Name: Durch den Spiegel: Zeitraffer-Mikroskopie und Longitudinal-Tracking von Einzelzellen Anti-Krebs-Therapeutika zu studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Erfahren Sie Zeitraffer-Mikroskopie zur Untersuchung von Einzelzell-Antworten auf Anti-Krebs-Therapeutika in HT1080- und HeLa-Zellen. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Beobachtung heterogener therapeutischer Reaktionen und Zellschicksale.

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Wir danken Joshua Marcus für die technische Unterstützung und Jolien Tyler, Ph.D., Direktorin der Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, für die technische Beratung. Diese Arbeit wurde mit Mitteln der University of Colorado Boulder und der University of Colorado Boulder Graduate School an J.D.O. R.T.B. wird teilweise durch ein Predoctoral Training Grant des NIH (T32 GM008759) unterstützt. Wir danken Karyopharm Therapeutics, Inc. für Selinexor und Merck Serono für den Kinesin-5-Hemmer. Die FUCCI-Plasmide stammen von Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) über MTA. mCherry-BP1-2 stammt von Addgene. HeLa, das H2b-mCherry und β-Tubulin-EGFP exprimiert, stammt von Daniel Gerlich (IMBA, Österreichische Akademie der Wissenschaften, Österreich).

Das folgende Protokoll verwendet Parameter , die von den Experimenten definiert in den 4 und 6 zu Akquisitionseinstellungen und Versuchsbedingungen. Viele dieser Parameter können modifiziert werden , um andere Experimente zu passen (dh Belichtungszeiten, Binning, fluoreszierende Kanäle usw.). Alle Verfahren müssen den institutionellen Richtlinien und Vorschriften einhalten und von der institutionellen Biosicherheitskommission genehmigt werden. Mikroskop-Hersteller-Websites enthalten ausgezeichnete Informationen für Live Cell Imaging. 1. Mikroskope und Imaging Software <ol><li> Führen Sie Live-Cell-Imaging auf einer Vielzahl von invertierten Mikroskopen. Die am häufigsten verwendeten Mikroskope sind Epifluoreszenz und Spinnscheiben-konfokale Weitfeld-. Hier verwenden eine automatisierte und motorisierte Weitfeld- Epifluoreszenz-Mikroskop mit 200-Watt-Metall-Halogen-Lichtquelle. </li><li> Besorgen Sie sich eine Bühne-Top-oder Mikroskop Klimakammer. Hier verwenden, um eine Stufe-top Klimakammer. </li><li> Verwenden Sie kommerzielle Software zu betreiben Mikroskope mit Dienstprogramme Zeitraffer-Mikroskopie auszuführen. </li><li> Verwenden Sie handelsübliche Software oder ImageJ für die Bildanalyse. Viele andere Analysetools sind im Handel erhältlich, und es gibt maßgeschneiderte Programme von denen viele 8,18 veröffentlicht wurden. </li></ol> 2. Visualisierung zellulärer Prozesse und phänotypische Antworten <ol><li> Visualisieren Zellen mit Hellfeldmikroskopie. Differentialinterferenzkontrast und Phasenkontrast allein kann sehr informativ sein Antworten zu studieren, um Anti-Krebs-Medikament Antworten. Diese Prozesse können Mitose, Zellbeweglichkeit und Apoptose umfassen. </li><li> Visualisieren Zellstrukturen, Organellen und Prozesse mit Fluoreszenzbiosensoren. Fluoreszenzsonden sind informativ in bestimmten subzellulären Prozesse zu verfolgen. Diese können die Dynamik der Mikrotubuli sind, mitochondriale und endoplasmatischen Reticulum Dynamik, Proteinakkumulation und Lokalisierung, undMolekular Signalisierung (z. B. Phosphorylierung, Calcium). </li></ol> 3. Herstellung der Proben <ol><li> Wachsen Zellen in Zellkulturschalen in einer zertifizierten Standard befeuchteten Zellkulturbrutschrank (beispielsweise 37 ° C, 5% CO 2, 80% relative Luftfeuchtigkeit). <ol><li> Wachsen HT1080-Zellen in MEM mit EBSS. Ergänzen die Medien mit 10% v / v FBS, 1% v / v Pen / Strep, 1% v / v Natriumpyruvat und 1% v / v nicht-essentiellen Aminosäuren. </li></ol></li><li> Zwei Tage vor der Bildgebung, Platte 50.000 HT1080 Fucci Zellen in 3 Vertiefungen einer 12-Well # 1.5 Glasbodenschale in einem zertifizierten sterilen Laminar-Flow-Haube. Stellen Sie die Anzahl von Zellen ausplattiert ~ 60% Konfluenz für den Beginn des Experimentes zu erreichen. Abhängig von der Zelllinie und der Natur des Experiments kann die Zelldichte geringer sein. Anmerkung: Die Zelldichte haben großen Einfluss auf das Wachstum der Zelllinie und auf den experimentellen Ergebnissen. Zählen von Zellen zu minimieren Experiment zu Experiment variability aufgrund der Dichte. <ol><li> In Abhängigkeit von der Umgebungskammer und die notwendigen Bedingungen für das Experiment, Platte Zellen in einzelnen Well-Platten (in der Regel 35- oder 60-mm), 4 gut 35-mm-Schalen, 6-, 12- oder 24-Well-Zellkulturplatten oder Deckglas-Folien in verschiedenen Formaten. Verwenden Sie Glasbodenplatten mit # 1.5 Glas, da die meisten Objektive für diese Dicke des Glases optimiert sind, und Bildgebung durch Zellkultur-Plastik ist sehr schlecht. Hinweis: Einige Zelllinien wachsen nicht und überleben auf Glas. In diesen Fällen kann das Glas , um Anhaftung zu verbessern Zelle beschichtet werden (z. B. Poly-Lysin oder Kollagen). Einige Unternehmen stellen optische Zellkultur-Plastik, muss es empirisch ermittelt werden, ob dies ein gangbarer Weg ist. </li></ol></li></ol> 4. Umweltkammer Set-up <ol><li> Vor jedem Experimentieren, Aufbau der Klimakammer , so dass es bei ~ 80% Luftfeuchtigkeit arbeitet und so die Temperatur an der Probenposition ist 37 o C. Die meisten kultivierten Zellen wachsen in 5% CO 2 / Balance Luftatmosphäre aufgrund Natriumbicarbonat - Puffer in dem Medium. Je nach Set-up : entweder die Umgebungsregler auf 5% CO 2 , und es wird zu 100% CO 2 mit Luft mischen, oder verwenden Sie vorgemischten, zertifiziert 5% CO 2 / Balance - Luft - Gas. Folgen Sie den Herstelleranweisungen für die Gasdurchflussraten. Hinweis: Einige Zelllinien