Name: Die Förderung der 3-D-Aggregation von FACS Purified Thymusepithelzellen mit EAK 16-II / EAKIIH6 Selbstaufbau Hydrogels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Erfahren Sie die 3-D-Aggregation von Thymusepithelzellen mit EAK16-II/EAKIIH6-Selbstaufbau-Hydrogelen. Diese Methode unterstützt die Zellüberlebensfähigkeit und ermöglicht Anwendungen in der Thymus-Bioengineering-Forschung.

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Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Institutes of Health gewährt R21 AI113000 (WSM) und R01 AI123392 (YF) unterstützt.

Alle Tiere in den Experimenten verwendet wurden in der Tierhaltung bei Allegheny-Singer Research Institute im Rahmen des Protokolls überprüft und genehmigt von der Institutional Animal Care und Use Committee des Allegheny Health Network / Allegheny Singer Research Institute untergebracht. 1. Verdauen des Thymus mit Kollagenase <ol><li> Ernte Thymusdrüse. <ol><li> Euthanize 3-5 Wochen alte C57BL6 / J - Mäusen in einem Kohlendioxid (CO 2) Kammer Thymusdrüse zu ernten. Im Einzelnen stellen die Mäuse in der Kammer unter CO 2 Induktion für 3-5 min und Tod bestätigen durch Herz- oder Atemstillstand zu überprüfen. </li><li> Legen Sie die Karkasse auf den Rücken und nass, den Körper mit 70% Ethanol. Machen Sie einen kleinen horizontalen Schnitt mit einem scharfen, geraden Präparierscheren auf seinem Bauch durch die Haut. Ziehen Sie die Haut an beiden Enden (Kopf und Beine), so dass es von innen nach außen gedreht wird. </li><li> Machen Sie einen horizontalen Schnitt mit den Dissektionsscheren knappdie niedrigste Rippe und seitlich durch die Membran geschnitten. Halten Sie die Xiphoidbasis mit einer Pinzette und schneiden Sie die Mitte der Rippen auf beiden Seiten ausgehend nach oben. Ziehen Sie die Rippen / Brustbein nach oben, so dass der Thymus deutlich sichtbar ist. Hinweis: Thymus direkt auf der Oberseite des Herzens liegt, besteht aus zwei Lappen und einer weißen durchscheinenden Farbe. </li><li> Unter Verwendung einer gebogenen Pinzette vorsichtig schöpfen und die Thymus Lappen weg von dem Bindegewebe und den Transfer in Waschlösung ziehen (siehe Materialliste). </li></ol></li><li> Vorbereitung Aufschlußlösung durch Mischen von 9 ml RPMI-1640 (Rpmi-1640), 0,025 mg / ml gereinigter Kollagenase, 10 mM HEPES [4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure] und 0,2 mg / ml DNase I in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen. Halten Sie die Aufschlusslösung in 37 ° C warmen Wasserbad bis zur Verwendung. Anmerkung: Die Menge der Aufschlußlösung ausreichend vorbereitet ist für bis zu fünf erwachsenen Maus Thymi, die zusammen Polystyrol rund- in einem 5 ml inkubiert werden können,Unterrohr. </li><li> Übertragen Sie die Thymusdrüse zu einer 60 mm-Gewebekulturschale mit 5-6 ml RPMI-1640. </li><li> Präparieren Sie die Thymusdrüse mit 28 G Insulinspritze Nadel in kleine Stücke (ca. 1 mm 3 Quadrat) die Lymphozyten zu lassen abfließen. </li><li> Spülen Sie die Thymus-Stücke mit RPMI-1640, das mit Glas Pasteur Pipette in der Petrischale ist. Kippen Sie die Schüssel und lassen Sie die Thymus-Fragmente am Boden absetzen. Langsam ansaugen und das RPMI-1640-Überstandes mit einer Glaspipette zu verwerfen. Wiederholen Sie diesen Spülschritt mit 5-6 ml RPMI-1640 für 4-5 mal mit Glaspipette, bis die Lösung weniger undurchsichtig ist. Hinweis: Glaspipetten werden bei diesem Schritt zu empfehlen, da Thymus-Fragmente zu Kunststoff Verkleben neigen, was zu einem übermäßigen Verlust von Thymus-Gewebe. Für den Rest des Verfahrens, verwenden Sie Plastikpipetten. </li><li> Nach dem letzten Spülgang, den Überstand verwerfen, wie in Schritt 1.5 beschrieben. 