Name: Erweiterte Zeitraffer-Intravital Imaging von Echtzeit-Vielzellige Dynamics im Tumormikromilieu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Erfahren Sie die erweiterte Zeitraffer-Intravital-Mikroskopie zur Visualisierung dynamischer Ereignisse im Tumormikromilieu in Echtzeit. Diese Methode ermöglicht die Messung von Vaskulärpermeabilität und multizellulären Interaktionen mit hoher Auflösung.

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Diese Arbeit wurde durch das Department of Defense Breast Cancer Research Program unter Verleihungsnummer (ASH, W81XWH-13-1-0010), NIH CA100324, PPG CA100324 und dem Integrated Imaging-Programm unterstützt.

Alle beschriebenen Verfahren müssen mit den Richtlinien und Vorschriften für den Einsatz von Wirbeltieren, einschließlich der vorherigen Zustimmung des Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care und Use Committee entsprechend durchgeführt werden. 1. Erstellen von fluoreszenzmarkierten Tumoren und Tumor-assoziierten Makrophagen <ol><li> Generieren Sie fluoreszenzmarkierten Tumorzellen durch die spontane, autochthonen, gentechnisch veränderte Maus Brustkrebsmodell Kreuzung , wo die Maus - Mammatumorvirus long terminal repeat den Polyoma Mitte - T - Antigen (MMTV-PyMT) mit transgenen Mäusen mit fluoreszierenden Reporter - Laufwerke [dh Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP), verbesserte cyan fluoreszierende Protein (ECFP) oder Dendra2] 8,9. </li><li> Fluoreszenz Etikett Makrophagen in PyMT Tiere mit fluoreszenzTumorZellen gekennzeichnet durch mit myeloid- und Makrophagen spezifischen fluoreszierenden Reporter gentechnisch veränderter Mausmodelle Kreuzung [dh MacGreen 15 oder MacBlue Mäuse CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16]. </li><li> Alternativ erzeugen fluoreszenz Tumoren durch orthotope Transplantation von fluoreszenzmarkierten PyMT Tumorzellen (syngene), humane Brustkrebszelllinien oder primären humanen Patienten stammt Tumoren (Xenotransplantate) 11,17 bezeichnet. <ol><li> Implantat fluoreszenz PyMT Tumorzellen in syngene Mäuse , die mit fluoreszierendem Protein-markiertem myeloischen Zellen markiert Tiere mit fluoreszierend markierten Tumorzellen und myeloiden Zellen 13 zu erzeugen. </li></ol></li><li> Injizieren von 100 &amp; mgr; l von 10 mg / kg fluoreszierendes 70 kDa Dextran durch intravenöse (iv) Schwanzvene in severe combined immunodeficiency (SCID) -Mäusen mit Xenotransplantattumoren von menschlichen Zelllinien oder Patienten stammenden primären Tumoren fluoreszenz Etikett Makrophagen 2 h vor Beginn von intravital Bildgebung. </li></ol> 2. Mikroskopaufbau und Imaging Vorbereitung Hinweis: Dieses Verfahren beschreibt den Aufbaufür intravital Bildgebung auf einem Multi Mikroskop 8. <ol><li> Schalten Sie alle Mikroskop und Laser-Komponenten, einschließlich Zwei-Photonen-Laser und Detektoren. </li><li> Schalten Sie den Heizkasten auf 30 ° C auf die Bühne Vorwärmung. Dieser Schritt ist entscheidend für die physiologische Temperatur des Tieres gehalten wird. </li><li> Für den Einsatz auf einem inversen Mikroskop Ort der maßgefertigte Tischeinsatz auf dem Mikroskoptisch. Der Brauch Einsatz ist ein Blatt von 1/8 &quot;dicken Aluminium gefräst in der Tischeinlage Raum zu passen und mit einem Durchmesser von 1&quot; Durchgangsloch in der Mitte für die Bildgebung. <ol><li> Wischen Sie den Mikroskoptisch und Tischeinsatz mit 70% Ethanol und Luft trocknen lassen. </li><li> Platzieren Sie einen großen Tropfen Wasser auf dem 20X, 1,05 NA Mikroskopobjektiv optischen Kontakt mit dem Deckglas zu halten. </li><li> Platz Deckglas (# 1.5 Dicke) über den Imaging-Port auf dem Mikroskoptisch Einsatz. Sichern Sie an Ort und Stelle mit Labor Band. </li><li> Verwenden Sie einen Locher eine 2 cm x 2 cm großes Loch zu stanzenin einer flexiblen Gummiauflage und legen Sie die Gummiauflage auf dem Mikroskoptisch mit dem Loch in der Unterlage mit dem Loch in der benutzerdefinierten Stufe Einsatz ausgerichtet ist. </li></ol></li></ol> 3. Herstellung von Schwanzvenenkatheter und Reagenzien für die Injektion während der Bildgebung <ol><li> Schneiden Sie ein 30 cm Länge von Polyethylen (PE) Rohr. </li><li> Mit einer Pinzette, bewegen Sie die Metallnadel einer 31 G-Nadel hin und her, bis er aus der Kunststoff-Fittings bricht. </li><li> Mit einer Pinzette, legen Sie das stumpfe Ende der abgelösten Nadel in den PE-Schlauch. </li><li> Legen Sie eine 31 G-Nadel in das andere Ende des PE-Schlauch. </li><li> Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und legen Sie sie in den 31 G-Nadel und spülen Sie alle Luft aus dem Schlauch und Nadel mit PBS. PBS für die Aufrechterhaltung der Hydratation verwendet wird und Blut Osmolarität 9,18 jedoch isotonischer Kochsalzlösung kann auch verwendet werden. </li><li> Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit 200 ul 3 mg / kg 155 kDa Dextran-Tetramethylrhodamin (TMR) Oder Quantenpunkte für die vaskuläre Kennzeichnung. </li><li> Bereiten andere injizierbare Proteine ​​wie beispielsweise eine 165 Aminosäure - Isoform des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors A (VEGFA 165) in einer 1 cc Spritze und auf Eis stellen . Injizieren von 0,2 mg / kg VEGFA 165 19 bei einer Konzentration von 0,05 mg / ml. </li></ol> 4. Einsetzen des Verweil Schwanz Venenkatheter <ol><li> Legen Sie das Tier unter Narkose unter Verwendung eines Induktionskammer mit 5% Isofluran mit O 2 als Trägergas. </li><li> Übertragen Sie die Maus auf die chirurgische Plattform, sobald es vollständig betäubt und reagiert nicht auf einer Zehe Prise. </li><li> Offene Isoflurananästhesie Linie auf die chirurgische Plattform, schließen Sie die Anästhesie Leitung an die Induktionskammer und legen Sie den Nasenkegel über das Tier Schnauze. Reduzieren Sie die Isofluran von 5% auf 2,5%. </li><li> Anwenden Augensalbe für die Augen der Maus Trockenheit während der Anästhesie zu verhindern. </li><li> Erhitzen Sie das Tier unter der Heizlampefür weitere 2 min Zirkulation in den Schwanz zu erhöhen, wie verlangsamt Zirkulation mit tiefer Narkose. </li><li> Sterilisieren Sie die Maus Schwanzvene mit 70% Ethanol. </li><li> Legen Sie die Spitze des 31 G-Nadel aus dem in Abschnitt 3 in die seitliche Schwanzvene des Tieres konstruiert Katheter und drücken Sie die Nadel in 2-3 mm. </li><li> Ziehen Sie die Spritze Blut zu sehen, zurück, um den Katheter gewährleistet in die Schwanzvene gelegt wird. </li><li> Verwenden, um eine 1 cm Länge lab Band über der Nadel angeordnet, um die Nadel an Ort und Stelle parallel zu der Vene entlang der Länge des Schwanzes zu halten. </li></ol> 5. Hautlappen chirurgischen Eingriff Expose die Brusttumor <ol><li> Mit dem Tier