wachsen in CO 2 -unabhängigen Medium in diesem Fall können sie ohne CO 2 aufrechterhalten werden. Speziell Bildmedien ist auch, dass die Zugabe von autofluoreszenten Verbindungen begrenzt. Das Wachstum in Thesen Medien für den gewünschten Zelltyp empirisch vorher bestimmt werden. </li><li> Vor der Bildgebung gewährleistet ist, der Wasserbehälter gefüllt (nach Anweisungen des Herstellers) mit sterilem destilliertem Wasser. Schalten Sie die Klimakammer auf die gewünschte Temperatureinstellung und legen Sie sie in den Mikroskoptisch Einsatz. So speichern Sie Gas, nicht anfangen, den Fluss an dieser Stelle. Hinweis: Wenn es einen freien Raum zwischen Bühne-Top-Kammer und Bühneneinsatz und / oder jede Spannung auf Verbindungskabel an die Kammer kann es Bewegungsartefakte in das Experiment vorstellen. <ol><li> Legen Sie Stücke von Paraffinfilm über die Kanten der Bühne Einstellöffnung vor die Kammer hinein zu koppeln, um die Kammer auf die Bühne Einsetzen und stellen Sie sicher, dass keine Anschlüsse an der Kammer ziehen. </li></ol></li><li> Ermöglichen die Kammer auf 37 o C äquilibrieren Achten Sie auf eine stabile Temperatur Temperaturschwankungen während der Bildgebung zu verhindern, die die Zellphysiologie beeinflussen können und Drift einzuführen. Erreichen Temperaturausgleich erfordert typischerweise 30 min bis 1 h, je nach der Umgebung. <ol><li> Legen Sie eine &quot;Dummy&quot; Schüssel mit Wasser in den Brunnen in die Kammer unter Erwärmung. Eine Abbildungsschale mit Wasser ahmt die Probe gefüllt, die Kammer hilft sicherzustellen, dass ausreichend erwärmt und stabilisiert. Füllen der Kammer mit vorgewärmten sterilem Wasserreduziert die zur Temperaturstabilisierung erforderliche Zeit minimiert und bei der Zugabe der experimentellen Probe, die die Temperaturabnahme. </li></ol></li></ol> 5. Mikroskop Set-up <ol><li> Schalten Sie das Mikroskop, zugehörigen Computer, und alle erforderlichen Peripheriegeräte. <ol><li> In Abhängigkeit von der Lichtquelle, warten , um ihn einzuschalten , bis sie benötigt (z. B. LED). </li></ol></li><li> Mit dem Objektivrevolver in einer niedrigen Position, wählen Sie die 20X 0,7 NA-Objektiv verwendet werden. </li><li> Positionieren Sie die Probe auf das Ziel - das macht es einfacher, die Zellen zu finden, wenn die Probe in der Kammer ist. </li><li> Definieren Abbildungsparameter in dieser Zeit, wenn sie von früheren Experimenten bekannt sind. </li></ol> 6. Der Transport von Zellen an ein Mikroskop und in die Kammer <ol><li> Transportieren Sie die Zellen aus dem Inkubator in die Klimakammer abgebildet werden. Stellen Sie sicher , dass dies schnell getan wird , um die Auswirkungen einer vergleichsweise niedrigen CO 2 zu begrenzen , </sub&gt; Atmosphäre und verringerte Temperatur auf die Zellen. Folgen Sie alle institutionellen Biosicherheit Richtlinien für die Probentransport und clean-up im Falle eines Austretens. <ol><li> Legen Sie die Zellen in einem verschlossenen Behälter Styropor oder isolierte Tasche große Veränderungen der Umwelt zu vermeiden. </li></ol></li><li> Legen Sie die Probenabbildung Schale in die Kammer Anweisungen des folgenden Herstellers. </li><li> Nachdem die Zellen innerhalb der Klimakammer, dichten die Kammer zu halten, ein stabiles Umfeld und gleich wieder auf die Quelle (n) des atmosphärischen Gas gesichert wurden. <ol><li> Da einige Klimakammern, keine engen, versiegelte Deckel nutzen zu verzögern Verdunstung, Schicht steril, Embryo-zertifizierte Mineralöl auf der Oberseite des Wachstumsmediums. Gas-permeant Paraffinfilm Wickeln um den Umfang Kanten der Probenschale vorsichtig das Glas nicht Imaging-Bereich zu behindern. Lokalisierte können sekundäre Befeuchtung Verfahren eingesetzt werden. Kondensation auf dem Deckel der Probenschale kann perfor verringernmance von Hellfeldmikroskopie. </li></ol></li><li> Um die Auswirkungen der thermischen Drift früh während des Experiments zu minimieren, warten, 30 Minuten vor der Zeitraffer beginnen. Die benötigte Zeit hängt von Imaging-Schüssel Größe und andere Faktoren. Bestimmen Sie empirisch. </li></ol> 7. Einstellen der Imaging up <ol><li> Wählen Sie Abbildungsbedingungen, die am besten die Daten darstellen. Treffen Sie Vorkehrungen Phototoxizität zu vermeiden, indem Belichtungszeiten zu begrenzen, mit geringerer Intensität Licht und Auswahl von Sonden, die durch längere Wellenlängen des Lichts angeregt werden. </li><li> Definieren x, y und z-Ebene und der gewünschten Wellenlänge (n) für jede Position abgebildet werden. Die Zeitauflösung ist durch die Anzahl von Positionen und Wellenlängen beschränkt. Für langfristige Zeitraffer der meisten zellulären Prozesse, erwerben ein Bild alle 10 - 20 min; höhere Zeitauflösung (kurzen Intervallen, z. B. 1 min) mehr Datenpunkte liefert und damit robuster Zellverfolgung, sondern führt auch zu stärker integriertenBelichtung und größere Datenmengen. <ol><li> Als HT1080 Fucci dynamische grün und rot fluoreszierende Proteine ​​(Repräsentative Ergebnisse sehen), verwenden Sie die folgenden Belichtungszeiten: FITC / GFP - 50 ms, Texas Rot / TRITC - 40 ms, Hellfeld - 20 ms. Verwenden Sie ein 2 x 2 bin. </li></ol></li><li> Aktivieren Software gesteuert automatische Scharfeinstellung die Standardparameter in den erweiterten Einstellungen. Definieren Sie ein Autofokus-Bereich von 10 &amp; mgr; m mit der empfohlenen Schrittgröße. Achten Sie darauf, dies zu tun, bevor die Zeitraffer beginnen. Autofokus mit Hell- Bilder und nie mit Fluoreszenzphototoxizität und Photobleaching zu reduzieren. <ol><li> Softwaregesteuerte Systeme Autofokus auf jedem Mikroskop mit einem motorisierten Tisch und direkt konzentrieren sich auf die Probe. Sie können jedoch die Erfassungsgeschwindigkeit