3 ml Aufschlusslösung und übertragen Sie die Thymusdrüse Stücke und die Lösung in einen 5 ml Rundboden-polystyrene Rohr. </li><li> Das Röhrchen wird auf einem Rohr Rotator und inkubieren bei 37 ° C für 6 min bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 12 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Nach der Inkubation ließ die Thymus-Fragmente auf den Boden des Rohres durch die Schwerkraft absetzen. Sammeln Sie den Überstand mit Pasteur-Pipette und Überführung in eine 50 ml-Zentrifugenröhrchen mit 10 ml Waschlösung. Zentrifuge bei 300 g für 5 min den Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 10 ml Waschlösung. Halten Sie sich auf dem Eis. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,6-1,8 zweimal auf den Thymus-Fragmente in den 5 ml Rundboden-Polystyrolröhrchen. Pool den Überstand in der gleichen 50-ml-Tube. Anmerkung: Die Zentrifugation nicht notwendig, für die zweite und die dritte Waschung. </li><li> Nach der endgültigen Verdauung, pipettieren nach oben und unten mit 2 ml Kunststoff serologischen Pipette auf die Zentrifugenröhrchen 50 ml alle verbleibenden Fragmente in der Röhre und den Transfer zu brechen. </li><li> Zentrifuge das 50 ml-Röhrchen bei 300 xg für 5 min, Überstand absaugen, Resuspendieren in 10 ml Wasch buffer und filtriert durch 100 &amp; mgr; m Zellsieb. Halten Sie sich auf dem Eis. </li></ol> 2. Anreicherung von TECs mit unstetigen Dichtegradienten <ol><li> Vorbereitung 21% Dichtegradient-Lösung von 2,4 ml Dichtegradientenmedium Mischen (60% w / v von Iodixanol in Wasser) und 9,6 ml Waschlösung. </li><li> Zentrifugieren Sie die dissoziierten Thymus-Zellen in der 50 ml Sammelröhrchen aus Schritt 1.11 bei 300 g für 5 min und Resuspendieren in 2,5 ml Waschpuffer. </li><li> 20 ml RPMI-1640-Medium zu der Zellsuspension. </li><li> Füllen 12 ml 21% Dichtegradient-Lösung in einem 10 ml serologische Pipette mit einer elektronischen Pipettiervorrichtung. Die Spitze der serologischen Pipette am Boden der 50-ml-Zentrifugenröhrchen, das Zellen und ermöglichen der Dichtegradient-Lösung auf den Boden des Rohres durch Schwerkraft zu entleeren. <ol><li> Sanft auszustoßen, die zwei Schichten unterschiedlicher Dichte zu beenden die Dichtegradientenlösung aus der Pipette zu erzeugen. </li></ol></li><li> Zentrifuge bei 600 xg for 20 min bei RT in einem Schwenkbecherrotor. Stellen Sie die Verzögerungsrate am langsamsten Niveau. </li><li> Übertragen Sie die obere Schicht und die Schnittstelle zu einem neuen 50-ml-Tube. Hinweis: Die meisten der TECs sind in der Schnittstelle beibehalten. Lymphozyten werden dem Boden des Röhrchens nach der Zentrifugation auszufällen. Wenn diese Zellen für andere Zwecke verwendet werden sollen, spült das Pellet mit 20 ml Waschlösung dreimal. Resuspendieren der Zellen in 10 ml Waschpuffer. </li><li> Hinzufügen Waschlösung in das Röhrchen zu 40 ml bis in Schritt 2.6 und Zentrifuge bei 400 × g für 6 Minuten bei 4 ° C. Zu dem Überstand absaugen mit einer Pipette entfernen. </li><li> Wiederholen Sie das Waschen und die Streben 2 weitere Male, wie in Schritt 2.7 beschrieben. </li><li> Resuspension in 2 ml Waschlösung und der Zellen mit einem Hämozytometer zählen. </li></ol> 3. Isolierkanne TECs mit FACS <ol><li> Einstellen Zellen aus Schritt 2.9 in der Konzentration von 1x10 6 Zellen / 100 &amp; mgr; l mit Waschlösung und Transferdie Zellen in einem 5 ml-Rundbodenrohr (Polypropylen oder Polystyrol, wie durch die Anweisungen des Flusssortierer empfohlen). </li><li> Fügen Sie 2 &amp; mgr; l anti-Fc - Rezeptor - IgG pro 1x10 6 Zellen und Inkubieren bei 4 ° C für 10 min. </li><li> Hinzufügen anti-CD45 (1: 150 Verdünnung, 10 ul pro Probe) und anti-EpCAM (1: 100-Verdünnung, 10 ul pro Probe) Antikörper und Inkubieren bei 4 ° C für mehr als 20 min. </li><li> Waschen der Zellen mit 2 ml Waschlösung und Zentrifugation bei 400 × g für 6 Minuten bei 4 ° C. Saugen Sie den Überstand mit einer Pipette. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 1 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Man filtriert durch 100 &amp; mgr; m Sieb. </li><li> Anwenden, um die Zellen auf die Sortieranlage. Wählen Sie die Lymphozyten und TEC Bevölkerung mit Ausnahme der kleinsten Zellen auf Seitenstreulicht (SSC) / Vorwärtsstreulicht (FSC) Platte (tote Zellen), dann Tor auf der ausgewählten Population für CD45- EpCAM + 13 Sortierung. </li></ol> 4. Generation von TEC / EAK Aggregates Hinweis: Führen Sie Reagenzzubereitung und Schritten Zelle unter der laminaren Haube zu mischen. <ol><li> Bereiten pA / G Adaptor-Komplexe durch Mischen von 4 &amp; mgr; l anti-His-Tag-IgG, 8 &amp; mgr; l anti-EpCAM IgG und 2,6 ul pA / G in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, und Inkubation für 5 min bei RT. </li><li> Passen Sie die sortiert TECs aus Schritt 3,7 bis 5x10 4 Zellen / ml mit Waschlösung, und pipettieren 100 &amp; mgr; l zu einer Vertiefung einer niedrigen Verdampfungs, 96-Well - Rundboden - Gewebekulturplatte. Hinzufügen 14,6 ul pA / G Adaptor-Komplexe zu den Zellen. Legen Sie die Platte auf einer Schwingplattform für 20 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie einmal mit 200 &amp; mgr; l Waschlösung. Zentrifugieren Sie die Platte bei 400 × g für 6 min. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Mikropipette. </li><li> Wasche einmal mit 200 ul 10% igen Saccharoselösung. Zentrifuge bei 400 × g für 6 min. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Mikropipette. </li><li> Resuspendiere Zellen in 30 &amp; mgr; l 10% sterile Saccharoselösung pro Vertiefung. </li><li> Fügen Sie 10 &amp; mgr; l EAKIIH6 (7,5 mg / ml) und Inkubation für 5 min bei RT. </li><li> Geben Sie 20 &amp; mgr; l EAK16-II (10 mg / ml) zu der Mischung TEC. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l vollständigem Medium in das System Gelbildung einzuleiten. Legen Sie die Platte auf einem Plattformschüttler für 15-20 min bei RT. </li><li> Die Platte wird in den Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. Nach 2-4 Stunden, fügen Sie weitere 100 &amp; mgr; l Vollmedium. </li><li> Ändern Medium jeden zweiten Tag bis zum Gebrauch. <ol><li> Absaugen 100 ul des Mediums von der Oberfläche, ohne das Gel zu stören mit einer Mikropipette und fügen Sie vorsichtig 100 ul vorgewärmte Medium durch die Pipettenspitze an der Wand des Bohrlochs platzieren. </li></ol></li></ol> 5. Charakterisierung der TEC / EAK Aggregates <ol><li> Um die Funktion der TEC / EAK - Aggregate in vivo zu untersuchen, sammeln die TEC / EAK - Hydrogel nach O / N - Kultur und Transplantation unter die Nierenkapsel einer athymischen NacktMaus unter Verwendung von zuvor Prozedur 11,14 beschrieben. </li><li> Überwachen Sie die Entwicklung von T-Zellen in der Peripherie durch Ernten 50-100 ul Blutproben in EDTA-enthaltenden Blutentnahmeröhrchen aus dem nackten Mäusen 4-6 Wochen nach der Transplantation und Flecken mit einem Cocktail aus anti-CD4, -CD8, -CD45 und -CD3 Antikörper 12. </li><li> Analysieren die Prozentsätze von T-Lymphozyten in den peripheren Blutleukozyten mit Durchflusszytometrie (FCM), unter Verwendung von Einzelzellanalyse - Software 12. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Während TECs die vorherrschende Bevölkerung der Thymus-Stroma und spielen eine entscheidende Rolle für die Struktur und Funktion der Thymusdrüse sind, repräsentieren sie nur etwa 0,1-0,5% des gesamten Thymus Zellularität. Sie sind auch zerbrechlich Zellen als hohe Anteile an Zelltod werden gelegentlich folgenden Kollagenaseverdau beobachtet, dh die Behandlung TECs aus der extrazellulären Matrix (ECM) zu dissoziieren. Ihre Seltenheit (~ 200.000 pro Maus Thymus) und Zerbrechlichkeit machte es eine anspruchsvolle ...

