Forming Gigantismus Polymersome Mit Gel-unterstützte Rehydrierung

Das übergeordnete Ziel dieser gelgestützten Rehydrationsmethode ist es, intakte unilamellare Riesen-Polymervesikel robust zu bilden, in denen die Vesikelgrößenverteilung leicht kontrolliert werden kann. Diese Methode bietet eine robuste Alternative für die Bildung von Polymervesikeln, mit denen die physikalischen Eigenschaften der Membran untersucht und diese Vesikel dann in biotechnologische Anwendungen integriert werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, Hunderte von intakten riesigen Polymervesikeln viel schneller und weniger arbeitsintensiv als herkömmliche Techniken herzustellen.

Die Idee dazu entstand, als wir von der gelgestützten Rehydrationstechnik zur Bildung riesiger Lipidvesikel erfuhren. Unsere derzeitigen Methoden zur Bildung riesiger Polymersomen sind jedoch anspruchsvoll und oft ergiebig, daher haben wir uns entschieden, diese Methode als alternativen Ansatz zu verwenden. Beginnen Sie die Herstellung der Polymerlösung, indem Sie fünf Milligramm PEO-PBD-Diblock-Copolymer in einem Milliliter Chloroform in einem Glasfläschchen schwenken, bis es sich vollständig aufgelöst hat.

Eine Lösung von fünf Milligramm pro Milliliter aus Polymer und Chloroform und eine Lösung von einem Milligramm pro Milliliter aus fluoreszenzmarkiertem Lipid und Chloroform wird in eine neue Durchstechflasche gegeben, bis eine Endkonzentration von 99,5 Molprozent Polymer und 0,5 % Lipid erreicht ist. Um die Verdunstung zu minimieren, geben Sie die Polymerlösung in ein luftdichtes Fläschchen mit chloroformbeständigem Deckel und lagern Sie es für die spätere Verwendung bei 20 Grad Celsius. Um mit der Vorbereitung des Agarosefilms zu beginnen, geben Sie 50 Milliliter Wasser und 0,5 Gramm Standard-Agarose in einen 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben

Eine Minute lang in der Mikrowelle kochen lassen. Bevor Sie fortfahren, kühlen Sie die Agaroselösung auf 65 bis 75 Grad Celsius ab, um eine schlechte Haftung oder Verklumpung zu vermeiden. Schneiden Sie als Nächstes das Ende einer 1000-Mikroliter-Pipettenspitze ab und pipettieren Sie damit 300 Mikroliter der Agaroselösung auf einen quadratischen 25-Milliliter-Glasdeckglas.

Halten Sie mit Handschuhen den Rand des Deckglases fest und verteilen Sie die Agarose mit der langen Kante einer weiteren 1000-Mikroliter-Pipettenspitze gleichmäßig über die gesamte Fläche. Legen Sie das Deckglas mit der Agarose-Seite nach oben auf den Parafilm und inkubieren Sie ihn mindestens eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Fahren Sie fort, indem Sie 30 Mikroliter der zuvor vorbereiteten Polymerlösung auf den mit Agarosefilm beschichteten Deckglas pipettieren.

Halten Sie die Eindeckkante mit den behandschuhten Fingern fest und verteilen Sie die Polymerlösung in kreisenden Bewegungen mit der langen Kante einer 18-Gauge-Nadel auf dem Agarosefilm. Legen Sie zum Schluss das Deckglas mit der Polymerseite nach oben in eine Petrischale aus Kunststoff in einem Vakuumexsikator. Evakuieren Sie den Exsikkator für mindestens eine Stunde, um Lösungsmittelreste zu entfernen.

Um Polymersomen zu bilden, kleben Sie zunächst eine Abdeckung gut auf die Polymerseite des beschichteten Deckglases, indem Sie leicht drücken, bis eine dichte Versiegelung gebildet ist. Geben Sie dann 200 bis 500 Mikroliter Rehydrationslösung in die Kammer. Legen Sie als Nächstes ein nass gerolltes Labortuch entlang der Innenkante einer Petrischale aus Glas, um eine Feuchtigkeitskammer zu bilden.

Legen Sie das Deckglas mit dem aufgeklebten Deckel gut in die Form und decken Sie es mit einem Deckel ab. Decken Sie die Petrischale mit Folie ab, um das Ausbleichen der Fotografie zu minimieren, und stellen Sie sie dann mindestens 30 Minuten lang bei 40 Grad Celsius auf eine heiße Platte, um die Polymersomenbildung abzuschließen. Um mit der FRAP-Bildgebung zu beginnen, legen Sie das Deckglas mit der aufgeklebten Abdeckung auf den Tisch eines inversen Fluoreszenzmikroskops, das mit einem verstellbaren Kondensor ausgestattet ist.