des Experiments begrenzen. Hardware gesteuert Dauerfokussierart Systeme funktionieren gut für Zeitraffer-Mikroskopie und Geschwindigkeit zu verbessern, für mehr Positionen ermöglicht abgebildet oder eine höhere Rate des Erwerbs werden. Aber siestützen sich auf Detektion der Grenzfläche Luft-Glas und kann Mittelpunkt der Probe mit Variationen in der Glasdicke über die gut verlieren. </li></ol></li><li> Ersetzen Sie die Hälfte der Medien mit Medien die gewünschte Wirkstoffkonzentration enthält , die auf 37 ° C erwärmt wurde Teil Medien Austausch hilft thermische Drift zu reduzieren. Die Bedingungen, die in diesem Experiment sind Vehikel (DMSO), 1 &amp; mgr; M selinexor und 10 uM PD0332991. Anmerkung: Dieser Schritt kann auch durch Anhalten und Neustarten des Experimentes nach dem Start der Übernahme erfolgen. Dies ermöglicht eine Längs Verfolgung von Pre- und Post-drug-Antworten einzelner Zellen. Wenn der Arzneimittelstabilität oder Stoffwechsel ist ein Anliegen, Pausieren und ersetzt die Medien können mit dem gleichen Verfahren durchgeführt werden. Um zu testen, für die Arzneimittel Abbau oder Metabolismus, Medien von behandelten Zellen können auch auf naive Zellen platziert werden Arzneimittelwirkung zu testen. </li><li> Starten Sie den Zeitraffer. </li><li> Da die Zeitraffer läuft, stellen Sie sicher, dass die abgebildeten Felder im Fokus bleiben und die chamber hält ein feuchtes 37 o C. <ol><li> Stellen Sie den Fokus, wie durch Anhalten der Erwerb während der Zeitabstand zwischen den Zeitpunkten benötigt. </li></ol></li><li> Falls erforderlich, fügen Sie Wasser in die Kammer bei längeren Experimenten. Vermeiden Sie die Kühlkammer durch Zugabe von vorgewärmten, steriles destilliertes Wasser bei 37 ° C </li></ol> 8. Beenden der Time-lapse <ol><li> Wenn das Experiment zu Ende ausgeführt wurde, beenden Sie den Erwerb, wenn es nicht automatisch zu stoppen, wurde eingestellt. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Zeitraffer richtig auf der Festplatte gespeichert wurde, obwohl die meisten Softwarepakete automatisch während der Aufnahme zu speichern, wenn nicht ordnungsgemäß Daten fertig verloren gehen kann. </li><li> Entfernen Sie die Kammer aus dem Mikroskop und entsorgen Sie die Zellen in biologisch gefährlichen Abfall folgende zugelassene institutionelle Biosicherheit Verfahren. </li></ol> 9. Longitudinal-Tracking und Analyse von Zeitraffer-Daten <ol><li> Wählen Sie die Methode für die Analyse, die istGeeignet für die biologischen Prozesse von Interesse. Viele Plugins für ImageJ, Programme mit Matlab und benutzerdefinierte Plattformen wurden für spezifische Anwendungen hergestellt. Die folgende Methodik umfasst Tracking von Kernen und Analyse von Kernfluoreszenzsonden , wie in den 4 und 5 gezeigt. </li><li> Öffnen Sie die .tif Bildstapel für die verwendeten Kanäle in ImageJ. Alternativ öffnen Sie native Dateien aus dem Erwerb Programm direkt in ImageJ das Bioformats Plugin. </li><li> Zeichnen Sie eine Region of Interest (ROI) innerhalb des Kerns einer Zelle die Hell- Bild oder das Kernetikettenkanal verwendet (falls verwendet), und fügen Sie den ROI-Manager. Hinweis: Wenn die abgebildeten Zellen , die ein Kern Etikett (zB Histone H2B-EGFP.), Dann wird die automatische Zellverfolgung genutzt werden können Regionen von Interesse (ROIs) , die einzelnen Kerne durch die Zeit zu erstellen. </li><li> Fahren Sie mit dem nächsten Punkt und positionieren Sie den ROI innerhalb des gleichen nucleus. Fügen Sie den ROI zu dem ROI-Manager. </li><li> Weiter zu verfolgen und zu machen ROIs für die einzelne Zelle , bis eine Zellereignis ist (Mitose, Apoptose, etc.) , Oder die Zelle nicht mehr nachgeführt werden kann (dh., Bewegt sich aus dem Rahmen oder der Versuch beendet). </li><li> Wenn ROIs sind für Zellen durch die Zeit, die sie im Feld sind, überlagern sie auf die Fluoreszenzkanäle von Interesse etabliert. Messen Sie die mittlere Intensität der Fluoreszenz in jedem Kanal für jeden Zeitpunkt. Speichern Sie die ROI-Liste für die spätere Verwendung. <ol><li> Verschiedene Messungen können innerhalb der ROI für Anwendungen in verschiedenen Experimenten durchgeführt werden. Klicken Sie Analyse → Set Messungen ... ein Menü zu öffnen , um die Analysemethode wählen (z. B. mittlere Intensität innerhalb des ROI, integrierte Intensität, etc.). </li></ol></li><li> Hinweis Zellschicksale für einzelne Zellen (z. B. Apoptose, Teilung, Überleben) , während Tracking. Dies ermöglicht die Schaffung von Überlebenskurven und further Populationsanalyse. </li><li> Mit der mittleren Intensität für beide Kanäle, erstellen Sie ein Streudiagramm zu Zellzyklusdynamik in Reaktion auf Therapeutika (5B, C) ​​anzuzeigen. Hinweis: Die Grundstücke können für einzelne Zellen im Laufe der Zeit oder gemittelt über eine Population von Zellen verfolgt erstellt werden. Quantitative Bildgebung kann für den Aufbau komplexer Reaktionen und Zell Beziehungen in Reaktion auf Krebstherapeutika kritisch sein. Langzeit Zeitraffer-Mikroskopie, Längsverfolgung und Datenanalyse ist ein mehrstufiger Prozess, mit vielen Optionen für die Art der Mikroskopie und Analyse - Tools, und folgt dem allgemeinen Umriss versehen in Abbildung 1. </li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Vorteile der Zeitraffermikroskopie und Longitudinal - Tracking Das Mikroskop ist ein ideales Instrument für Langzeitstudien von Arzneimittelreaktion, wie sie Forscher können einzelne Zellen und ihre Schicksale sowie die gesamte Bevölkerung zu verfolgen. Variability in Ansprechen auf das Medikament innerhalb einer Population von Zellen ist ein wichtiges Thema für Anti-Krebs-Therapie-Design. Längs-Tracking einzelner Zellen ermöglicht Ermittler diese Variabilit...