Der Thymus ist die primäre lymphoiden Organ für die Erzeugung einer vielfältigen Population von pathogen-reaktives, selbst tolerant T-Zellen, die für die Funktion des erworbenen Immunsystems wesentlich ist. Es ist ein dynamisches Organ, in dem die Entwicklung Thymozyten aus dem Knochenmark als Lymphozyten-Vorläuferzellen immigrierte, wandern durch die schwammartige dreidimensionale (3-D) Matrix des Thymus-Stroma, durchlaufen abstammungs Spezifizierung und Differenzierung, und schließlich auswandern als reifen T-Zellen. Der Erfolg dieses gut programmiert Verfahren hängt weitgehend von der Kreuzkopplung zwischen den wandernden Thymozyten und den Wohn Thymus-Epithelzellen (TECs), die vorherrschende Bevölkerung des Thymus-Stroma, die für die Einrichtung und Aufrechterhaltung der Integrität des Thymus Mikroumgebung wesentlich sind. Auf der Grundlage ihrer anatomischen Lage und einzigartige Funktion kann TECs in zwei Untergruppen unterteilt werden: die TECs in der Hirnrinde (CTEC), die Verant sindwortlich Selbst MHC (Major Histocompatibility Complex) beschränkt T-Zellen (positive Auswahl) und die TECs in der Medulla (mTEZ) , die zur Eliminierung autoreaktiver T-Zellen wesentlich sind (negative Selektion) 1,2 für die Auswahl. Viele Faktoren (zB Alterung, Infektion, Bestrahlung, medikamentöse Behandlungen) können irreversible Schäden an der Thymus - Epithel führen, in kompromittierten adaptive Immunität führt. Trotz zahlreicher Versuche hat die Thymusfunktion Wiederherstellung herausfordernd aufgrund der Schwierigkeit, den Thymus-Mikroumgebung zu reproduzieren. Bemerkenswerterweise ist thymic dreidimensionale (3-D) -Konfiguration entscheidend für das Überleben und die Funktion von TECs, während TECs kultiviert in einem 2-D - Umgebung schnell die Expression von Genen kritisch für Thymopoese 3,4 verringern. EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) und dessen C-terminale histidinylated analogen EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) sind niedermolekulare, amphiphile Oligopeptide, die in deionisiertem gegen Ende der löslichenr, sondern gehen Gelieren β-Fibrillen zu bilden, wenn sie Ionenstärke von mehr als 20 mM NaCl (normale Salzkonzentration in der menschlichen Körperflüssigkeit beträgt 154 mM) ausgesetzt. Diese Umwelt reagierende Eigenschaft macht sie vielseitige Bausteine ​​3D-Strukturen zu bilden. Das His-Tag auf EAKII-H6 ein Andockmechanismus, durch welche die anti-His IgGs / Fc-bindenden rekombinantes Protein A / G (αH6: pA / G) -Komplexen als Adapter dienen können Proteinwirkstoffen und anderen Biomolekülen zu verankern ( zB Antikörper) auf dem Hydrogelverbundstoff 5-8. Wir haben zuvor gezeigt , daß 9 bis zu 13 Tage an der Injektionsstelle fluoreszenzmarkierte IgG - Moleküle auf dem Hydrogel verankert können beibehalten werden. Wenn ferner die αH6: pA / G Adapter verankert mit anti-CD4 IgGs an das Hydrogel EAK16-II / EAKIIH6 (EAK) hinzugefügt wurden, wurden CD4 + T - Zellen spezifisch 10 eingefangen. Unter Verwendung ähnlicher Technik haben wir vor kurzem gezeigt, dass 3-D-Aggregation von TECs c(: PA / G: αEpCAM αH6) Ould mit Adapter Komplexe tragen TEC-spezifische anti-EpCAM-Antikörper in EAK Hydrogel gefördert werden. Wenn unterhalb der Nierenkapseln von nackten Mäusen transplantiert, können die TEC - Cluster in EAK Hydrogel eingebettet effektiv die Entwicklung von funktionellen T - Zellen in vivo 11,12 unterstützen. Hier veranschaulichen wir unser Verfahren, um schnell und effektiv reinigen TECs mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) und Erzeugen 3-D TEC Aggregate mit dem EAK Hydrogelsystem.

