzeitig erzeugen Kontrolle der Eltern nicht-transgenen W118 Fliegen und Caspase-unempfindlich (DQVA) fliegt parallel spezifischen CaspaseTracker RFP und GFP-Fluoreszenz zu überprüfen. </li><li> Führen Sie die PCR-Genotypisierung, um zu bestätigen Dateien mit CaspaseTracker unter Verwendung der Primer: 5&#39;-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3&#39;-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, ein 3897-bp-Produkt zu erzeugen. Für die Genotypisierung die G-Trace-Loci, verwenden Sie die folgenden Primer, die für GFP (474 ​​bp), 5&#39;-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3&#39;-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; für RFP (258 bp), 5&#39;-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3&#39;-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; und für Flpase (655 bp), 5 &#39;CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3&#39;-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA C. Für die Genotypisierung Gal4 im pUWR Vektor (554 bp), 5&#39;-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT CAGTCA CGC, 3&#39;-TGG AAT TGG GGT ACG TCT AGA. </li></ol> 2. Gewebepräparation, Färbung und Montage <ol><li> Für Fliegen Dissektionen verhindern seziert Gewebe zu Kunststoff-Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen kleben, beschichten Spitzen und Rohre mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in Wasser gelöst. </li><li> Dissect fliegt auf einem Silikonkissen mit einer Pinzette. <ol><li> Schäden an den Spitzen der Zange auf eine harte Oberfläche zu vermeiden, wenn das Gewebe Dissektion durchführen, führen Präparation auf einer Siliziumoberfläche. Für Silikon-Dissektion Platten machen, schmelzen das Silizium im Handel erhältlichen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers (Materialliste). Nach dem Silikon schmelzen, fügen Sie 3 bis 4 ml zu einem Durchmesser von 60 mm Gewebekulturschale. Silicon Geschirr kann wiederverwendet werden. </li><li> Anesthetize eine Fliege mit CO 2, und übertragen sie mit 1 ml kaltem PBS auf eine Silikonplatte. Führen Sie das CO 2 in ein Fläschchen , die Fliege mit einem Blasrohr enthält, und dann übertragen Sie die narkotisiert fly toa Pad , die eine CO 2 Versorgung. </li><li> Verwenden Sie eine Zange, die Fliege Kopf, und ein zweites Paar von Zange zu halten, den Brustkorb in die entgegengesetzte Richtung zu ziehen, die Fliege Kopf vom Körper zu trennen abdeckt, ohne dass die Verbindung zwischen dem Kopf und foregut zu beschädigen. </li><li> Verwenden Sie 2 Paar Zangen, die Flügel und Beine aus dem Thorax zu entfernen. </li><li> Verwenden Sie ein Paar Zangen des Thorax zu halten, und ein anderes Paar von Zange den Bauch ziehen Sie sie vom Thorax wieder zu trennen, ohne die Verbindung zwischen dem Vorderdarm und Mitteldarm zu beschädigen. </li><li> Präparieren inneren Organe einschließlich Gehirn, Darm, Malpighischen Gefäße und der Ovarien , wie zuvor unter Beweis gestellt. 39-41 </li><li> Entfernen Sie alle Stücke der Kutikula und die Fettkörper mit einer Pinzette, da diese Gewebe starke Autofluoreszenz produzieren. Geduld und Übung erforderlich, um eine vollständige Organsystem vorzubereiten, wie dargestellt. </li></ol></li><li> Übertragen Sie seziert Gewebe zu 1,5 ml Zentrifugenröhrchen und reparieren Gewebe with 0,5 ml 4% Paraformaldehyd in PBS (phosphatgepufferter Salzlösung) bei RT für 20 bis 30 min mit der Drehung in der Dunkelheit Bleich RFP und GFP in den Geweben zu vermeiden. Vermeiden Sie längere Fixierung, die nachfolgende Färbung Ergebnisse beeinträchtigen können. </li><li> Entfernen des Paraformaldehyds durch vorsichtiges Pipettieren und wäscht 3 mal mit 0,5 ml PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) bei RT. </li><li> Permeabilisieren die Gewebe mit 0,5 ml PBST bei 4 ° C über Nacht unter leichtem Schütteln. Kürzere Inkubationszeiten unvollständige Permeabilisierung und des Kompromisses Färbung Ergebnisse verursachen. <ol><li> Wenn es notwendig ist, die Hintergrundfärbung zu reduzieren, sollten Gewebe in 0,5 ml PBST mit 1% BSA anstelle von PBS inkubiert. </li></ol></li><li> Waschen Sie die