Live-Zell-Mikroskopie und Längsverfolgung einzelner Zellen ist keine neue Technik. Von den frühesten Mikroskope haben Enthusiasten und Wissenschaftler beobachteten , und einzelne Zellen und Organismen untersucht, ihr Verhalten und die Entwicklung 1-3. Ein berühmtes Beispiel aus dem späten David Rogers an der Vanderbilt University in den 1950er Jahren zeigt eine menschliche Neutrophilen in einem Blutausstrich ein Bakterium Staphylococcus aureus und schließlich den Prozess der Phagozytose 4 jagen. Diese Live-cell-Film ist ein ausgezeichnetes Beispiel dafür, wie mehrere Prozesse können in einem einzigen Experiment beobachtet und korreliert werden: Erfassen eines chemischen Gradienten, der Mechanik und der Geschwindigkeit der Zellbewegung, Zellformen Dynamik, Adhäsion und Phagozytose eines Pathogens. Das Aufkommen der vollautomatischen Mikroskope und hochempfindliche Digitalkameras hat sich in einer wachsenden Zahl von Ermittlern führte Mikroskopie grundlegende Fragen in der Zellbiologie bis hin f fragen mitrom , wie Zellen 5,6 und 7,8 dividieren zu Organell Dynamik und Membrantransport 11.09 bewegen. Nicht fluoreszierende, Hellfeldmikroskopie, einschließlich Phasenkontrast (PC), die den Nobelpreis für Frits Zernike 1953 sammelte und Differentialinterferenzkontrast (DIC) für die Beobachtung von Zellen und Zellkerne erlauben, sondern auch subzellulärer Strukturen einschließlich Mikrotubulus-Bundles , Chromosomen, Kernkörperchen, Organell Dynamik und dicke Aktinfasern 12. Genetisch kodierte fluoreszierende Proteine ​​und die Entwicklung von Fluoreszenzfarbstoffen gegen Organellen haben sich dramatisch Zeitraffer-Mikroskopie 13-15 beeinflusst. Zwar nicht der Schwerpunkt dieses Artikels, Bildgebung in der Zelle Sphäroiden und in situ (Intravitalmikroskopie) mit Hilfe einer konfokalen und Multiphotonen - Mikroskopie stellen eine weitere Ausweitung des Ansatzes, und es gibt hervorragende Artikel , die diese Ansätze 16-19 verwenden und zu diskutieren. Die Antworten von Zellen auf Anti-cancer Drogen oder natürliche Produkte werden auf der molekularen und zellulären Skala bestimmt. Verständnis Zellantworten und Schicksal nach der Behandlung beinhaltet häufig Population Lungs Assays (z. B. Immunoblotting, ganz gut Maßnahmen) oder festen Zeitpunkten mit Immunofluoreszenz - Nachweis und Durchflusszytometrie, die einzelnen Zellen zu messen. Heterogeneity in Einzelzellreaktionen auf Arzneimittel innerhalb einer Population, insbesondere in Tumoren, können einige der Variabilität in Reaktion auf Zelllinien und Tumoren gesehen erklären, die mit dem gleichen Medikament bei Sättigung behandelt. Langzeitlängs Ansätze einer gegebenen einzelnen Zelle oder einer Population von Zellen zu folgen ist ein seltener , aber sehr leistungsfähigen Ansatz, der für die direkte Untersuchung der molekularen Reaktionswege, verschiedene Phänotypen (z. B. den Zelltod oder die Zellteilung) ermöglicht es , die Beobachtung von Zell-zu-Zell - Variabilität innerhalb einer Population, und wie diese Faktoren tragen zur Bevölkerung Ansprechdynamik 20-22. Optimistisch, in der Lage zu seinzu beobachten und einzelne Zell-Reaktionen zu quantifizieren wird unser Verständnis von zu verbessern, wie Medikamente wirken, warum sie manchmal scheitern, und wie man sie am besten nutzen. Die Technik der langfristigen Zeitraffer-Mikroskopie, Längs - Tracking und Analyse von Arzneimittelreaktionen zu vielen Forschern zur Verfügung und kann einfach sein, nur im Durchlicht - Phänotyp Antworten 20,21 zu beobachten. Die Hauptkomponenten des Ansatzes sind: eine angemessene Vorbereitung der Zellen von Interesse, ein automatisiertes Mikroskop mit Klimakammer, eine Kamera mit einem Computer integriert, um die Bilder zu erfassen und zu speichern, und Software, die im Zeitraffer und zu messen und zu analysieren, um die Zellen zu überprüfen und alle Fluoreszenzbiosensoren. Wir bieten ein detailliertes Protokoll mit vielen Tipps für die Durchführung von Zeitraffer-Mikroskopie von kultivierten Zellen so lange wie mehrere Tage mit Hell- und / oder Weitfeld Epifluoreszenzmikroskopie. Dieses Protokoll kann für jede Zelllinie verwendet werden, die in Kultur gezüchtet werden können,ihre Reaktionen auf Anti-Krebs-Therapien zu untersuchen. Wir stellen Beispiele von Daten erfasst und unter Verwendung mehrerer verschiedener genetisch kodierten Fluoreszenz Biosensoren und ein Beispiel für Phasenkontrast-Mikroskopie, kurz verschiedene Arten von Sonden, die Vor- und Nachteile der langfristigen Zeitraffer und Längs Tracking diskutieren, was sein kann für diesen Ansatz gelernt, die aus nicht-direkten Ansätze zu verstehen, und einige Variationen, die wir hoffen, dass sein Interesse und Wert für unerfahrene Forscher, die nicht als mit dem Ansatz, und erfahrene Forscher schwierig ist.