auf der chirurgischen Plattform Tupfer des Tumors und der ventralen Oberfläche mit 70% Ethanol. Anmerkung: Wie beschrieben, ist dieses Verfahren nicht vollständig aseptischen Bedingungen durchgeführt. Für lange Imaging-Sitzungen, wo Infektion ein Störfaktor werden kann, wird empfohlen, eine aseptische Technik zu verwenden. </li><li> Mit sterile Zange, heben Sie die Bauchhaut und mit einer sterilen Schere eine subkutane Schnitt entlang der ventralen Mittellinie ca. 1 cm Länge. Vermeiden Sie das Peritoneum während der Einschnitt Punktierung. </li><li> Vorsichtig schneiden das Bindegewebe der Brustdrüse und Tumor entfernt vom Peritoneum Anbringen der Brusttumor zu belichten. </li><li> Mit einer Schere und Pinzette vorsichtig entfernen und die Faszien und Fett von der freiliegenden Oberfläche des Tumors unter Beibehaltung der Integrität der Gefäßversorgung des Tumors und die Minimierung von Blutungen wegschneiden. Dieser Schritt ist entscheidend, um die Tumor-Architektur und Gefäßversorgung des Tumors zu halten. </li></ol> 6. Vorbereitung der Tiere für die Mikroskopie <ol><li> Übertragen Sie das Tier auf die vorgewärmten Abbildungsstufe mit dem auf dem Deckglas platziert ausgesetzt Tumor auf der Bühne Einsatz über das Mikroskopobjektiv für die Bildgebung. Achten Sie darauf, die Schwanzvene Katheter sanft mit dem Tier zu übertragen, um nicht die Nadel zu entfernen. </li><li> Platz the Anästhesie Bugspitze über die Schnauze des Tieres Anästhesie Satz auf 3% Isofluran aufrecht zu erhalten. </li><li> Positionieren Sie das Tier so, dass der Tumor in das Loch des Gummikissen ruht und in Kontakt mit dem Deckglas. </li><li> Verwenden Sie zwei Gummi-Pads, um sanft den Tumor in Position zu halten und fixieren Sie diese mit Labor Band an den Mikroskoptisch Bewegung während der Bildaufnahme zu reduzieren. </li><li> Füllen der Kammer aus dem Gummikissen mit PBS, das Gewebe zu halten hydratisiert und optischem Kontakt mit dem Deckglas erhalten. </li><li> Starten Sie das Tier die Überwachung der Vitalfunktionen mit einem Pulsoximeter Sonde. Bringen Sie einen Clip Sensor an den Oberschenkel des Tieres. Alternativ kann eine Manschette, die verwendet werden, um den Hals zu passen kann konfiguriert ist. </li><li> Legen Sie die Heizkasten über das Tier zu halten bei 30 ° C 20. </li><li> reduzieren Sie langsam das Niveau von Isofluran auf 0,5-1% Narkose zu halten und den Blutfluss aufrechtzuerhalten. </li></ol> 7. Bildaufnahme und Injektion von Fluorescent Farbstoffe und injizierbare Proteine <ol><li> Verwendung des Mikroskop-Okular Fokus auf den fluoreszierenden Tumorzellen auf der Oberfläche des Tumors. </li><li> Wählen Sie einen Bereich von Interesse durch Bereiche mit fließenden Blutgefäße zu finden. Die Auswahl eines Bereichs von Interesse mit fließenden Blutgefäße ist entscheidend für die Tumorgefäße zu bewerten. </li><li> Sobald eine Region von Interesse ausgewählt wurde Schalten Sie das Mikroskop in Multibildgebungsmodus. </li><li> Den oberen und unteren Grenzen einer z-Serie. Stellen Sie die obere Grenze der z-Serie durch die Schärfeneinstellvorrichtung mit dem Ziel auf den gewünschten Startposition zu bewegen und auf die Z-Position &quot;Oben&quot; Taste. Bestimmen die Obergrenze der z-Reihe durch die Kollagenfaser-Netzwerk an der Oberfläche des Tumors in der Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) -Kanal Visualisierung und Beobachtung, wenn keine Zellen, aber nur Kollagenfasern sichtbar sind. <ol><li> Stellen Sie die Untergrenze der z-Reihe durch das Ziel auf den gewünschten Abbildungstiefe bewegt (typically 50-150 &amp; mgr; m) und dann auf die Z-Position &quot;Unten&quot; -Taste. </li><li> Stellen Sie die Schrittgröße um den gewünschten Wert in die Schrittgröße Feld eingeben. Bestimmen Schrittgröße basierend auf Überlegungen zur Auflösung und Aufnahmezeit (in der Regel 2 &amp; mgr; m für die hochauflösende 3D-Rekonstruktion verwendet und 5 um auf andere Weise). </li></ol></li><li> Stellen Sie den Zeitraffer-Intervall auf die Time-Lapse-Panel durch Umschalten und Eingabe der gewünschten Ablaufzeit in die Time-Lapse-Feld. Für eine optimale zeitliche Auflösung das Zeitintervall für die kontinuierliche Bildgebung auf 0 sec. Hinweis: Für lange Zeitraffer-Bildgebung ist es empfehlenswert, das Zeitintervall zwischen den Aufnahmen zu 10 Sekunden bis zum Ziel gesetzt, Tauchflüssigkeit aufzufüllen. </li><li> Nachdem die Parameter für die Abbildung bestimmt worden sind, injizieren langsam 155 kDa-Dextran-TMR. <ol><li> Entfernen Sie die Spritze mit PBS in die Schwanzvene Katheter und ersetzen mit der Spritze, die 155 kDa Dextran-TMR kümmert sich keine Blasen in den li vorstellenne. </li><li> injizieren Sie langsam 155 kDa Dextran-TMR in die Maus, mit einem maximalen Volumen von 200 &amp; mgr; l, und ersetzen Sie die Spritze mit der Spritze PBS enthält. Kritischste Schritt: Führen Sie die Injektion langsam und Vorkehrungen treffen, um zu vermeiden Lösung außerhalb der Vene zu bekommen. </li></ol></li><li> Starten Sie den Erwerb der Z-Stack-Zeitraffer-Bildgebung durch einen Klick auf den Z-Stapel und Zeitraffer-Tasten, sie zu drücken und dann auf die Aufnahmetaste klicken. </li><li> Wenn andere fluoreszierende Dextrane, dh 10 kDa - Dextran-Fluorescein - Isothiocyanat (FITC), oder Proteine, dh VEGFA 165 haben im Voraus vorbereitet worden ist , injizieren sie nach dem Beginn der Bildaufnahme für at = 0 min Start. <ol><li> Entfernen Sie die Spritze mit PBS in die Schwanzvene Katheter und ersetzen mit der Spritze , die 10 kDa Dextran-FITC oder VEGFA 165 kümmert sich keine Blasen in die Leitung einzuführen. </li><li> injizieren Sie langsam injizierbaren in die Maus über die Schwanzvene Katheterund ersetzen Sie die Spritze mit einer Spritze mit PBS. </li></ol></li><li> Alle 30-45 min, injizieren langsam 50 ul PBS oder Kochsalzlösung Hydratation des Tieres zu halten. </li></ol> 8. Euthanasie <ol><li> Bei Beendigung der Bildaufnahme, euthanize das Tier. <ol><li> Erhöhen Sie die Isofluran bis 5%. </li><li> Halten Sie das Tier unter 5% Isofluran bis 30 Sekunden, nachdem er aufhört, das Tier von der Bühne zu atmen und zu entfernen. </li><li> Führen Sie Zervikaldislokation vollständige Euthanasie zu gewährleisten. </li></ol></li></ol> 9. Bildverarbeitung <ol><li> Erwerben Sie Bilder in 16-Bit-TIFF-Dateien für jeden einzelnen Kanal zu jedem Zeitpunkt und sparen nacheinander. </li><li> Führen Trennung der spektralen Überlappung (dh GFP und GFP), die Abschaffung der xy Drift und die Erzeugung von Filmen von Zeitraffer-Sequenzen unter Verwendung von etablierten Verfahren in ImageJ 9. Führen Sie 3D - Oberflächenrekonstruktionen von hochauflösenden Bildern 13. </li></ol>

