Erweiterte Zeitraffer-Intravital Imaging von Echtzeit-Vielzellige Dynamics im Tumormikromilieu

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die dynamischen Ereignisse innerhalb der Tumormikroumgebung mittels hochauflösender, intravitaler Multiphotonen-Mikrosphäre sichtbar zu machen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen über die Mikroumgebung des Tumors zu beantworten, z. B. welche dynamischen Ereignisse an der Gefäßpermeabilität und multizellulären Wechselwirkungen beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Kinetik der Ereignisse in der Tumormikroumgebung beobachtet und gemessen werden kann.

Schalten Sie vor Beginn des Eingriffs alle Mikroskop- und Laserkomponenten ein, einschließlich der beiden Photonenlaser und der Detektoren. Und stellen Sie die Heizbox auf 30 Grad Celsius ein, um die Bühne vorzuwärmen. Wischen Sie den Mikroskoptisch und den Tischeinsatz mit 70% Ethanol ab.

Wenn der Tisch trocken ist, geben Sie einen großen Tropfen Wasser auf das 25 x 1,05 NA Mikroskopobjektiv, um den optischen Kontakt mit dem Deckglas aufrechtzuerhalten, und platzieren Sie ein Deckglas mit einer Dicke von 1,5 über der Einsatz-Bildgebungsöffnung. Schneiden Sie dann ein 30 Zentimeter langes Stück Polyethylenschlauch ab. Lege die Gummiauflage auf das Deckglas.

Brechen Sie mit einer Pinzette eine 31-Gauge-Nadel von der Kunststoffarmatur ab und führen Sie das abgestumpfte Ende der Nadelnabe in den Schlauch ein. Führen Sie eine 31-Gauge-Nadel in das andere Ende des PE-Schlauchs ein und befestigen Sie sie. Füllen Sie dann eine 1-cm³-Spritze mit sterilem PBS und befestigen Sie die Spritze an der 31-Gauge-Nadel.

Verwenden Sie das PBS, um die gesamte Luft aus dem Schlauch und der Nadel zu spülen. Dann die eine cc-Spritze mit 200 Mikrolitern der entsprechenden Gefäßmarkierung und eine weitere mit dem entsprechenden injizierbaren Protein. Bestätigen Sie vor Beginn der Operation die richtige Anästhesie mit mangelnder Reaktion auf das Einklemmen der Zehen und tragen Sie Augensalben auf die anästhesierte Maus auf.

Legen Sie das Tier anschließend auf eine chirurgische Plattform unter eine Wärmelampe, um die Schwanzzirkulation zu erhöhen. Nach zwei Minuten sterilisieren Sie den Schwanz mit 70 % Ethanol und führen Sie die Spitze des 31-Gauge-Katheters zwei bis drei Millimeter in die seitliche Schwanzvene ein. Legen Sie dann ein Zentimeter langes Laborband auf den Katheter, um die Nadel entlang der Länge des Schwanzes parallel zur Vene zu halten.

Wenn der Katheter gesichert ist, tupfen Sie die Bauch- und Tumoroberflächen mit 70 % Ethanol ab. Heben Sie dann die Haut über den Bauch und machen Sie mit einer sterilen Schere einen etwa einen Zentimeter langen subkutanen Schnitt entlang der ventralen Mittellinie des Bauches, wobei Sie darauf achten, dass das Bauchfell nicht durchstochen wird. Schneiden Sie das Bindegewebe, das die Brustdrüse und den Tumor anbindet, vorsichtig vom Bauchfell weg, um den Tumor freizulegen.

Entfernen Sie dann mit der Schere und der Pinzette vorsichtig die Faszien und das Fett von der freiliegenden Oberfläche des Tumors. Wenn der Tumor freigelegt wurde, überführen Sie die Maus in die vorgewärmte Bildgebungsstufe. Befestigen Sie das Deckglas mit Laborklebeband und platzieren Sie den Tumor dann in das Loch einer Gummiunterlage, die den Deckglas über dem Mikroskopobjektiv abdeckt.