Wählen Sie als Nächstes ein Filterset basierend auf dem verwendeten fluoreszierenden Lipid aus und bilden Sie die Polymersomen auf der Oberseite des Deckglases mit einem 100X-Ölobjektiv ab. Um die Membranfluidität mit FRAP zu charakterisieren, fokussieren Sie sich zuerst auf ein Polymersom, schließen Sie dann den Mikroskopkondensor auf eine kleine Apertur und stellen Sie sicher, dass die Ränder des Polymersoms innerhalb des Bildfeldes liegen. Erhöhen Sie anschließend die Belichtung der Kamera, entfernen Sie alle Neutraldichtefilter und lassen Sie den interessierenden Bereich 30 bis 60 Sekunden lang ausbleichen.

Schalten Sie abschließend die Lampe aus und öffnen Sie den Kondensator vollständig. Verringern Sie die Belichtung auf die Starteinstellungen und nehmen Sie drei Minuten lang alle 30 Sekunden Bilder auf. Öffnen Sie die Bildanalysesoftware auf dem Computer des Mikroskops und laden Sie die aufgenommenen Bilder der Polymersomen.

Legen Sie die Skala für die Messung fest, indem Sie das Dropdown-Menü "Analysieren" öffnen und die Option "Skala festlegen" auswählen. Geben Sie die entsprechenden Kalibriereinheiten für den Abstand in Pixel, den bekannten Abstand und die Längeneinheit ein und wählen Sie dann OK. Verwenden Sie als Nächstes die Linien-Toolbox und zeichnen Sie eine Linie, die sich über den Durchmesser eines ausgewählten Polymersoms erstreckt.

Messen Sie den Durchmesser des Polymersoms, indem Sie das Dropdown-Menü Analysieren öffnen und Messen auswählen. Um die Analyse zu erleichtern, verwenden Sie Strg plus D, um die Messlinie auf das Bild zu drucken, bevor Sie zum nächsten Polymersom wechseln. Fahren Sie mit der Messung von Polymersomen mit dem obigen Verfahren fort und fügen Sie jede Messung zum Datenfenster hinzu, bis sie abgeschlossen ist.

Speichern Sie abschließend die Daten, indem Sie auf Datei und Speichern unter klicken.Klicken Sie im sich öffnenden Fenster auf Speichern und öffnen Sie dann die Ergebnisdatei als Tabelle, um die Daten zu analysieren. Polymersomen, die aus PEO-PBD-Polymerfilmen gebildet wurden, die mit verschiedenen Puffern rehydriert wurden, wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie abgebildet. Die Bilder zeigen, dass die Polymersomen unter den verschiedenen Rehydratisierungsbedingungen inhomogen sind, wobei der Durchmesser typischerweise unter 10 Mikrometern liegt.

Epifluoreszenzbilder von Polymersomen, die in Wasser bei unterschiedlichen Temperaturen gebildet wurden, zeigen, dass mit steigender Rehydrationstemperatur größere Polymersomen gebildet werden. Es wurden die durchschnittlichen Durchmesser von mehr als 100 Polymersomen berechnet, die in Wasser bei unterschiedlichen Rehydratisierungstemperaturen gebildet wurden. Bei 24 Grad Celsius betrug der durchschnittliche Durchmesser 2,93 Mikrometer und stieg bei 70 Grad Celsius auf 14,04 Mikrometer an.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Polymersomen immer in Lösung zu halten. Stellen Sie sicher, dass die Abdeckmulde sicher mit dem Deckglas verbunden ist, um ein Auslaufen der Rehydrationslösung und ein Austrocknen der Polymersomen zu vermeiden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können Methoden wie die Elektronenmikroskopie verwendet werden, um zusätzliche strukturelle Eigenschaften der Polymersomen zu verstehen. Diese Technik ebnet den Weg für die Forschung in der synthetischen Biologie und im Bioingenieurwesen, um Polymersomen als robuste, chemisch anpassbare Alternative zu Lipidmembranen für die Forschung und die abiotisch-biotische Grenzfläche, die Arzneimittelverabreichungsforschung und Protozellsysteme zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mit gelgestützter Rehydratisierung robuste Riesenpolymersomen bildet, die Gesamtgröße der Vesikel abstimmt und ihre Membranintegrität charakterisiert.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Chloroform oder der Agarose und den Nadeln gefährlich sein kann. Seien Sie genau vorsichtig, während Sie diese Verfahren durchführen. Treffen Sie Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. das Arbeiten in einem Abzug, und tragen Sie immer eine Schutzbrille und Handschuhe.