Gewebe 3-mal mit 0,5 ml PBST. </li><li> Beflecken Kerne und filamentöse Aktin (F-Aktin), gelten 0,5 ml PBST mit 10 ug / ml Hoechst 33342 blau Kern Farbstoff und 0,3 uM Alexa Fluor 633 Phalloidin F-Actin-Färbung und Inkubation gleichzeitig mit Geweben für 1 h bei RT with sanfte Rotation im Dunkeln. Vermeiden Sie längere Färbung, da dies den Hintergrund zu erhöhen. <ol><li> Für die Immunfärbung, inkubieren fixiert und permeabilisiert Gewebe mit 0,1% Triton X-100 in 0,5 ml PBS über Nacht bei 4 ° C, Fleck mit 1: 100-Verdünnung von anti-ELAV Antikörper oder mit 1: 200-Verdünnung von Anti-Caspase-3 Nacht bei 4 ° C (300 ul). Folgen durch den entsprechenden Sekundärantikörpers, verdünnt 1: 100 und Inkubation für 1 bis 3 h bei RT. Siehe Materialliste für spezifische Antikörper Informationen. </li></ol></li><li> Waschen Sie die Tücher 3 mal für jeweils 5 min in 0,5 ml PBST mit sanfter Drehung. </li><li> Mit einer Pipette, entfernen Sie alle PBST und dann 200 ul hinzufügen Antibleichbefestigungsmittel (siehe Materialien) vollständig Gewebe für 1-3 h bei RT abdecken oder 4 ° über Nacht C. Optimale Gewebe, die die Montagemittel vollständig aufgenommen haben, wird auf dem Boden des Röhrchens sinken. </li><li> Vorreinigung der Glasobjektträger mit Wasser oder 70% Ethanol und das Gewebe mit Befestigungsmittel auf die Glas übertragenRutsche. </li><li> Vorsichtig ein Deckglas über dem Gewebe. Vaseline auf dem Glasobjektträger und Deckglas zu vermeiden, um das Gewebe durch Überkompression zu zerstören. Entfernen Sie die zusätzlichen Befestigungsmittel mit Seidenpapier. </li><li> Verschließen Sie die Deckglas durch Anwendung Nagellack alle entlang der Ränder des Deckglases zu vermeiden Leckage von Mitteln aus den Geweben Montage. </li></ol> 3. konfokale Mikroskopie <ol><li> Verwenden eines invertierten konfokalen Epi-Fluoreszenzmikroskop. Jedoch oben rechts Mikroskope verwendet werden kann. Um das Bild zu Geweben tiling Verwendung aufrechtzuerhalten stabile Raumtemperaturdrift des Fokus und der Verschiebung der xy-Ebene zu vermeiden, aufgrund der thermischen Expansion und Kontraktion der Komponenten. Umweltkontrollsysteme und Fokusdrift-Kompensationssysteme helfen, dieses Problem durch den Verlust von thermo-Gleichgewicht des Mikroskopsystems zu vermeiden. </li><li> Platzieren Sie den Schieber auf der Bühne des Mikroskops. Nehmen Sie ein paar Testbilder mit geringer Auflösung (125 x 125 Pixel) eind die entsprechende Anzahl der Kacheln bestimmen erforderlich, um die gesamte Region von Interesse (ROI) zu decken. </li><li> Stellen Sie das Mikroskop Scansystem zum Erfassen von Bildern mit Scan-Auflösung wie 500 x 500 Pixel. Wählen Sie das Ziel wie ein 20X NA 0,8 oder einem 63X NA 1.4 Plan-Apochromat Ziel für Gewebe durch Glasplättchen zu analysieren, so dass jedes der Bilder (Fliesen) überlappt um 20% auf allen Seiten. </li><li> Stellen Sie die Bildsequenz von längste bis Anregungswellenlängen kürzesten, als die langwellige Licht niedriger Photobleaching verursacht. Die Sequenz von längste Anregungswellenlänge kürzeste: (i) 633 nm für Phalloidin F-Actin und auf Antikörper gegen aktivierte Caspasen, (ii) 561 nm für RFP, (iii) 488 nm für GFP und (iv) 405 nm Hoechst Kernfärbung. </li><li> Während der Bilderzeugung minimieren Exposition von Zellen mit Fluoreszenzlaseranregung während des Prozesses Bildgebung Photobleaching zu vermeiden, indem die Laserintensität zu reduzieren qualitativ hochwertige Bilder von Gewebe zu erhalten. </li><li> Nachdem ichMagiern werden gesammelt, die Bilder mit Mikroskop-Software zusammenführen. </li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier zeigen wir die Konstruktion und Funktionsweise von CaspaseTracker, die Erkennung von weit verbreiteten basalen Caspase-Aktivität in gesunden Geweben erleichtern. Die kritischen Schritte zum Detektieren nicht-apoptotischen Caspase - Aktivität in vivo sind: 1) Fliegen mit dem Biosensor - Transgen zu erzeugen, 2) Caspase-spezifische Reporterfunktion mit geeigneten Kontrollen Verifizieren, 3) Praktizieren Techniken dissection alle inneren Organsysteme adulter Drosophila zu beobachten, und 4) Scheidung...

