Durch den Spiegel: Zeitraffer-Mikroskopie und Longitudinal-Tracking von Einzelzellen Anti-Krebs-Therapeutika zu studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die therapeutische Wirkung gegen Krebszellen in einzelnen Zellen in Kultur zu beobachten. Diese Methode kann zentrale Fragen im Bereich der Krebsforschung beantworten, darunter die heterogene therapeutische Reaktion und das Zellschicksal. Beginnen Sie damit, HT1080-Zellen unter einer zertifizierten sterilen Flusswerkbank gemäß dem Textprotokoll in kulturzertifizierten Schalen vorzubereiten und inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Zellkulturinkubator.

Zwei Tage vor der Bildgebung 50.000 HT1080-FuGENE-Zellen pro Vertiefung in die gewünschte Anzahl Vertiefungen einer 12-Loch-Kulturschale mit Glasboden (No. 1,5) aussäen. Die Anzahl der ausgesäten Zellen je nach Wachstumsrate der Zellen und der verwendeten Schale anpassen, um zu Beginn des Experiments eine Konfluenz von etwa 60 % zu erreichen.

Richten Sie die Umweltkammer auf etwa 80 % Luftfeuchtigkeit ein, wobei die Temperatur an der Probenposition auf 37 Grad Celsius eingestellt werden sollte. Stellen Sie sicher, dass das Wasserreservoir gemäß den Herstelleranweisungen mit steriler, destillierter Wasser befüllt ist. Schalten Sie anschließend die Umweltkammer auf die gewünschte Temperatur ein, platzieren Sie sie auf der Mikroskopbühne und richten Sie sie ein.

Falls zwischen der oberen Kammer und dem Bühneneinsatz Freiraum vorhanden ist, legen Sie vor dem Einsetzen der Kammer Stücke Paraffinfolie über die Ränder der Öffnung des Bühneneinsatzes, um die Kammer mit der Bühne zu koppeln. Stellen Sie sicher, dass keine Verbindungen an der Kammer ziehen, da beides Bewegungsartefakte verursachen kann. Setzen Sie eine Blindprobe mit Wasser in die Kammer ein und lassen Sie die Kammer auf 37 Grad Celsius equilibrieren, um anschließend eine stabile Temperatur aufrechtzuerhalten.

Um die Bildgebung vorzubereiten, schalten Sie das Mikroskop, den Computer und alle erforderlichen Peripheriegeräte ein. Je nach Lichtquelle warten Sie mit dem Einschalten, bis sie benötigt wird. Stellen Sie am Objektivrevolver eine niedrige Position ein und wählen Sie das 20x 0,7 numerische Apertur-Objektiv aus.

Danach platzieren Sie die Probe über dem Objektiv, wodurch es leichter wird, die Zellen zu finden, sobald sich die Probe in der Kammer befindet. Nachdem die zu bildgebenden Zellen gemäß dem schriftlichen Protokoll in die Umgebungskammer überführt wurden, verschließen Sie die Kammer, um ein stabiles Milieu aufrechtzuerhalten, und schalten Sie das Atmosphärgas ein. Anschließend wählen Sie Bildgebungsbedingungen, die Phototoxizität verhindern, indem Sie die Belichtungszeiten begrenzen und Licht mit geringer Intensität verwenden.

Um die X-, Y- und Z-Ebenen sowie die gewünschten Wellenlängen für jede zu bildgebende Position zu finden. Für Langzeit-Zeitraffaufnahmen der meisten zellulären Prozesse alle zehn bis zwanzig Minuten ein Bild aufnehmen. Eine höhere zeitliche Auflösung liefert mehr Datenpunkte und eine robustere Zellverfolgung, führt jedoch zu einer stärkeren akkumulierten Lichtexposition und größeren Datensätzen.

Da HT1080 FuGENE über dynamische grüne und rote fluoreszierende Proteine verfügen, verwenden Sie die folgenden Belichtungszeiten und nutzen Sie eine 2-mal-2-Binning-Einstellung. Aktivieren Sie unter erweiterten Einstellungen die softwaregesteuerte Autofokusfunktion mit den Standardeinstellungen. Definieren Sie einen Autofokus-Bereich von 10 Mikrometern mit der empfohlenen Schrittgröße.

Ersetzen Sie in der Versuchsschale zur Verringerung von thermischem Drift die Hälfte des Mediums durch Medium, das den gewünschten Wirkstoff enthält und auf 37 Grad Celsius erwärmt wurde. Starten Sie abschließend die Zeitrafferaufnahme und nehmen Sie die Bilder gemäß dem Textprotokoll auf. Diese Filme zeigen Beispiele eines gepaarten, aus Brustkrebs stammenden MCF7-Zelllinienpaares, das sich nur in ihrem p53-Status unterscheidet und mit einem Anti-Krebs-Mittel behandelt wurde, das Kinesin-5 hemmt und zu einem mitotischen Arrest führt.

Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, durchlaufen die Zellen nach stabiler p53-Reduktion, anstatt nach dem Verlassen der Mitose zu arretieren, wiederholte Zyklen, in denen sie eine zweite Runde der Mitose durchlaufen, anstatt zu arretieren, und die Mitose ohne Teilung verlassen. Dargestellt sind zervikale Karzinom-abgeleitete Hela-Zellen, die stabil den an mCherry fusionierten Chromatinmarker Histone 2b sowie an EGFP fusionierten Beta-Tubulin exprimieren. Bei Behandlung mit dem Mikrotubuli-stabilisierenden Wirkstoff Paclitaxol wird die Chromosomenausrichtung und -segregation während der Mitose gestört, was zur Bildung von nukleären Ausstülpungen und Mikrokernen führt, die anfällig für DNA-Schäden sind.

Diese Zelllinie exprimiert stabil die beiden fluoreszierenden Ubiquitin-Zellzyklusindikatoren für CDT1, in orange, und Geminin, in grün, und durchläuft den Zellzyklus normal. Wenn dieselben Zellen mit dem CDK46-Inhibitor behandelt werden, durchlaufen sie die G2-Phase und teilen sich normal, bevor sie in der G1-Phase stark arrestieren, was auf ein Potenzial für wirksame zytostatische Effekte in wachsenden Tumoren hinweist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass man die Reaktion einzelner Zellen direkt in Echtzeit über mehrere Tage hinweg verfolgen kann, anstatt diese Reaktionen erschließen zu müssen.