<ol><li>Gerlowski, L. E., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+permeability+of+normal+and+neoplastic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular permeability of normal and neoplastic tissues.</a> Microvasc Res. 31 (3), 288-305 (1986).</li>
<li>Wang, H. -L., Lai, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Evans+blue+quantitation+in+limited+rat+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples.</a> Sci Rep. 4, (2014).</li>
<li>Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rous-Whipple+Award+Lecture.+How+tumors+make+bad+blood+vessels+and+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Rous-Whipple Award Lecture. How tumors make bad blood vessels and stroma.</a> Am J Pathol. 162 (6), 1747-1757 (2003).</li>
<li>Nagy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+properties+of+tumor+surrogate+blood+vessels+induced+by+VEGF-A%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Permeability properties of tumor surrogate blood vessels induced by VEGF-A.</a> Lab Invest. 86 (8), 767-780 (2006).</li>
<li>Egawa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+analysis+of+vascular+permeability+in+mice+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 3, (2013).</li>
<li>Yuan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability+in+a+human+tumor+xenograft%3A+molecular+size+dependence+and+cutoff+size%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cutoff size.</a> Cancer Res. 55 (17), 3752-3756 (1995).</li>
<li>Dellian, M., Yuan, F., Trubetskoy, V. S., Torchilin, V. P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability+in+a+human+tumour+xenograft%3A+molecular+charge+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability in a human tumour xenograft: molecular charge dependence.</a> Br J Cancer. 82 (9), 1513-1518 (2000).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setup+and+use+of+a+two-laser+multiphoton+microscope+for+multichannel+intravital+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging.</a> Nat Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tumor+cell+movement+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Imaging tumor cell movement in vivo.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 19, (2013).</li>
<li>Patsialou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+reveals+multicellular+streaming+as+a+crucial+component+of+in+vivo.+cell+migration+in+human+breast+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo. cell migration in human breast tumors.</a> Intravital. 2 (2), e25294(2013).</li>
<li>Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+classification+links+tumor+microenvironments+with+tumor+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype.</a> PLoS Biol. 12 (11), e1001995(2014).</li>
<li>Roussos, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mena+invasive+%28MenaINV%29+promotes+multicellular+streaming+motility+and+transendothelial+migration+in+a+mouse+model+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer.</a> J Cell Sci. 13, 2120-2131 (2011).</li>
<li>Harney, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Imaging+Reveals+Local%2C+Transient+Vascular+Permeability%2C+and+Tumor+Cell+Intravasation+Stimulated+by+TIE2hi+Macrophage-Derived+VEGFA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA).</a> Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).</li>
<li>Robinson, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+of+metastasis+in+human+breast+carcinoma%3A+a+potential+prognostic+marker+linked+to+hematogenous+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination.</a> Clin Cancer Res. 15, 2433-2441 (2009).</li>
<li>Sasmono, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).</li>
<li>Ovchinnikov, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Gal4-dependent+transgenes+in+cells+of+the+mononuclear+phagocyte+system+labeled+with+enhanced+cyan+fluorescent+protein+using+Csf1r-Gal4VP16%2FUAS-ECFP+double-transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukcocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice.</a> J Leukcocyte Biol. 83 (2), 430-433 (2008).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+from+human+breast+tumors+are+involved+in+spontaneous+metastases+in+orthotopic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).</li>
<li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> J Vis Exp. (73), (2013).</li>
<li>Weis, S., Cui, J., Barnes, L., Cheresh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+barrier+disruption+by+VEGF-mediated+Src+activity+potentiates+tumor+cell+extravasation+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial barrier disruption by VEGF-mediated Src activity potentiates tumor cell extravasation and metastasis.</a> J Cell Biol. 167 (2), 223-229 (2004).</li>
<li>Wyckoff, J., Gligorijevic, B., Entenberg, D., Segall, J., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Multiphoton+Imaging+of+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo.+Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Multiphoton Imaging of Tumors.</a> In Vivo. Cold Spring Harb Protoc. (10), (2011).</li>
<li>Lathia, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+in+vivo.+evidence+for+tumor+propagation+by+glioblastoma+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Direct in vivo. evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells.</a> PLoS One. 6 (9), e24807(2011).</li>
<li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li>
<li>Dreher, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+vascular+permeability%2C+accumulation%2C+and+penetration+of+macromolecular+drug+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers.</a> J Natl Cancer Inst. 98 (5), 335-344 (2006).</li>
<li>Wyckoff, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+macrophage-assisted+tumor+cell+intravasation+in+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors.</a> Cancer Res. 67 (6), 2649-2656 (2007).</li>
<li>Chittajallu, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo.+cell-cycle+profiling+in+xenograft+tumors+by+quantitative+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo. cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy.</a> Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).</li>
<li>Kedrin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).</li>
<li>Yano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial-temporal+FUCCI+imaging+of+each+cell+in+a+tumor+demonstrates+locational+dependence+of+cell+cycle+dynamics+and+chemoresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Spatial-temporal FUCCI imaging of each cell in a tumor demonstrates locational dependence of cell cycle dynamics and chemoresponsiveness.</a> Cell Cycle. 13 (13), 2110-2119 (2014).</li>
<li>Yang, M., Jiang, P., Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+subcellular+multicolor+imaging+of+tumor-host+interaction+and+drug+response+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Whole-body subcellular multicolor imaging of tumor-host interaction and drug response in real time.</a> Cancer Res. 67 (11), 5195-5200 (2007).</li>
<li>Manning, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+reveals+conversion+between+distinct+tumor+vascular+morphologies+and+localized+vascular+response+to+Sunitinib%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging reveals conversion between distinct tumor vascular morphologies and localized vascular response to Sunitinib.</a> Intravital. 2 (1), 24790(2013).</li>
<li>Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+cancer+growth+and+invasion%3A+a+modified+skin-fold+chamber+model%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model.</a> Histochem Cell Biol. 130 (6), 1147-1154 (2008).</li>
<li>Brown, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo.+measurement+of+gene+expression%2C+angiogenesis+and+physiological+function+in+tumors+using+multiphoton+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo. measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy.</a> Nat Med. 7 (7), 864-868 (2001).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Zelluläre Interaktionen, die sich spontan in der Tumor-Mikroumgebung auftreten können, auf Veränderungen in der Tumorzellbeweglichkeit und intravasation führen. Hochauflösende intravital Bildgebung von lebenden Tumorgewebe ermöglicht die Visualisierung von mehrzelligen Dynamik , die hochtransienten 10,13,24 sein kann. End-Punkt in - vivo - Tests oder Zeitraffer-Bilder mit diskreten Zeitpunkten erworben wesentlichen Informationen über die molekularen Mechanismen von Prozessen in der Tumor - M...