<table><tbody><tr><td>Taxol (Paclitaxel)Sigma</td><td></td> <td>T7191</td><td>Mikrotubuli-stabilisierendes Medikament</td></tr>, <tr><td>Etoposid</td>, <td>Selleckchem</td><td>S1225</td>, <td>Topoisomerase-II-Inhibitor</td></tr>, <tr><td>Selinexor</td><td>Karyopharm Therapeutics</td><td>als</td><td>XPO1/CRM1-Inhibitor, Geschenk</td></tr><tr><td>Kinesin-5-Inhibitor</td><td>Merck Serono</td><td>als</td><td>Geschenk, auch von American Custom Chemicals Corporation erhältlich. CAS 858668-07-2</td></tr><tr><td>Zellwachstumsmedium</td><td>HyClone (Fisher) oder Mediatech</td><td></td><td>viele Firmen verfügbar</td></tr><tr><td>5% CO2/Bilanz Luft, zertifiziert</td><td>Airgas</td><td>Z03NI7222004379</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Schale, 20 mm Glasboden</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>viele Firmen verfügbar</td></tr><tr><td>35 mm 4-Well-Schale, 20 mm Glasboden</td><td>Cellvis</td><td>D35C4-20-1.5-N</td><td>viele Firmen verfügbar</td></tr><tr><td>35 mm Schüssel, gerasterter Glasboden</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-CGRD</td><td>viele Firmen verfügbar</td></tr><tr><td>Multiwell, Glasboden</td><td>Cellvis</td><td>P12-1.5H-N</td><td>viele Firmen verfügbar</td></tr><tr><td>Olympus IX81 inverses Epifluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX2-UCB Controller</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRIOR LumenPro200</td><td>Prior Scientific</td><td>Lumen200PRO</td><td></td></tr><tr><td>PRIOR Proscan III motorisierter Tisch</td><td>Prio Scientific</td><td>H117</td><td></td></tr><tr><td>STEV Kammer</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV. ECU. HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>Umweltregler</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV. ECU. HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA R2 CCD mit Controller</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser Launch</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLA Light Engine</td><td>Lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra 897 EM-CCD</td><td>ANDOR&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TOKAI HIT Inclubation Kammer</td><td>TOKAI HIT</td><td>TIZSH</td><td></td></tr></tbody></table>