<table><tbody><tr><td>TEC Isolation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701(1 Gallone)</td><td>Ethanol 200 Proof, deionisiertes Wasser</td></tr><tr><td>Präparierschere, gerade</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Zange, gerade</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>11053-10</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Pinzette, gebogen</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Waschlösung</td><td></td><td></td><td>1x PBS, 0,1% BSA, 2&nbsp; mM EDTA</td></tr><tr><td>1x PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Rinderserumalbumin)</td><td>Sigma</td><td>A1470-100G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Aufschlusslösung</td><td></td><td></td><td>9 ml RPMI-1640, 0,025&nbsp; mg/ml Liberase TM Forschungsqualität, 10&nbsp; mM HEPES, 0,2&nbsp; mg/ml DNaseI</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM Research Grade</td><td>Roche</td><td>05 401 127 001</td><td>wird als "gereinigte Kollagenase"</td></tr> <tr><td>bezeichnet1&nbsp; M HEPES</td><td>Lonza</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>10 104 159 001</td><td></td></tr><tr><td>50&nbsp; ml Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>60&nbsp; mm Gewebekulturschale</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>1/2&nbsp; cc U-100 Insulinspritze 28&nbsp; 1/2&nbsp; G</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp; ml Polystyrol-Tube mit rundem Boden</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp; ml Glaspipette</td><td>Fisher Healthcare</td><td>13-678-27E</td><td>Zum Spülen der Thymusfragmente verwenden. Thymusfragmente neigen dazu, mit Plastikpipetten an der Wand zu kleben.</td></tr><tr><td>MACSmix Rohrrotator</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>100&nbsp; &Mikro; m Zellsieb</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Dichtegradient mittel: OptiPrep</td><td>Axis-Shield</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Sorting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp; ml Polypropylen-Tube mit rundem Boden</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD16/CD32 (Fc-Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>Verwendung als unverdünnt, 2&nbsp; &Mikro; l pro Probe</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD45-PercpCy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451-80</td><td>Verwendung bei 1:150, 10&nbsp; &Mikro; l pro Probe</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD326 (EpCAM)-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5791-82</td><td>Verwendung bei 1:100, 10&nbsp; &Mikro; l pro Probe</td></tr><tr><td>BD Influx</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einzelzellanalyse-Software</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EAK Gel Assembly</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-His-Tag</td><td>AnaSpec</td><td>29673</td><td>"anti-His-Tag IgG"</td></tr><tr><td>Gereinigtes Anti-Maus-CD326 (EpCAM)</td><td>BioLegend</td><td></td> <td>118202"anti-EpCAM IgG"</td></tr><tr><td>Rekombinantes Protein A/G</td><td>Pierce Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5&nbsp; ml Safe-Lock Tuben, Biopur, steril</td><td>Fisher Healthcare</td><td>05-402-24B</td><td>bezeichnet als "1.5&nbsp; ml Mikrozentrifugenröhrchen "</td></tr><tr><td>96-Well, Gewebekulturplatte, runder Boden mit niedrigem Verdampfungsdeckel</td><td>BD Falcon</td><td>353917</td><td></td></tr><tr><td>Schaukelplattform: Nutator Mischer Nr. 1105</td><td>BD Clay Adams</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Vorbereiten mit sterilem destilliertem Wasser</td></tr><tr><td>EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2)</td><td>American Peptide Company& nbsp;</td><td></td><td>kundenspezifisch synthetisiert, 10&nbsp; mg/ml</td></tr><tr><td>EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHHH-CONH2)</td><td>American Peptide Company&nbsp;</td><td></td><td>kundenspezifisch synthetisiert, 7,5&nbsp; mg/ml</td></tr><tr><td>Vollständiges Medium</td><td></td><td></td><td>RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-Glutamin, 1% NEAA, 5&nbsp; mM HEPES, 50&nbsp; &Mikro; M 2-Mercaptoethanol</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fötales Rinderserum)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>Vor Gebrauch bei Hitze inaktiviert</td></tr><tr><td>Stift/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200&nbsp; mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>NEAA (nicht-essentielle Aminosäure) 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>1&nbsp; M HEPES</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (100x)</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>Plattformschüttler: Die Bauchtänzerin</td><td>Stovall Life Sciences Inc.</td><td>Modell: USBDbo</td><td></td></tr></tbody></table>