Verbreitung von Tumorzellen von der primären Mammatumor wurde nicht nur Tumorzellen gezeigt einzubeziehen, aber Host stromalen Zellen, einschließlich Makrophagen und Endothelzellen. Darüber hinaus ist Tumorgefäße mit einer erhöhten Permeabilität 1 abnormal. Somit bestimmen, wie Tumorzellen, Makrophagen und endothelialen Zellen in Wechselwirkung treten Gefäßpermeabilität und Tumorzell intravasation in dem primären Tumor-Mikroumgebung zu vermitteln, ist wichtig für das Verständnis der Metastasierung. die Kinetik der vaskulären Permeabilität, Tumorzelle intravasation und dem darunterliegenden Signalisierungsmechanismus von mehrzelligen Interaktionen im Tumormikroumgebung zu verstehen, können wichtige Informationen bei der Entwicklung und Verabreichung von Antikrebstherapien bereitzustellen. Die primäre Mittel der Tumor vaskuläre Permeabilität in vivo zu studieren die Messung von extravaskulärem Farbstoffe wie Evans - Blau 2, hochmolekulare Dextrane (155 kDa) wurde3 und Fluorophor oder Radiotracer-konjugierte Proteine ​​(einschließlich Albumin) 4 in festen Zeitpunkten nach der Injektion des Farbstoffes. Fortschritte in der Mikroskopie, Tiermodelle und Fluoreszenzfarbstoffe haben die Visualisierung von zellulären Prozessen und vaskuläre Permeabilität in lebenden Tieren durch Intravitalmikroskopie 5 aktiviert. Live - Tierbildgebung mit dem Erwerb von statischen Bildern oder kurzen Zeitraffer-Sequenzen über mehrere Zeitpunkte nicht für das Verständnis von dynamischen Ereignissen im Tumormikromilieu 6,7 erlauben. Tatsächlich statische Bildaufnahme über den Verlauf von 24 Stunden gezeigt , dass Tumorgefäße undicht jedoch die Dynamik der vaskulären Permeabilität wurde 6 nicht beobachtet. So fängt längere kontinuierliche Zeitraffer-Bildgebung bis zu 12 Stunden, um die Kinetik der dynamischen Ereignissen im Tumormikromilieu. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von erweiterten Zeitraffer multiphotauf Intravitalmikroskopie dynamische vielzelligen Ereignisse in der Tumor-Mikroumgebung zu studieren. Mehrere Zelltypen in der Tumor-Mikroumgebung mit injizierbaren Farbstoffen markiert oder mit transgenen Tieren exprimieren fluoreszierende Proteine ​​verwenden. einen Schwanzvenenkatheter Gefäß Farbstoffe oder Proteine ​​verwendet, kann nach dem Start der Bildgebung injiziert werden kinetischen Daten von mehrzelligen Ereignisse im Tumormikromilieu zu erwerben. Für Live-Cell-Imaging wird die Brusttumor durch die chirurgische Vorbereitung einer Hautlappen ausgesetzt. Bilder werden für bis zu 12 Stunden erworben 8 eine Multiphotonen - Mikroskop ausgestattet mit mehreren Photovervielfacherröhren (PMT) Detektoren. Durch die Verwendung von geeigneten Filtern ermöglicht eine Subtraktion Algorithmus 4 PMT Detektoren 5 Fluoreszenzsignale im Tumormikromilieu zu erwerben gleichzeitig 9. Hochauflösende Multiintravitalmikroskopie erfasst einzelne Zelle auflösende Bildgebung von Tumor-Stroma-Interaktionen im Tumormikromilieu, zu einem besseren führenden uERSTÄNDIGUNG der vaskulären Permeabilität und Tumorzell intravasation 10-13. Insbesondere offenbart verlängerte intravitalAbbildungs ​​stark lokalisierten, transient Gefäßpermeabilität Ereignisse , die selektiv an den Stellen der Interaktion zwischen einer Tumorzelle, einem Makrophagen und einer Endothelzelle (definiert als der Tumor - Mikroumgebung der Metastasierung, TMEM 14) 13 auftreten. Weiterhin tritt Tumorzelle intravasation nur an TMEM und räumlich und zeitlich mit Gefäßpermeabilität 13 korreliert. Einzelne Zell Auflösung der Dynamik dieser Ereignisse wurde möglich durch die Verwendung erweiterter Zeitraffer-Multiphotonen-Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Zellen im Tumormikromilieu.