Caspasen sind Cystein-Proteasen, die durch Spaltung von vielen intrazellulären Proteinen nach Schlüssel Aspartatresten apoptotischen Zelltod vermitteln. Zum Beispiel aktivieren Initiator Caspasen Effektorcaspasen, dereprimieren DNA Nukleasen spalten Zytoskelett - Komponenten und die Lipidzusammensetzung von Zellmembranen verändern , um schnell Zellen abzubauen und ihre Anerkennung und engulfment stimulieren durch benachbarte Zellen , die der Zelle Leichen zu entsorgen. 1-4 Es wird geschätzt, dass Milliarden Zellen pro Tag in den menschlichen Körper sterben und Apoptose ist ein wichtiger Mechanismus der chemotherapieinduzierter Tumorzelltodes. 5 Eine andere Gruppe von Caspasen Zelltod durch verschiedene nicht-apoptotischen Prozesse führen können angeborene Immunität zu stimulieren. 6 Deshalb die meisten Untersuchungen auf Caspasen hat auf ihrer pro-Tod Funktionen konzentriert. Interessanterweise ergab erste Hinweise auf dem Gebiet, dass die gleichen Caspasen verantwortlich für die Förderung der Zelltod auch nicht den Tod f habenSalbungen. Pionierstudien haben gezeigt , daß Caspasen in diverse zelluläre Funktionen in gesunden Zellen beteiligt sind, einschließlich der Regulation der Zellproliferation und Migration während der Embryogenese. 7-9 Caspasen erforderlich sind für spermatid Individualisierung in Drosophila 10,11, für eine alternative necroptotic Zelltod blockiert bei Mäusen 12,13 und für microRNA Verarbeitung in C. elegans. 14,15 In vielleicht die langlebigste Zellen, Neuronen, Caspasen und andere apoptotische Maschinen sind an der Regulation neuronaler Aktivität verwickelt durch synaptischen Endungen Beschneidung, ein Prozess vermutlich wesentlich sein , andere Synapsen für Lernen und Gedächtnis zu stärken. 16- 18 Es ist möglich , dass Caspasen synaptic pruning durch eine Art Mini-Apoptose von neuronalen winzigen Vorsprünge ohne ganze Zelltod erleichtern. 19 jedoch Caspasen alternative Funktionen haben in keinem Zusammenhang mit der Apoptose-ähnlichen Ereignissen. 20,21 Dual - Rolles im Leben und Tod sind nicht einzigartig für Caspasen; BCL-2 - Familie Proteine und Cytochrom c haben Rollen in zelluläre Energetik in gesunden Zellen , sondern sind auch Teil des Kerns apoptotischen Weg, der von vielen Arten von Zellstress aktiviert. 22-25 Obwohl nicht bewiesen ist , scheint es logisch , dass die Evolution Tag verknüpft hat -Jobs zu Tode-Arbeitsplätze innerhalb der gleichen Moleküle rechtzeitige Beseitigung von untauglich oder unerwünschte Zellen zu gewährleisten. Gegenwärtig sind die molekularen Mechanismen von nicht-apoptotischen Caspase-Aktivität nicht verstanden, und das Ausmaß der nicht-apoptotischen Caspase-Aktivität während der embryonalen Entwicklung und in erwachsenen Geweben ist auch nicht bekannt. Eine große Herausforderung ist die Schwierigkeit, Tag-Jobs aus dem Tod Jobs von Caspasen zu unterscheiden. Im Gegensatz zur Apoptose und pyroptosis, als Caspase-Aktivität durch eine proteolytische Kaskade verstärkt wird, werden die Tag-Jobs von Caspasen erwartet bei wesentlich geringeren Mengen an enzymatischer Aktivität auftreten, wahrscheinlich unter der Nachweis von vielen verfügbaren technologien. Vor der vorliegenden Arbeit entwickelt andere eine Vielzahl von Caspase Biosensoren für verschiedene Zwecke. Die SCAT Biosensoren (zB ECFP-DEVD-Venus) schnell in Echtzeit Caspase - Aktivität in kultivierten Zellen und tierischen Geweben erkennen FRET verwenden. 26,27 Nach Caspase - Spaltung, die Kern gezielte GFP - Einheit von Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) erfährt subzellulärer Relokalisation innerhalb von Minuten , wenn seine Plasmamembran-Haltegurt durch Caspasen gespalten wird. 28 in ähnlicher Weise ApoAlert-pCaspase3-Sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relokalisiert aus dem Cytosol in den Zellkern auf Caspase - Spaltung. 29,30 Mehr Vor kurzem wurde das Chromophor in iCasper geschickt entwickelt , wenn sie von Caspasen gespalten zu fluoreszieren, ermöglicht Detektion von Biosensor - Aktivität in Echtzeit in Neuronen von Drosophila - Embryonen, sondern in erster Linie in Verbindung mit Entwicklungs Zelltod. 31 Caspase-abhängigen Tod von olfaktorischen Neuronen während alterte demonstbewertet durch Immundetektion der Caspase-gespaltenen Form von CPV Biosensoren (beispielsweise mCD8-PARP-Venus). 32,33 Wichtig ist , dass die aktivierte Form von Caspase-3 in Abwesenheit von Zelltod durch sensitive immunostain in Stacheln detektierter kultivierten Neuronen und im Soma die Caspase-abhängigen Fluoreszenz des Kern CellEvent Reporterfarbstoff verwenden, aber Schwierigkeiten aufgrund Phototoxizität angetroffen wurden, obwohl Zelltod erst nach spine Eliminierung verzögert. 19 Somit werden neue Caspase Biosensoren erforderlich nachzuweisen und verfolgen Zellen mit basalen Caspase - Aktivität in vivo. Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, haben wir einen einen neuen Dual Farbe Caspase Biosensor bezeichnet CaspaseTracker. Diese Strategie kombiniert eine modifizierte Version der Drosophila Caspase-sensitive Apoliner Biosensors 28 mit dem Drosophila G-TRACE FRT - Rekombinase - System 34 permanent zu markieren und die Zellen in vivo zu verfolgen. &lt;sup&gt; 35 Die Gal4-aktivierte G-TRACE - System ermöglicht ein sehr niedriges Niveau von Caspasen CaspaseTracker zu aktivieren, was zu RFP Expression im Zytoplasma und permanent kern gezielte GFP - Expression in einer beliebigen Zelle , die je Caspase - Aktivität erfahren hat. 35 Dieses System kann etikettieren Zellen im Laufe des Lebens in ganzen Tieren unter Verwendung von Drosophila melanogaster, ein lenkbar und am weitesten verbreiteten Modellsystem für die Untersuchung von Caspasen und Zelltod. 36-38