durch den spiegel: zeitraffer-mikroskopie und longitudinal-tracking von einzelzellen anti-krebs-therapeutika zu studieren

Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

Die Reaktion von einzelnen Zellen auf Anti-Krebs-Medikamente trägt wesentlich die Bevölkerung Antwort bei der Bestimmung, und ist daher ein wichtiger Faktor in dem Gesamtergebnis. Immunoblotting, die Durchflusszytometrie und fixierte Zellexperimente werden oft verwendet, zu untersuchen, wie Zellen auf Anti-Krebs-Medikamente reagieren. Diese Verfahren sind wichtig, aber sie haben verschiedene Nachteile. Variability in der Arzneimittelreaktionen zwischen Krebszellen und normalen Zellen und zwischen Zellen verschiedener Krebs Ursprungs und transiente und seltene Reaktionen sind schwierig mit Bevölkerung Lungs Assays zu verstehen und ohne direkt in der Lage zu verfolgen und sie in Längsrichtung zu analysieren. Das Mikroskop ist besonders gut geeignet, um Bild lebenden Zellen. Fortschritte in der Technologie ermöglichen es uns, bei einer Auflösung routinemäßig Zellen Bild, das nicht nur Zellverfolgung ermöglicht, sondern auch die Beobachtung einer Vielzahl von zellulären Reaktionen. Wir beschreiben einen Ansatz im Detail, die für die kontinuierliche Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht es derZellen während der Arzneimittelantwort für im wesentlichen so lange wie gewünscht, in der Regel bis zu 96 Stunden. Mit Variationen des Ansatzes können die Zellen für Wochen überwacht werden. Mit dem Einsatz von genetisch Fluoreszenzbiosensoren codiert zahlreiche Prozesse, Wege und Reaktionen können verfolgt werden. Wir zeigen Beispiele, die Verfolgung und die Quantifizierung von Zellwachstum und die Zellzyklusprogression, Chromosomendynamik, DNA-Schädigung und Zelltod sind. Wir diskutieren auch Variationen der Technik und ihrer Flexibilität und typische Fehler hervorzuheben.

Langzeit Zeitraffer-Mikroskopie und direkte Längs Tracking ermöglicht die Untersuchung von vielen Anti-Krebs-Wirkung während der Arzneimittelantwort. Nach dem allgemeinen Umriß in Figur 1, werden mehrere Beispiele für Zellen gezeigt validierten fluoreszierenden Reporter exprimieren , das mit Anti-Krebs - Medikamenten behandelt, verfolgt und analysiert werden verschiedene Ansätze verwendet. Phasenkontrast - Mik...

Hier beschreiben wir eine Methode der Langzeit-Zeitraffermikroskopie, um einzelne Zellen als Reaktion auf Anti-Krebs-Therapeutika longitudinal zu verfolgen.

Durch den Spiegel: Zeitraffer-Mikroskopie und Longitudinal-Tracking von Einzelzellen Anti-Krebs-Therapeutika zu studieren