<table><tbody><tr><td>155 kDa Dextran-Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1287</td><td>rekonstituiert bei 20 mg/ml in 1x PBS</td></tr><tr><td>70 kDa Dextran-Texas Red</td><td>Life Technologies</td><td>D-1830</td><td>rekonstituiert bei 10 mg/ml in 1x PBS</td></tr><tr><td>10 kDa Dextran-Fluorescein-Isothyocyanat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD10S</td><td>rekonstituiert bei 20 mg/ml in 1x PBS</td></tr><tr><td>Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots</td><td>Leben Technologien</td><td>Q21561MP</td><td>Verwässerung 25 &#956; l in 175 &#956; l von 1x PBS zur Injektion</td></tr><tr><td>MMTV-PyMT Mäuse</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2374</td><td></td></tr><tr><td>Csf1r-ECFP Mäuse (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>26051</td><td></td></tr><tr><td>Csf1r-EGFP Mäuse</td><td>Jackson Laboratory</td><td>18549</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoethesia (Isofluran)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>50033</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>AirTech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml Spritze, Tuberkulin-Aufsteckspitze</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>30 G x 1 (0,3 mm x 25&nbsp; mm) Nadel</td><td>BD</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Medizinschlauch aus Polyethylen&nbsp;</td><td>Scientific Commodities Inc</td><td>BB31695-PE/1</td><td>Innendurchmesser 0,28 mm x 0,64 mm Außendurchmesser</td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckglas</td><td>Corning</td><td>2980-225</td><td>Dicke 1,5, 22 x 50&nbsp; mm</td></tr><tr><td>PhysioSuite MouseSTAT Pulsoximeter, Software und Sensoren</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laborband</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>Weichgummiauflage</td><td>McMaster-Carr</td><td>8514K62</td><td>Ultraweiche Polyurethanfolie, 3/16" Dicke, 12" x 12", 40 Oo Durometer, glatte Rückseite</td></tr><tr><td>Hartgummiauflage</td><td>McMaster-Carr</td><td>8568K615</td><td>Hochfeste Neopren-Gummiplatte 1/4" dick, 12" x 12", 50&nbsp; Ein Durometer-Mikroskop</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td></td><td>Das Mikroskop ist ein speziell angefertigtes Zwei-Laser-Multiphotonenmikroskop, das auf einem Olympus IX-71 Stativ basiert und ein 20X 1,05NA Objektiv verwendet.</td></tr><tr><td>7er Lochsatz</td><td>McMaster-Carr</td><td>3429A12</td><td>1/4" auf 1" Lochdurchmesser, für Hammerlocher</td></tr></tbody></table>

erweiterte zeitraffer-intravital imaging von echtzeit-vielzellige dynamics im tumormikromilieu