<table><tbody><tr><td colspan="4">Verbrauchsmaterialien und Reagenzien</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Products</td><td>H-1000</td><td>Eindeckmedium</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Ted Pella</td><td>#505 (110mm, #5)</td><td>Dumont Pinzette Biologie, Edelstahl</td></tr><tr><td>Hängende Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td>Objektträger aus Glas</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Molekulare Sonden</td><td>H1399</td><td>DNA-Färbung</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 Phalloidin</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A22284</td><td>Aktin-Färbung</td></tr><tr><td>Rat-Elav-7E8A10 Anti-Elav-Antikörper</td><td>Entwicklungsstudien Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>Antikörper-Register-ID:&nbsp; AB_528218&nbsp;</td><td>Färbung für Drosophla pan-neuronales ELAV</td></tr><tr><td>Gespaltener Caspase-3 (Asp175) Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#9661</td><td>Färbung für aktives Fragment von Caspase-3</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifading-Reagenz</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td>zur Konservierung von Fluorophoren&nbsp;</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Eindeckmittel</td><td>Life Technologies</td><td>P36961</td><td>zur Konservierung von Fluorophoren&nbsp;</td></tr><tr><td>SylGard 182 Silikon Elastomer Kit</td><td>Dow Corning&nbsp;</td><td>Produktcode: 0001023934</td><td>für Präparierplatten</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>LSM780 Konfokalmikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Carl Zeiss Stereomikroskop Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Drosophila Dissektion</td></tr><tr><td>AmScope Fiber Optic Dual Schwanenhals Mikroskop Illuminator, 150&nbsp; W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316</td><td>Lichtquelle</td></tr></tbody></table>