Wenn das Tier in Position ist, füllen Sie die Gummipolsterkammer mit PBS, um das Gewebe mit Feuchtigkeit zu versorgen und den optischen Kontakt mit dem Deckglas aufrechtzuerhalten. Legen Sie einen Halsbandsensor mit Pulsoximetersonde um den Hals, um die Vitalparameter des Tieres zu überwachen, und platzieren Sie die Heizbox über dem Tier. Verwenden Sie dann die IPs des Mikroskops, um sich auf die fluoreszierenden Tumorzellen auf der Oberfläche des Tumors und im Bereich mit fließenden Blutgefäßen zu konzentrieren.

Nachdem Sie einen interessierenden Bereich ausgewählt haben, schalten Sie das Mikroskop in den Multiphotonen-Bildgebungsmodus und bewegen Sie das Objektiv mit dem Fokuseinsteller an die gewünschte Startposition. Klicken Sie dann auf die obere Schaltfläche für die Z-Position, um die obere Grenze der z-Reihe festzulegen und das Kollagenfasernetzwerk an der Oberfläche des Tumors im zweiten harmonischen Erzeugungskanal zu visualisieren. Bewegen Sie dann das Objektiv auf die gewünschte Abbildungstiefe und klicken Sie auf die untere Schaltfläche für die Z-Position, um die untere Grenze der z-Serie festzulegen.

Geben Sie anschließend den gewünschten Wert in die Felder für die Schrittweite ein. Wechseln Sie dann zum Zeitraffer-Panel und geben Sie die entsprechende Zeitrafferzeit ein. Nachdem die bildgebenden Parameter bestimmt waren, ersetzen Sie die am Katheter befestigte Spritze durch eine Spritze mit Gefäßmarkierungsfarbstoff und verabreichen Sie langsam maximal 200 Mikroliter der Farbstofflösung, wobei Sie darauf achten müssen, dass die Lösung in die Vene gelangt.

Legen Sie die PBS-Spritze nach der Injektion wieder in den Katheter und beginnen Sie mit der Z-Schritt-Zeitrafferbildgebung. Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, ersetzen Sie die Spritze mit PBS durch die Spritze mit dem injizierbaren Protein und achten Sie darauf, dass keine Blasen in die Leitung gelangen. Injizieren Sie dann langsam die Proteinsuspension in die Maus und ersetzen Sie die Spritze durch eine Spritze, die PBS enthält.

Makrophagen können mit fluoreszenzmarkiertem 70 Kilodalton und Dextran verfolgt werden, die sich in den phagozytären Mikrophagen ansammeln. Durch die doppelte Markierung der Tumorzellen und der Mikrophagen kann die direkte Interaktion mit diesen beiden Zelltypen in Echtzeit sichtbar gemacht werden. Um Veränderungen der Gefäßpermeabilität des Tumors sichtbar zu machen, können Quantenpunkte auch zur Markierung des Gefäßraums verwendet werden.

Da sie groß genug sind, dass sie nicht ohne weiteres durch die interarteriellen Räume diffundieren. Die kontinuierliche, hochauflösende Bildgebung ermöglicht die Erfassung der vaskulären Permeabilitätsereignisse und die Quantifizierung der Kinetik der Dextranextravasation und -clearance. In diesem Beispiel-Sichtfeld wird der Höhepunkt der vakskulären Diextravasation zwischen 29 und 34 Minuten beobachtet, was durch das extravaskuläre TMR-Signal belegt wird.

Die Injektion zusätzlicher Gefäßfarbstoffe oder Proteine zur Induktion der Gefäßpermeabilität kann Einblicke in die Signalereignisse geben, die die Gefäßpermeabilität regulieren. Tatsächlich können innerhalb der ersten Sekunden nach der Injektion 10 Kilodalton Dextran-FITC beobachtet werden, die aus dem Gefäßsystem extravasieren, während die 155 Kilodalton in Dextran-TMR auf den Gefäßraum beschränkt bleiben. Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Stunde abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei diesem Eingriff ist es wichtig, daran zu denken, das Bindegewebe sanft zu entfernen, ohne die Oberfläche des Tumors zu beschädigen, und die Tumoroberfläche mit Feuchtigkeit zu versorgen. Nach diesem Verfahren der zellulären Dynamik kann eine solche Tumorzellmigration sichtbar gemacht werden, um zusätzliche Fragen zur Richtungsabhängigkeit der Tumorzellmigration und Intravasation zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie dynamische zelluläre Ereignisse in einer Tumormikroumgebung durch intervitale Multiphotonenmikroskopie visualisiert werden können.