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In der Tumormikroumgebung interagieren Wirtsstromazellen mit Tumorzellen, um die Tumorprogression, Angiogenese, Tumorzellverbreitung und Metastasierung zu fördern. Multizelluläre Wechselwirkungen in der Mikroumgebung des Tumors können zu vorübergehenden Ereignissen führen, einschließlich der gerichteten Motilität der Tumorzellen und der Gefäßpermeabilität. Bei der Quantifizierung der vaskulären Permeabilität von Tumoren wurden häufig Endpunktexperimente verwendet, um die Extravasation von Gefäßfarbstoffen zu messen. Aufgrund der transienten Natur multizellulärer Wechselwirkungen und der vaskulären Permeabilität kann die Kinetik dieser dynamischen Ereignisse jedoch nicht erkannt werden. Durch die Markierung von Zellen und Gefäßen mit injizierbaren Farbstoffen oder fluoreszierenden Proteinen hat die hochauflösende Intravitalmikroskopie im Zeitraffer die direkte Echtzeit-Visualisierung von vorübergehenden Ereignissen in der Tumormikroumgebung ermöglicht. Hier beschreiben wir eine Methode zur Verwendung von Multiphotonenmikroskopie zur Durchführung einer erweiterten intravitalen Bildgebung in lebenden Mäusen, um die multizelluläre Dynamik in der Tumormikroumgebung direkt sichtbar zu machen. Diese Methode beschreibt zelluläre Markierungsstrategien, die chirurgische Präparation eines Brusthautlappens, die Verabreichung von injizierbaren Farbstoffen oder Proteinen mittels Schwanzvenenkatheter und die Aufnahme von Zeitrafferbildern. Die mit dieser Methode erhaltenen Zeitraffersequenzen erleichtern die Visualisierung und Quantifizierung der Kinetik zellulärer Ereignisse der Motilität und Gefäßpermeabilität in der Tumormikroumgebung.

Erweiterte Zeitraffer-Mikroskopie ermöglicht einzelne intravital Zellauflösende Bildgebung von mehrzelligen Prozesse im Tumormikromilieu. Durch fluoreszenz Markierung von Tumorzellen, Makrophagen, den vaskulären Raum und Visualisieren des Kollagenfasernetzwerk der zweiten Harmonischen Erzeugungssignal, mehrere Kompartimente in der Tumor-Mikroumgebung verwendet werden gleichzeitig während der Bildgebung verfolgt. Tumorzellen mit fluoreszierenden Proteinen markiert können in transgenen Mäu...

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Multiphotonen - Mikroskopie ausgedehnte Zeitraffer-Bildgebung von mehrzelligen Interaktionen in Echtzeit durchzuführen, in vivo auf Einzelzellauflösung.

Erweiterte Zeitraffer-Intravital Imaging von Echtzeit-Vielzellige Dynamics im Tumormikromilieu