in - vivo - biosensor - spuren non-apoptotischen caspase - aktivität in drosophila

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Caspasen sind über ihre proteolytische Aktivität die Schlüsselmediatoren des apoptotischen Zelltods. Wenn Caspasen in Zellen auf ein Niveau aktiviert werden, das mit den verfügbaren Technologien nachweisbar ist, wird im Allgemeinen davon ausgegangen, dass die Apoptose kurz danach eintritt. Caspasen können viele funktionelle und strukturelle Bestandteile spalten, um innerhalb weniger Minuten eine schnelle und vollständige Zellzerstörung zu bewirken. Es gibt jedoch immer mehr Hinweise darauf, dass dieselben Caspasen in normalen gesunden Zellen andere Funktionen haben, vermutlich auf niedrigeren enzymatischen Niveaus. Studien zur nicht-apoptotischen Caspase-Aktivität wurden durch Schwierigkeiten beim Nachweis geringer Caspase-Aktivität und bei der Verfolgung des endgültigen Zellschicksals in vivo behindert. Hier veranschaulichen wir die Verwendung eines hochempfindlichen Caspase-Reporters, CaspaseTracker, der Zellen, die Caspase-Aktivität bei ganzen Tieren gezeigt haben, dauerhaft markiert. Dieser zweifarbige In-vivo-CaspaseTracker-Biosensor für Drosophila melanogaster exprimiert vorübergehend rotes fluoreszierendes Protein (RFP), um die kürzlich aufgetretene oder anhaltende Caspase-Aktivität anzuzeigen, und exprimiert dauerhaft grün fluoreszierendes Protein (GFP) in Zellen, die in der Vergangenheit Caspase-Aktivität erlebt haben, aber nicht abgestorben sind. Wichtig ist, dass dieser Caspase-abhängige in vivo Biosensor das Vorhandensein von nicht-apoptotischer Caspase-Aktivität im Gewebe der Organsysteme in der gesamten adulten Fliege leicht aufdeckt. Dies wird anhand von Ganzbettdissektionen einzelner Fliegen demonstriert, um die Biosensoraktivität in gesunden Zellen im gesamten Gehirn, im Darm, in den malpighischen Tubuli, in der Kardiologie, in den Eierstockgängen und in anderen Geweben zu detektieren. CaspaseTracker erkennt nicht-apoptotische Caspase-Aktivität in langlebigen Zellen, da die Biosensoraktivität in adulten Neuronen und in anderen Geweben mindestens 10 Tage nach der Caspase-Aktivierung nachgewiesen wird. Dieser Biosensor dient als wichtiges Werkzeug, um die Rollen und molekularen Mechanismen der nicht-apoptotischen Caspase-Aktivität bei lebenden Tieren aufzudecken.