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die therapeutische Wirkung gegen Krebszellen in einzelnen Zellen in Kultur zu beobachten. Diese Methode kann zentrale Fragen im Bereich der Krebsforschung beantworten, darunter die heterogene therapeutische Reaktion und das Zellschicksal. Beginnen Sie damit, HT1080-Zellen unter einer zertifizierten sterilen Flusswerkbank gemäß dem Textprotokoll in kulturzertifizierten Schalen vorzubereiten und inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Zellkulturinkubator.Zwei Tage vor der Bildgebung 50.000 HT1080-FuGENE-Zellen pro Vertiefung in die gewünschte Anzahl Vertiefungen einer 12-Loch-Kulturschale mit Glasboden (No. 1,5) aussäen. Die Anzahl der ausgesäten Zellen je nach Wachstumsrate der Zellen und der verwendeten Schale anpassen, um zu Beginn des Experiments eine Konfluenz von etwa 60 % zu erreichen.Richten Sie die Umweltkammer auf etwa 80 % Luftfeuchtigkeit ein, wobei die Temperatur an der Probenposition auf 37 Grad Celsius eingestellt werden sollte. Stellen Sie sicher, dass das Wasserreservoir gemäß den Herstelleranweisungen mit steriler, destillierter Wasser befüllt ist. Schalten Sie anschließend die Umweltkammer auf die gewünschte Temperatur ein, platzieren Sie sie auf der Mikroskopbühne und richten Sie sie ein.Falls zwischen der oberen Kammer und dem Bühneneinsatz Freiraum vorhanden ist, legen Sie vor dem Einsetzen der Kammer Stücke Paraffinfolie über die Ränder der Öffnung des Bühneneinsatzes, um die Kammer mit der Bühne zu koppeln. Stellen Sie sicher, dass keine Verbindungen an der Kammer ziehen, da beides Bewegungsartefakte verursachen kann. Setzen Sie eine Blindprobe mit Wasser in die Kammer ein und lassen Sie die Kammer auf 37 Grad Celsius equilibrieren, um anschließend eine stabile Temperatur aufrechtzuerhalten.Um die Bildgebung vorzubereiten, schalten Sie das Mikroskop, den Computer und alle erforderlichen Peripheriegeräte ein. Je nach Lichtquelle warten Sie mit dem Einschalten, bis sie benötigt wird. Stellen Sie am Objektivrevolver eine niedrige Position ein und wählen Sie das 20x 0,7 numerische Apertur-Objektiv aus.Danach platzieren Sie die Probe über dem Objektiv, wodurch es leichter wird, die Zellen zu finden, sobald sich die Probe in der Kammer befindet. Nachdem die zu bildgebenden Zellen gemäß dem schriftlichen Protokoll in die Umgebungskammer überführt wurden, verschließen Sie die Kammer, um ein stabiles Milieu aufrechtzuerhalten, und schalten Sie das Atmosphärgas ein. Anschließend wählen Sie Bildgebungsbedingungen, die Phototoxizität verhindern, indem Sie die Belichtungszeiten begrenzen und Licht mit geringer Intensität verwenden.Um die X-, Y- und Z-Ebenen sowie die gewünschten Wellenlängen für jede zu bildgebende Position zu finden. Für Langzeit-Zeitraffaufnahmen der meisten zellulären Prozesse alle zehn bis zwanzig Minuten ein Bild aufnehmen. Eine höhere zeitliche Auflösung liefert mehr Datenpunkte und eine robustere Zellverfolgung, führt jedoch zu einer stärkeren akkumulierten Lichtexposition und größeren Datensätzen.Da HT1080 FuGENE über dynamische grüne und rote fluoreszierende Proteine verfügen, verwenden Sie die folgenden Belichtungszeiten und nutzen Sie eine 2-mal-2-Binning-Einstellung. Aktivieren Sie unter erweiterten Einstellungen die softwaregesteuerte Autofokusfunktion mit den Standardeinstellungen. Definieren Sie einen Autofokus-Bereich von 10 Mikrometern mit der empfohlenen Schrittgröße.Ersetzen Sie in der Versuchsschale zur Verringerung von thermischem Drift die Hälfte des Mediums durch Medium, das den gewünschten Wirkstoff enthält und auf 37 Grad Celsius erwärmt wurde. Starten Sie abschließend die Zeitrafferaufnahme und nehmen Sie die Bilder gemäß dem Textprotokoll auf. Diese Filme zeigen Beispiele eines gepaarten, aus Brustkrebs stammenden MCF7-Zelllinienpaares, das sich nur in ihrem p53-Status unterscheidet und mit einem Anti-Krebs-Mittel behandelt wurde, das Kinesin-5 hemmt und zu einem mitotischen Arrest führt.Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, durchlaufen die Zellen nach stabiler p53-Reduktion, anstatt nach dem Verlassen der Mitose zu arretieren, wiederholte Zyklen, in denen sie eine zweite Runde der Mitose durchlaufen, anstatt zu arretieren, und die Mitose ohne Teilung verlassen. Dargestellt sind zervikale Karzinom-abgeleitete Hela-Zellen, die stabil den an mCherry fusionierten Chromatinmarker Histone 2b sowie an EGFP fusionierten Beta-Tubulin exprimieren. Bei Behandlung mit dem Mikrotubuli-stabilisierenden Wirkstoff Paclitaxol wird die Chromosomenausrichtung und -segregation während der Mitose gestört, was zur Bildung von nukleären Ausstülpungen und Mikrokernen führt, die anfällig für DNA-Schäden sind.Diese Zelllinie exprimiert stabil die beiden fluoreszierenden Ubiquitin-Zellzyklusindikatoren für CDT1, in orange, und Geminin, in grün, und durchläuft den Zellzyklus normal. Wenn dieselben Zellen mit dem CDK46-Inhibitor behandelt werden, durchlaufen sie die G2-Phase und teilen sich normal, bevor sie in der G1-Phase stark arrestieren, was auf ein Potenzial für wirksame zytostatische Effekte in wachsenden Tumoren hinweist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass man die Reaktion einzelner Zellen direkt in Echtzeit über mehrere Tage hinweg verfolgen kann, anstatt diese Reaktionen erschließen zu müssen.

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Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Video zeigt eine Methode zur Verfolgung des bispezifischen Antikörper-induzierten T-Zell-Transports zu Tumoren in einem Mausmodell. Luciferase-transduzierte Effektor-T-Zellen werden mit einem subkutanen Tumorzell-Xenotransplantat in eine Maus injiziert. Anschließend werden bispezifische Antikörper eingeführt, die an T-Zellen und die Tumorzellen binden. Die Lokalisation der T-Zellen wird mit Hilfe der biolumineszierenden Bildgebung verfolgt, wobei die Größe des Signals das Ausmaß der...