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die dynamischen Vorgänge im Tumormikromilieu mittels hochauflösender intravitale Multiphotonenmikroskopie sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zum Tumormikromilieu zu beantworten, beispielsweise welche dynamischen Vorgänge an der vaskulären Permeabilität und an multizellulären Interaktionen beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Kinetik der Vorgänge im Tumormikromilieu beobachtet und gemessen werden kann.Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, schalten Sie alle Mikroskop- und Laserkomponenten ein, einschließlich der Zwei-Photonen-Laser und der Detektoren. Stellen Sie die Heizbox auf 30 Grad Celsius, um die Probehalterung vorzuwärmen. Wischen Sie die Mikroskopstufe und den Stufeneinsatz mit 70 %igem Ethanol ab.Wenn das Objektfeld trocken ist, geben Sie einen großen Tropfen Wasser auf das 25 x 1,05-NA-Mikroskopobjektiv, um den optischen Kontakt mit dem Deckglas aufrechtzuerhalten, und legen Sie ein Deckglas der Dicke Nr. 1,5 über die Einsteck-Abbildungsöffnung. Schneiden Sie anschließend ein 30 Zentimeter langes Stück Polyethylen-Schlauch ab. Legen Sie die Gummipolster auflage auf das Deckglas.Unter Verwendung einer Pinzette brechen Sie eine Nadel mit 31 Gauge von ihrer Kunststoffhalterung ab und führen das abgestumpfte Ende der Nadelhalterung in die Schlauchleitung ein. Führen Sie eine 31-Gauge-Nadel in das andere Ende des PE-Schlauchs ein und befestigen Sie sie. Füllen Sie daraufhin eine Ein-Kubikzentimeter-Spritze mit steriler PBS und verbinden Sie die Spritze mit der 31-Gauge-Nadel. Verwenden Sie PBS, um alle Luft aus der Schlauchleitung und der Nadel herauszuspülen. Befüllen Sie dann eine Ein-Kubikzentimeter-Spritze mit 200 Mikrolitern des geeigneten vaskulären Markers und eine weitere mit dem geeigneten injizierbaren Protein. Vor Beginn der Operation überprüfen Sie die ausreichende Anästhesie durch das Fehlen einer Reaktion auf einen Zehenquetschtest und tragen Augensalbe auf die anästhesierte Maus auf.Als Nächstes stellen Sie das Tier auf eine chirurgische Plattform unter eine Wärmelampe, um die Durchblutung des Schwanzes zu verbessern. Nach zwei Minuten desinfizieren Sie den Schwanz mit 70 %igem Ethanol und führen die Spitze des Katheters mit 31 Gauge zwei bis drei Millimeter in die seitliche Schwanzvene ein. Anschließend befestigen Sie ein ein Zentimeter langes Stück Laborklebeband am Katheter, um die Nadel parallel zur Vene entlang der gesamten Schwanzlänge zu fixieren.Wenn der Katheter befestigt ist, wischen Sie die ventrale und die Tumoroberfläche mit 70 % Ethanol ab. Heben Sie dann die Haut über dem Bauch an und machen Sie mit einer sterilen Schere einen etwa einen Zentimeter langen subkutanen Schnitt entlang der ventralen Mittellinie des Bauches, wobei Sie darauf achten, das Peritoneum nicht zu verletzen. Schneiden Sie vorsichtig das Bindegewebe, das die Brustdrüse und den Tumor mit dem Peritoneum verbindet, durch, um den Tumor freizulegen.Danach mithilfe der Schere und der Pinzette vorsichtig die Faszie und das Fettgewebe von der freigelegten Tumoroberfläche entfernen. Sobald der Tumor freigelegt ist, die Maus auf die vorgewärmte Bildgebungsplattform überführen. Mit Laborband das Deckglas befestigen und anschließend den Tumor in die Aussparung eines Gummipolsters bringen, das das Deckglas über dem Mikroskopobjektiv abdeckt.Wenn sich das Tier in Position befindet, füllen Sie die Kammer des Gummikissens mit PBS, um das Gewebe feucht zu halten und den optischen Kontakt mit der Deckglasabdeckung aufrechtzuerhalten. Bringen Sie einen Puls-Oximeter-Sondenkragen am Hals an, um die Vitalfunktionen des Tieres zu überwachen, und platzieren Sie die Heizbox über dem Tier. Verwenden Sie dann die Mikroskop-IPs, um auf die fluoreszierenden Tumorzellen an der Tumeroberfläche zu fokussieren und einen Bereich mit durchbluteten Blutgefäßen zu lokalisieren.Nachdem ein Bereich von Interesse ausgewählt wurde, schalten Sie das Mikroskop in den Multiphoton-Bildgebungsmodus und verwenden Sie den Fokusregler, um das Objektiv an die gewünschte Startposition zu bewegen. Klicken Sie dann auf die obere Z-Position-Schaltfläche, um die obere Grenze der z-Serie festzulegen, und visualisieren Sie das Kollagenfasernetzwerk an der Tumeroberfläche im Kanal der zweiten harmonischen Generierung. Bewegen Sie anschließend das Objektiv auf die gewünschte Bildtiefe und klicken Sie auf die untere Z-Position-Schaltfläche, um die untere Grenze der z-Serie festzulegen.Geben Sie anschließend den gewünschten Wert in die Felder für die Schrittgröße ein. Wechseln Sie dann zum Zeitraffereinstellungs-Panel und geben Sie die entsprechende Zeitlücke ein. Sobald die Bildaufnahmeparameter festgelegt wurden, ersetzen Sie die an den Katheter angeschlossene Spritze durch eine Spritze mit vaskulärem Markierungsfarbstoff und geben Sie langsam maximal 200 Mikroliter der Farbstofflösung zu, wobei darauf geachtet werden muss, dass die Lösung in die Vene gelangt.Nach der Injektion setzen Sie die PBS-Spritze wieder an den Katheter an und beginnen die z-Schritt-Zeitraffer-Aufnahme. Sobald alle Bilder aufgenommen wurden, ersetzen Sie die PBS-Spritze durch die Spritze, die das injizierbare Protein enthält, und achten Sie darauf, keine Blasen in die Leitung einzubringen. Injizieren Sie dann langsam die Proteinsuspension in die Maus und ersetzen Sie die Spritze anschließend durch eine Spritze, die PBS enthält.Makrophagen können mit fluoreszenzmarkiertem 70-Kilodalton-Dextran verfolgt werden, das sich in den phagozytierenden Mikrophagen anreichert. Durch die Doppelfärbung von Tumorzellen und Mikrophagen lässt sich die direkte Interaktion zwischen diesen beiden Zelltypen in Echtzeit visualisieren. Um Veränderungen in der vaskulären Permeabilität des Tumors sichtbar zu machen, können auch Quantenpunkte verwendet werden, um den vaskulären Raum zu markieren.Da sie groß genug sind, um nicht leicht durch die interarteriellen Räume zu diffundieren. Eine kontinuierliche hochauflösende Bildgebung ermöglicht die Erfassung von Ereignissen der vaskulären Permeabilität sowie die Quantifizierung der Kinetik der Dextran-Extravasation und -Eliminierung. In diesem Beispiel eines Beobachtungsfeldes wird das Maximum der doppelten vaskulären Extravasation zwischen 29 und 34 Minuten beobachtet, wie durch das außervaskuläre TMR-Signal belegt.Das Injizieren zusätzlicher vaskulärer Farbstoffe oder Proteine, um die vaskuläre Durchlässigkeit zu induzieren, kann Einblicke in die Signalereignisse gewähren, die die vaskuläre Durchlässigkeit regulieren. Tatsächlich kann man innerhalb der ersten Sekunden nach der Injektion beobachten, wie 10 Kilodalton Dextran-FITC aus dem Gefäßsystem austritt, während das 155 Kilodalton große Dextran-TMR im vaskulären Raum verbleibt. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb einer Stunde abgeschlossen werden.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, das Bindegewebe vorsichtig zu entfernen, ohne die Oberfläche des Tumors zu beschädigen, und die Tumoroberfläche feucht zu halten. Mit dieser Methode zur Untersuchung zellulärer Dynamik kann die Migration von Tumorzellen sichtbar gemacht werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der Richtung der Tumorzellmigration und der Intravasation zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie dynamische zelluläre Vorgänge im Tumormikromilieu mittels intravitale Multiphotonen-Mikroskopie visualisiert werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Wir präsentieren einen neuartigen Ansatz zur Nanopartikel-Lokalisierung in das Gefäßsystem des menschlichen xenotransplantiert Tumoren mittels dynamischer Echtzeit-Intravitalmikroskopie Bildgebung in einem Vogelembryo Modell zu quantifizieren.