Es gibt zwei wichtige Komponenten , die CaspaseTracker erlauben, Caspase - Aktivität in normalen , gesunden Zellen (Abbildung 1a) zu erkennen. Die erste davon ist ein 146 Aminosäure-Caspase-spaltbare Polypeptid nach der Caspase modellierten Biosensor Apoliner (Abbildung 1b). 28 Das Polypeptid aus DIAP1 (Drosophila Inhibitor der Apoptose) abgeleitet ist , eine einzelne natürlich vorkommenden Caspase - Stelle enthält , die typischerweis...

Um gesunde Zellen in ganzen Tieren erkennen , die geringe Mengen an Caspase - Aktivität enthalten, die hochempfindliche Biosensor bezeichnet CaspaseTracker wurde für Drosophila erzeugt. Caspase-abhängigen Biosensor-Aktivität wird in langlebigen gesunden Zellen in den inneren Organen der erwachsenen Tiere aufgezogen unter optimierten Bedingungen in Abwesenheit von Tod Stimuli detektiert.

In - vivo - Biosensor - Spuren Non-apoptotischen Caspase - Aktivität in Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, nicht-apoptotische Caspasen-Aktivität in lebenden Tieren mithilfe von Drosophila Melanogaster als Modellorganismus nachzuweisen und zu verfolgen. Caspasen sind Proteasen, die zahlreiche zelluläre Bestandteile spalten und so den apoptotischen Zelltod auslösen. Daher wird das Vorhandensein aktiver Caspasen in Zellen häufig als Hinweis auf einen bevorstehenden Zelltod angesehen.Jedoch deuten wachsende Hinweise darauf hin, dass dieselben Kaspasen, die Zelltod verursachen, auch normale Funktionen in gesunden Zellen haben. Zu diesen Hauptaufgaben der Kaspasen gehören die Regulation neuronaler Aktivität, mitochondriale Funktionen und sogar die Unterdrückung alternativer Zelltodwege. Bei der Untersuchung der Hauptaufgaben von Kaspasen gibt es zwei große Schwierigkeiten.Zunächst liegen normale basale Spiegel der Caspasenaktivität typischerweise unterhalb der Nachweisgrenze verfügbarer Technologien. Und zweitens ist es selbst dann, wenn eine basale Caspasenaktivität nachweisbar ist, schwierig, diese von der Caspasenaktivität zu unterscheiden, die in naher Zukunft zum Zelltod führen wird. Um dieses Problem zu lösen, entwickelten wir einen Caspase-Tracker: einen empfindlicheren Caspase-Biosensor, der Zellen dauerhaft markieren kann, die eine Caspasenaktivierung überlebt haben.Dieser Biosensor ermöglicht es uns, Zellen mit nicht-apoptotischer Caspasenaktivität zu detektieren und zu verfolgen, sowie deren Funktionen in lebenden Tieren zu untersuchen. Das Drosophila-In-vivo-Caspase-Tracker-Biosensorsystem besteht aus zwei Komponenten: dem caspasenaktivierbaren Hefe-Transkriptor Gal4 und dem Gal4-aktivierten fluoreszierenden Reporter, der als G-Trace bekannt ist.Fliegen mit Caspase-Biosensor werden mit G-Trace-Fliegen gekreuzt, um CaspaseTracker-Fliegen zu erzeugen, die Caspase-Aktivität als rote und grüne Fluoreszenz anzeigen. Die Caspase-Aktivität wird in den Nachkommen erfasst, wenn der Biosensor durch aktive Caspasen an der Sequenz DQVD gespalten wird, wodurch Gal4 von der Plasmamembran freigesetzt wird. Das freigesetzte Gal4 wandert in den Zellkern und induziert die Expression des roten fluoreszierenden Proteins, RFP, solange bis die Caspasen inaktiv werden.Jedoch induziert Gal4 auch die Expression der FLP-Rekombinase, was zu einer kontinuierlichen Expression von kernzielgerichtetem GFP während der gesamten Lebensdauer der Zelle führt. Ein Kontrollbiosensor weist eine Mutation, DQVA, in der Caspase-Spaltstelle auf. Zunächst kreuzen Sie transgene Fliegen, die den caspaseempfindlichen Gal4-Biosensor tragen, mit Fliegen, die den G-Trace-Fluoreszenzreporter tragen.Paaren Sie sieben bis 10 jungfräuliche Biosensor-Weibchen mit sieben bis 10 frisch geschlüpften männlichen G-Trace-Fliegen in einem Gefäß mit frischem Nährboden. Eine wichtige negative Kontrolle stellt die Caspase-insensible Version dieses Biosensors dar, die eine Punktmutation im Aspartatrest aufweist, der für den Caspase-Schnitt erforderlich ist. Verwenden Sie für diese Kontrollfliegen das gleiche Paarungsverfahren.Nach dem Aufstellen der Kreuzungen die Vials bei 18 Grad Celsius aufbewahren. Wenn sich die Larven entwickeln und bevor neue Nachkommenfliegen schlüpfen, die Elternfliegen in neue Vials überführen, um die Produktion neuer Nachkommen fortzusetzen. Wenn die Nachkommenfliegen schlüpfen, diejenigen mit geraden, nicht gewellten Flügeln sammeln.Dieses Phänotyp zeigt an, dass diese Fliegen Transgene sowohl für den Caspase-Biosensor als auch für den fluoreszierenden G-Trace-Reporter tragen. Danach Fliegen gemäß etablierten Protokollen sezieren, um intakte innere Weichgewebe sowohl von Caspase-Tracker- als auch von Kontrollfliegen zu isolieren. Um zu beginnen, bereiten Sie Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen vor, die nicht an den sezierenen Geweben haften bleiben.Um dies durchzuführen, beschichten Sie die Spitzen und Röhrchen mit einem Prozent Rinderserumalbumin, das in Wasser gelöst ist. Um die dissezierten Gewebe zu fixieren, füllen Sie die beschichteten durchsichtigen Röhrchen mit 0,5 mL frischem vierprozentigem Paraformaldehyd in PBS und überführen Sie die frisch präparierten Gewebe in diese Röhrchen. Anschließend stellen Sie die Gewebe bei Raumtemperatur im Dunkeln, um eine Photobleiche zu vermeiden, und inkubieren sie 20 bis 30 Minuten unter sanfter Rotation, um die Gewebe mit Fixansatz zu benetzen und gleichzeitig Schäden an den Geweben zu vermeiden.Längere Fixierungen können zu einer suboptimalen Färbung von Geweben führen. Um Paraformaldehyd zu entfernen und die Membranpermeabilisierung der fixierten Gewebe einzuleiten, entfernen Sie vorsichtig die Paraformaldehydlösung mit einer beschichteten Pipettenspitze und waschen Sie die Gewebe dreimal mit 0,5 mL PBST. Um die Gewebepermeabilisierung abzuschließen und unspezifische Bindungen in nachfolgenden Färbeprozeduren zu blockieren, inkubieren