Eine In-vivo-Technik zur Verfolgung des bispezifischen Antikörper-induzierten T-Zell-Transports zu Tumoren

Wir beschreiben ein Single-Cell-Assay mit hohem Durchsatz, die Zytotoxizität von T-Zellen zu messen, wenn mit Tumor Zielzellen inkubiert. Dieses Verfahren verwendet eine dichte, elastomeren Anordnung von Sub-Nanoliter-Wells (~ 100.000 Wells / Array) räumlich zu begrenzen, die T-Zellen und Zielzellen in definierten Verhältnissen und mit Fluoreszenzmikroskopie gekoppelt Effektor-Target Konjugation und anschließender Apoptose überwachen.

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Multiphotonen - Mikroskopie ausgedehnte Zeitraffer-Bildgebung von mehrzelligen Interaktionen in Echtzeit durchzuführen, in vivo auf Einzelzellauflösung.

Erweiterte Zeitraffer-Intravital Imaging von Echtzeit-Vielzellige Dynamics im Tumormikromilieu

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Bild resident Tumor infiltrieren CD8 T-Zellen beschriftet mit Gewebekulturen gekoppelten Antikörpern im menschlichen Lunge Tumor Scheiben. Diese Technik ermöglicht Echtzeit-Analysen von CD8 T Zelle Migration mit der konfokalen Mikroskopie.

Ex-Vivo Bildgebung von Resident CD8-T-Lymphozyten in menschlichen Lungentumor Scheiben mit konfokalen Mikroskopie

Die In-vivo-Immunfluoreszenzlokalisationsmethode (IVIL) kann verwendet werden, um die In-vivo-Bioverteilung von Antikörpern und Antikörperkonjugaten für onkologische Zwecke in lebenden Organismen mit einer Kombination aus In-vivo-Tumor-Targeting und Ex-vivo-Immunfärbung zu untersuchen. Methoden.

In Vivo Immunfluoreszenzlokalisation zur Bewertung der therapeutischen und diagnostischen Antikörperbiodistribution in der Krebsforschung

Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie die Lattice Light-Sheet-Mikroskopie verwendet wird, um die Dynamik von Oberflächenrezeptoren in lebenden Zellen vierdimensional zu visualisieren. Hier werden T-Zellrezeptoren auf CD4+ primären T-Zellen gezeigt.

Visualisierung der Oberflächen-T-Zell-Rezeptordynamik vierdimensional mit Lattice Light-Sheet-Mikroskopie

Makrophagen-phagozytische Aktivität gegen Krebszellen, insbesondere 4T1 Maus-Mammakarzinom-Zellen, wurde in dieser Studie abgebildet. Das Modell der Kokultur von Lebenden Zellen wurde mit einer Kombination aus fluoreszierender und differentialer Interferenzkontrastmikroskopie erstellt und beobachtet. Diese Bewertung wurde mit Hilfe von Bildverarbeitungssoftware zur Entwicklung von Multipoint-Zeitraffervideos abget/die sich erstellt haben.

Time-Lapse 2D Imaging der phagozytischen Aktivität in M1 Macrophage-4T1 Maus-Mammary Karzinom-Zellen in Kokulturen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Untersuchung der In-vivo-Lokalisierung von Antikörpern in Mäusetumor-Xenograft-Modellen vor.

Analyse der Tumor- und Gewebeverteilung von Zielantigen-spezifischen therapeutischen Antikörpern

In dieser Studie wird ein Protokoll der Lebend-3D-Zell-Immunzytochemie vorgestellt, das auf eine pädiatrische diffuse Mittellinien-Gliomzelllinie angewendet wird, um die Expression von Proteinen auf der Plasmamembran während dynamischer Prozesse wie 3D-Zellinvasion und -migration in Echtzeit zu untersuchen.

Lebend-3D-Zell-Immunzytochemie-Assays des pädiatrischen diffusen Mittellinienglioms

In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur Transduktion von humanen T-Zellen mit Luciferase, um die in vivo Verfolgung des bispezifischen Antikörper-induzierten T-Zell-Transports zu Tumoren in Studien zur Evaluierung der Anti-Tumor-Wirksamkeit und des Mechanismus von T-Zell-bindenden bispezifischen Antikörpern zu ermöglichen.

Verfolgung des bispezifischen Antikörper-induzierten T-Zell-Transports mit Luciferase-transduzierten menschlichen T-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt die Single-Antibody-Markierung (SAL), um die nanoskalige räumliche Organisation von Plasmamembranproteinen zu klären. Durch die Nutzung kumulativer Antikörper-Epitope-Interaktionen auf Einzelmolekülebene kartiert Membran-SAL (mSAL) lokale Epitope-Verteilungen und erfasst gleichzeitig das Antikörperbindungsverhalten in der nativen zellulären Umgebung.

Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie von Membranproteinen mittels Einzel-Antikörper-Markierung

Erfahren Sie Zeitraffer-Mikroskopie zur Untersuchung von Einzelzell-Antworten auf Anti-Krebs-Therapeutika in HT1080- und HeLa-Zellen. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Beobachtung heterogener therapeutischer Reaktionen und Zellschicksale.

Durch den Spiegel: Zeitraffer-Mikroskopie und Longitudinal-Tracking von Einzelzellen Anti-Krebs-Therapeutika zu studieren

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