Evaluation von Nanopartikel-Aufnahme in Tumoren in Echtzeit über Intravital Imaging

Wir beschreiben ein Verfahren zur Abbildung als Reaktion auf...

Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

Die extrazelluläre Matrix unterliegt erheblichen Umbau während der Wundheilung, Entzündung und Tumorgenese. Wir präsentieren einen neuartigen Ansatz Intravital-Immunfluoreszenz-Mikroskopie, die Dynamik der Fibrillen sowie netzartige Matrix-Komponenten mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung mit Epi-Fluoreszenz-oder Zwei-Photonen-Mikroskopie visualisieren.

Langzeit-Intravitalimmunfluoreszenz-Imaging von Gewebematrix Bestandteile mit Epifluoreszenz und Zwei-Photonen-Mikroskopie

Wir beschreiben ein relativ einfaches Verfahren zur ex vivo Echtzeit-Bildgebung der Tumorzell Stroma Wechselwirkungen innerhalb Lungenmetastasen unter Verwendung fluoreszierenden Reportern in Mäusen. Verwendung von Spinnplatten konfokale Mikroskopie, ermöglicht diese Technik Visualisierung von lebenden Zellen für mindestens 4 h und angepasst werden könnten andere entzündliche Lungenerkrankungen zu untersuchen.

Ex-vivo-Live-Imaging von Lungenmetastasen und deren Mikromilieu

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Multiphotonenmikroskopie zur Durchführung einer langfristigen hochauflösenden Einzelzellbildgebung der intakten Lunge in Echtzeit unter Verwendung eines vakuumstabilisierten Bildgebungsfensters.

Langfristige High-Resolution Intravitalmikroskopie in der Lunge mit einem Vakuum-Stabilisierte Imaging-Fenster

Dieses Protokoll beschreibt die intravitalen Bildgebung von transgenen Mäusen zellspezifische fluoreszierenden Marker zum Ausdruck zu bringen. Intravitalen Bildgebung stellt eine nicht-invasive Methode für hochauflösende Beobachtungen an lebenden Tieren mit implantierbaren Windows durch die mikroskopische Visualisierung von Prozessen möglich ist. Diese Methode ist besonders nützlich, um längs Prozesse zu studieren.

Intravitalen Mikroskopie von Tumor-assoziierten Gefäßsystem mit erweiterten dorsalen Hautfalte Fenster Kammern an transgenen Mäusen fluoreszierende

Hier beschreiben wir eine Methode zur hochauflösenden Zeitraffer-Multiphotonen-Bildgebung von Hirntumorzellen vor und nach invasiven chirurgischen Eingriffen (z.B. Biopsie) innerhalb desselben lebenden Tieres. Diese Methode ermöglicht es, die Auswirkungen dieser invasiven chirurgischen Eingriffe auf das wandernde, invasive und proliferative Verhalten von Tumorzellen auf einer einzelnen Zellebene zu untersuchen.

Längsschnitt-Intravital-Bildgebung des Hirntumorzellverhaltens als Reaktion auf eine invasive chirurgische Biopsie

Wir beschreiben zwei Methoden zur Beurteilung der transienten vaskulären Permeabilität im Zusammenhang mit der Tumormikroumgebung der Metastasenfunktion (TMEM) und der Krebszellintravasation unter intravenöser Injektion von hochmolekularem Dextran (155 kDa) bei Mäusen. Die Methoden umfassen intravitale Bildgebung bei lebenden Tieren und feste Gewebeanalyse mittels Immunfluoreszenz.

Beurteilung der Tumormikroumgebung von Metastasierung Doorway-Vermittelte Vaskuläre Durchlässigkeit im Zusammenhang mit der Krebszellverbreitung mit Intravital Imaging und Fixed Tissue Analysis

Wir beschreiben eine Methode zur Visualisierung von GFP-markierten IELs mit intravitaler Bildgebung des murinen Dünndarms durch invertierte Konfokalmikroskopie der Spinnscheibe. Diese Technik ermöglicht die Verfolgung von lebenden Zellen innerhalb der Schleimhaut für bis zu 4 h und kann verwendet werden, um eine Vielzahl von darmen immun-epitheliale Wechselwirkungen zu untersuchen.

Intravitale Bildgebung von intraepitheliale Lymphozyten im murinen Dünndarm

Die Rekrutierung von Leukozyten und Blutplättchen stellt eine wesentliche Komponente dar, die für das effektive Wachstum von Kollateralarterien während der Arteriogenese notwendig ist. Die Multiphotonenmikroskopie ist ein effizientes Werkzeug zur Verfolgung der Zelldynamik mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in vivo und geringerer Phototoxizität, um die Rekrutierung und Extravasation von Leukozyten während der Arteriogenese zu untersuchen.

Multiphotonen-Intravital-Bildgebung zur Überwachung der Leukozytenrekrutierung während der Arteriogenese in einem murinen Hintergliedmaßenmodell

Das hier beschriebene intravitale Bildgebungsverfahren nutzt die zweite harmonische Kollagenerzeugung und die endogene Fluoreszenz aus dem metabolischen Co-Faktor NAD(P)H, um eine nicht markierte Tumormikroumgebung nicht-invasiv in Tumor-, Stroma- und Gefäßkompartimente für eine eingehende Analyse von intravitalen 4D-Bildern zu segmentieren.

Ein markierungsfreier Segmentierungsansatz für die intravitale Bildgebung von Brusttumor-Mikroumgebungen

Erfahren Sie die erweiterte Zeitraffer-Intravital-Mikroskopie zur Visualisierung dynamischer Ereignisse im Tumormikromilieu in Echtzeit. Diese Methode ermöglicht die Messung von Vaskulärpermeabilität und multizellulären Interaktionen mit hoher Auflösung.

Erweiterte Zeitraffer-Intravital Imaging von Echtzeit-Vielzellige Dynamics im Tumormikromilieu

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