Sie die Gewebe über Nacht bei 4 °C im Dunkeln unter sanfter Rotation in 0,5 mL PBST, das 1 % BSA enthält.Am nächsten Tag entfernen Sie die PBST-BSA-Lösung, indem Sie die permeabilisierten Gewebe dreimal mit je 0,5 mL PBST waschen. Um verschiedene Gewebestrukturen sichtbar zu machen, führen Sie eine Doppelfärbung von nukleärer DNA und zytoplasmatischem F-Aktin durch, indem Sie die vorbereiteten Gewebe für eine Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren in 0,5 mL PBST inkubieren, das den blauen Kernfarbstoff Hoechst 33342 und den F-Aktin-Farbstoff Alexa Fluor 633-Phalloidin enthält. Entfernen Sie überschüssigen Farbstoff, indem Sie die Gewebe dreimal mit je 0,3 mL PBST waschen.Jedes Waschen fünf Minuten bei Raumtemperatur unter sanfter Rotation inkubieren. Die gesamte Lösung vorsichtig mit einer feinen Pipettenspitze aus den Geweben im Gefäß entfernen. Um das fluoreszente Signal während der Bildgebung zu erhalten, 200 Mikroliter Antifade-Montagemedium hinzufügen, das die Gewebe vollständig bedeckt.Inkubieren Sie die Gewebe ein bis drei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Optimalerweise sinken die Gewebe, die das Einbettungsmedium vollständig aufgenommen haben, auf den Boden des Röhrchens. Reinigen Sie den Objektträger vor dem Aufbringen der Gewebe mit Wasser oder 70 %igem Ethanol.Tragen Sie Vaseline auf den Objektträger und auf die Deckglasplatte auf, um ein Zerstören der Gewebe durch Überkompression zu vermeiden. Überführen Sie anschließend die Gewebe mit Montagemedium auf den Objektträger. Entfernen Sie überschüssiges Montagemedium mit Papiertuch.Schließlich versiegeln Sie den Deckel, indem Sie Nagellack entlang der gesamten Kanten auftragen. Beginnen Sie damit, indem Sie das Objektträger auf dem Objekttisch eines invertierten Mikroskops platzieren. Und nehmen Sie Zellbilder mit einem 20x Plan-Apochromat-Objektiv mit einer Apertur von 0,8 auf.Machen Sie einige Testaufnahmen mit niedriger Auflösung, um einen Bildkachelungsplan zu überprüfen, der den interessierenden Bereich abdeckt, in diesem Fall das komplette innere Organsystem der Fliege. Richten Sie die Bildsequenz so ein, dass sie mit der längsten Anregungswellenlänge beginnt und mit der kürzesten Anregungswellenlänge endet. Dies minimiert die Photobleiche, die mit kürzeren Wellenlängen zunimmt.Nehmen Sie anschließend Bilder mit einer geeignet hohen Auflösung auf. Jedes Bild sollte eine 10%ige Überlappung mit dem nächsten aufweisen, um eine erfolgreiche Kachelung zu gewährleisten. Sammeln Sie zwei bis acht Bildaufnahmen pro Kachel, um das Hintergrundrauschen zu reduzieren.Um den Schatten zwischen den Bildkacheln aus dem Differenzinterferenzkontrast (DIC) zu eliminieren, nehmen Sie ein Referenz-DIC-Bild aus einer leeren Region auf. Führen Sie anschließend eine Schattenkorrektur des Kachelbildes mit dem Referenz-DIC-Bild durch. Dies ist eine präparierte, neu geschlüpfte Caspase-Tracker-Fliege mit Mundwerkzeugen, Vorderdarm, Kropf, Mitteldarm, Hinterdarm, Anus, Eileiter und Eierstöcken.Mittels konfokaler Mikroskopie wird die Caspasenaktivität als RFP-Fluoreszenz sichtbar gemacht, die auf eine aktuelle Caspasenaktivität hinweist, sowie durch GFP-Fluoreszenz, die auf eine vergangene Caspasenaktivität hinweist. Vergrößerte Aufnahmen zeigen RFP- und GFP-Biosensor-Aktivität im Opticulus, der Kardia, dem Mitteldarm, dem Hinterdarm und dem Eileiter. Bestimmte Zellen entlang der Malpighianschen Tubuli zeigen deutlich sowohl RFP- als auch GFP-Signal, was auf anhaltende Caspasenaktivität hindeutet.Im Gegensatz dazu wurde in Eiern keine RFP- oder GFP-Biosensoraktivität exprimiert, obwohl der Biosensor in Muskelzellen zwischen Eiern exprimiert wurde, basierend auf einer Doppelfärbung mit F-Aktin-Färbung. Die Zellen der Eier sind jedoch in der Lage, Caspasen zu aktivieren, wenn die Fliegen mit einem Zelltod-Reiz wie Hunger oder Kälteschock behandelt werden, was zur Zerstörung des Zellkerns und massiver Caspasenaktivierung führt, wie immunhistochemische Färbungen zeigen. Der Caspase-Tracker erscheint vermutlich früh und wird anschließend während des Zelltods zerstört.Im Optiklappen des gesunden Caspase-Tracker-Fliegenhirns wird Biosensoraktivität in gesunden Zellen nachgewiesen, die aufgrund einer Kostenfärbung mit einem pan-neuronalen Marker, dem Anti-ELAVI-Antikörper, als Neuronen erscheinen. Dies deutet auf eine Rolle der nicht-apoptotischen Caspase-Aktivität in Neuronen hin. Andere Strategien können verwendet werden, um das Langzeitüberleben von Zellen mit Caspase-Aktivität nachzuweisen, beispielsweise durch Abschalten der Biosensor-Expression mithilfe genetischer Werkzeuge.Beispielsweise hemmt GalADTS Gal4. Der Caspase-Tracker meldet spezifisch die Caspase-Aktivität, während der kontrollierte, nicht spaltbare Biosensor DQVA nicht aktiviert wird. Das einzige Signal in den Kontrollen resultiert aus Autofluoreszenz des verbliebenen Cuticulamaterials an Mundwerkzeugen und Anus sowie von aufgenommener Nahrung, Hefe, im Kropf und im Cardia.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Caspase-Tracker-Biosensor verwendet, um die nicht-apoptotische Caspase-Aktivität in Fruchtfliegen zu verfolgen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, negative Kontrollen einzuschließen, um Biosensor-Signale der Caspasen von Autofluoreszenz zu unterscheiden. Beispielsweise erzeugen das Cuticula und die Fettkörper eine starke Autofluoreszenz in Fliegen – unabhängig davon, ob ein Biosensor vorhanden ist oder nicht.Die aktuelle Version des Caspase-Tracker-Biosensors wurde entwickelt, um die aktive Caspase DRICE nachzuweisen. Weitere Anwendungen könnten Biosensoren umfassen, die spezifisch für verschiedene Caspasen sind, indem die von DRICE erkannte Spaltstelle durch die von anderen Caspasen erkannte Spaltstelle ersetzt wird.

