Durch den Spiegel: Zeitraffer-Mikroskopie und Longitudinal-Tracking von Einzelzellen Anti-Krebs-Therapeutika zu studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das therapeutische Ansprechen gegen Krebs in einzelnen Zellen in Kultur zu beobachten. Diese Methode kann Schlüsselfragen in der Krebsforschung beantworten, darunter das heterogene therapeutische Ansprechen und das Schicksal von Zellen. Bereiten Sie zunächst unter einer zertifizierten sterilen Laminar-Flow-Haube HT1080-Zellen in kulturzertifizierten Schalen gemäß dem Textprotokoll vor und inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator.

Zwei Tage vor der Bildgebung werden 50.000 HT1080 FuGENE-Zellen pro Vertiefung in die gewünschte Anzahl von Vertiefungen einer 12-Well-Schale mit Glasboden Nr. 1,5 gefüllt. Passen Sie die Anzahl der plattierten Zellen in Abhängigkeit von ihrer Wachstumsrate und der verwendeten Schale an, um zu Beginn des Experiments eine Konfluenz von etwa 60 % zu erreichen.

Stellen Sie die Klimakammer auf eine Luftfeuchtigkeit von ca. 80 % ein, wobei die Temperatur an der Probenposition auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Stellen Sie sicher, dass der Wasserbehälter gemäß den Anweisungen des Herstellers mit sterilem destilliertem Wasser gefüllt ist. Schalten Sie dann die Klimakammer auf die gewünschte Temperatureinstellung ein, positionieren Sie sie auf dem Mikroskoptisch und stellen Sie sie ein.

Wenn zwischen der oberen Kammer der Bühne und dem Bühneneinsatz ein freier Raum vorhanden ist, legen Sie vor dem Einsetzen der Kammer Paraffinfilmstücke über die Ränder der Öffnung des Bühneneinschubs, um die Kammer mit dem Tisch zu verbinden. Stellen Sie sicher, dass keine Verbindungen an der Kammer ziehen, da beide Bewegungsartefakte verursachen können. Setzen Sie eine Dummy-Schale mit Wasser in die Kammer ein und lassen Sie die Kammer auf 37 Grad Celsius ausgleichen, um dann eine stabile Temperatur zu halten.

Um die Bildgebung einzurichten, schalten Sie das Mikroskop, den Computer und alle erforderlichen Peripheriegeräte ein. Warten Sie je nach Lichtquelle mit dem Einschalten, bis es benötigt wird. Wenn sich der Objektivrevolver in einer niedrigen Position befindet, wählen Sie das Objektiv mit 20x 0,7 numerischer Apertur.

Positionieren Sie dann die Probe über dem Objektiv, was das Auffinden der Zellen erleichtert, wenn sich die Probe in der Kammer befindet. Nachdem Sie die abzubildenden Zellen gemäß dem Textprotokoll in die Klimakammer gebracht haben, verschließen Sie die Kammer, um eine stabile Umgebung zu erhalten, und schalten Sie das atmosphärische Gas ein. Wählen Sie als Nächstes Bildgebungsbedingungen aus, die Phototoxizität verhindern, indem sie die Belichtungszeiten begrenzen und Licht mit geringerer Intensität verwenden.

So finden Sie die X-, Y- und Z-Ebenen und die gewünschten Wellenlängen für jede abzubildende Position. Für einen langfristigen Zeitraffer der meisten zellulären Prozesse nehmen Sie alle zehn bis zwanzig Minuten ein Bild auf. Eine höhere Zeitauflösung bietet mehr Datenpunkte und eine robustere Zellverfolgung, führt jedoch zu einer stärker integrierten Lichtbelichtung und größeren Datensätzen.

Da HT1080 FuGENE dynamische grüne und rote phloreszente Proteine enthält, verwenden Sie die folgenden Expositionszeiten und verwenden Sie einen Zwei-mal-Zwei-Bin. Aktivieren Sie unter Erweiterte Einstellungen den softwaregesteuerten Autofokus mit den Standardeinstellungen. Definieren Sie einen Autofokusbereich von 10 Mikrometern mit der empfohlenen Schrittweite.

Um die thermische Drift zu verringern, wird in der Versuchsschale die Hälfte des Mediums durch ein Medium ersetzt, das das gewünschte Medikament enthält und auf 37 Grad Celsius erwärmt wurde. Starten Sie abschließend den Zeitraffer und nehmen Sie Bilder gemäß dem Textprotokoll auf. Diese Filme zeigen Beispiele für ein Paar passender MCF7-Zelllinien aus Brustkrebs, die sich nur in ihrem p53-Status unterscheiden und mit einem Krebsmedikament behandelt wurden, das Kinesin-5 hemmt, was zu einem mitotischen Stillstand führt.

Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, durchlaufen die Zellen, wenn p53 durch einen stabilen p53-Knockdown entfernt wird, anstatt nach dem Verlassen der Mitose zu verharren, wiederholte Zyklen, in denen sie in eine zweite Runde der Mitose eintreten, anstatt zu verharren, und die Mitose ohne Teilung verlassen. Hier sind aus dem Zervixkarzinom stammende Hela-Zellen zu sehen, die den Chromatinmarker Histon 2b stabil exprimieren, fusioniert mit mCherry und Beta-Tubulin, fusioniert mit EGFP. Bei der Behandlung mit dem Mikrotubuli-stabilisierenden Medikament Paclitaxol wird die Chromosomenausrichtung und -trennung während der Mitose gestört, was zur Bildung von Kernausbuchtungen und Mikrokernen führt, die anfällig für DNA-Schäden sind.

Diese Zelllinie koexprimiert stabil die beiden phloreszenten Ubiquitin-Zellzyklusindikatoren für CDT1 (orange und Geminin grün) und verläuft normal durch den Zellzyklus. Wenn dieselben Zellen mit dem CDK46-Inhibitor behandelt werden, durchlaufen die Zellen die G2-Phase und teilen sich normal, um dann in der G1-Phase stark zu vereiteln, was auf das Potenzial für affektive zytostatische Effekte in wachsenden Tumoren hinweist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie eine einzelne Zellantwort direkt und in Echtzeit über viele Tage hinweg verfolgen können, anstatt diese Reaktionen abzuleiten.