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Hier beschreiben wir eine effektive Methode zur Untersuchung der Dynamik apoptotischen...

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

Die embryonalen Epidermis der sehr späten Stadium Drosophila-Embryonen stellt eine in vivo-System für die schnelle Stichwunde Response-Analyse und kann mit genetischen Manipulationen oder chemische Mikroinjektion Behandlungen kombiniert, um Studien in der Wundheilung für die Übersetzung in Säugetier-Modelle voranzubringen.

Mikroinjektion Wound Assay und<em&gt; In-vivo-</em&gt; Lokalisierung von Epidermal Wundreaktion Reporter in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos.

Bestimmte genetische Störungen oder die Exposition gegenüber Toxinen können normale Entwicklungsprozesse stören, die zum Tod bestimmter Zelltypen führen. Die Analyse von aktivierter Caspase 3 durch Whole-Mount-Immunfluoreszenz in Zebrafischembryonen zeigt eine stadien- und gewebespezifische Lokalisation von Zellen, die spezifisch Apoptose durchlaufen.

Die Analyse der Apoptose in Zebrafischembryonen von Whole-mount Immunfluoreszenz an aktivierte Caspase 3 Detect

Der Begriff Anastase bezieht sich auf das Phänomen, bei dem sterbende Zellen einen Zellselbstmordprozess in einem späten Stadium rückgängig machen, sich selbst reparieren und schließlich überleben. Hier demonstrieren wir Protokolle zum Nachweis und zur Verfolgung von Zellen, die einer Anastasierung unterzogen werden.

Strategien für die Spurhaltung Anastasis, einer Zelle Überleben Phänomen, das Apoptose Kehrt

Anastasis ist technisch anspruchsvoll, um in Vivo zu erkennen, da die Zellen, die der Zelle Todesprozess umgekehrt haben morphologisch nicht zu unterscheiden von normalen gesunden Zellen sein können. Hier beschreiben wir Protokolle für die Erkennung und Verfolgung von Zellen, die Anastasis mit lebenden Tieren zu unterziehen, durch den Einsatz unserer neu entwickelten in Vivo -CaspaseTracker-Biosensor-System.

Erkennung von Anastasis In Vivo durch CaspaseTracker Biosensor

Wir beschreiben hier einen Phagozytose-Assay unter Verwendung der dispergierten embryonalen Zellen von Drosophila . Es ermöglicht uns, in vivo Phagozytose Ebenen einfach und präzise zu quantifizieren und neue Moleküle zu identifizieren, die für die Phagozytose von apoptotischen Zellen erforderlich sind.

Phagozytose - Assay für apoptotische Zellen in Drosophila Embryonen

Hier zeigen wir wie Einzelmolekül Foto aktiviert Lokalisierung Mikroskopie auf dem motorischen Nerv-Terminal von einem live Drosophila Melanogaster erfolgen kann Dritte instar Larve.

In Vivo Einzelmolekül-Tracking bei Drosophila präsynaptischen motorischen Nerv Terminal

Dieses Protokoll beschreibt Caspase bimolekulare Fluoreszenz-Ergänzung (BiFC); eine Imaging-basierte Methode, die verwendet werden, um induzierte Nähe der Initiator Caspasen, zu visualisieren, das ist der erste Schritt in ihre Aktivierung.

Die Wege zur Aktivierung der Caspase bimolekulare Fluoreszenz Ergänzung mit Beleuchtung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die live-Imaging Wunde Reparatur und der damit verbundenen entzündlichen Reaktion bei hoher räumlich-zeitliche Auflösung in Vivo. Diese Methode nutzt das Puppenstadium Drosophila Entwicklung ermöglichen langfristige imaging und Verfolgung von bestimmten Zellpopulationen im Laufe der Zeit und ist kompatibel mit effizienten RNAi vermittelte gen-Inaktivierung.

Langfristig In Vivo Verfolgung von entzündlichen Zelldynamik in Drosophila Puppen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Expression und Reinigung der rekombinanten Drosophila caspases Dronc und Drice und deren Verwendung in In-vitro-Spaltungsassays .

In vitro Spaltungstests mit gereinigten rekombinanten Drosophila-Caspasen für das Substrat-Screening

Lernen Sie die Verwendung des CaspaseTracker-Biosensors zur Detektion nicht-apoptotischer Caspase-Aktivität in lebenden Drosophila. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung gesunder Zellfunktionen.

In - vivo - Biosensor - Spuren Non-apoptotischen Caspase - Aktivität in Drosophila

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