die förderung der 3-d-aggregation von facs purified thymusepithelzellen mit eak 16-ii / eakiih6 selbstaufbau hydrogels

Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

Thymusinvolution, die mit Alterung oder pathologischen Beleidigungen verbunden ist, führt zu einer verminderten Produktion reifer T-Zellen. Die Wiederherstellung der Funktion eines versagenden Thymus ist entscheidend für die Aufrechterhaltung einer effektiven T-Zell-vermittelten erworbenen Immunantwort gegen eindringende Krankheitserreger. Die Regeneration und Revitalisierung des Thymus erwies sich jedoch als schwierig, vor allem aufgrund der Schwierigkeiten, die einzigartige 3D-Mikroumgebung des Thymusstromas zu reproduzieren, die für das Überleben und die Funktion der Thymusepithelzellen (TECs) entscheidend ist. Wir haben ein neuartiges Hydrogelsystem entwickelt, um die Bildung von TEC-Aggregaten zu fördern, basierend auf der selbstorganisierenden Eigenschaft der amphiphilen EAK16-II-Oligopeptide und ihres histidinylierten Analogons EAKIIH6. TECs wurden aus isolierten Thymuszellen mit Dichtegradienten angereichert, mit Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) sortiert und mit Anti-Epithelzelladhäsionsmolekülen (EpCAM) markiert, die zusammen mit Anti-His-IgGs an den A/G-Adapterkomplexen des Proteins verankert waren. Die Bildung von Zellaggregaten wurde durch Inkubation von TECs mit EAKIIH6- und EAK16-II-Oligopeptiden und dann durch Erhöhung der Ionenkonzentration des Mediums gefördert, um die Gelierung einzuleiten. TEC-Aggregate, die in EAK-Hydrogel eingebettet sind, können die Entwicklung funktioneller T-Zellen in vivo effektiv fördern, wenn sie in athyme Nacktmäuse transplantiert werden.

Um die Wirksamkeit der Verwendung der Dichtegradiententrennung Protokoll untersuchen die CD45- Stromazellen zu bereichern, geerntete Zellen, sowohl von der Oberfläche und den ausgefällten Lymphozyten Pellets wurden mit anti-CD45 und anti-EpCAM-Antikörper. Sowohl anti-Ulex Europaeus Agglutinin 1 (UEA1) und Anti-MHC-Klasse II-Antikörper wurden auch in der Färbungs Cocktail aufgenommen, um die cTEC und mTEC Untergruppen identifizieren. Wie in Abbildung 1 gezeigt, konnten wi...

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Anreicherung von Thymusepithelzellen (TECs) mit einem Dichtegradienten für die FACS-Isolierung. Es zeigt auch die Verwendung von EAK16-II/EAKIIH6-Peptiden zur Förderung der TEC-Aggregatbildung. Die Mikroumgebungen des Hydrogels EAK16-II/EAKIIH6 bieten die 3-D-Konfiguration, die zur Aufrechterhaltung des Überlebens und der Funktion der TECs erforderlich ist.

Die Förderung der 3-D-Aggregation von FACS Purified Thymusepithelzellen mit EAK 16-II / EAKIIH6 Selbstaufbau Hydrogels

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Verwendung des Peptids EAK 16-II/EAKIIH6 zur Förderung der Thymusepithelzellaggregation in einer dreidimensionalen Struktur zur Unterstützung des Selbstüberlebens und der Funktion des Thymusepithels zu demonstrieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich des Thymus-Bioengineerings zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie das Peptid EAK-16-II/EAKIIH6 verwendet, die Aggregation von Thymusepithelzellen fördert, biologisch abbaubar ist und das Potenzial hat, für Injektionen verwendet zu werden.Um den Thymus zu ernten, beginnen Sie damit, eine drei bis fünf Wochen alte C57 black 6J Maus in Rückenlage zu legen und das Haar mit 70% Ethanol zu befeuchten. Machen Sie mit einer scharfen, geraden Präparierschere einen kleinen horizontalen Schnitt durch die Bauchhaut. Ziehen Sie dann an der Haut auf beiden Seiten des Schnitts, um die Bauchhöhle freizulegen.Machen Sie dann einen horizontalen Schnitt knapp unter der untersten Rippe und schneiden Sie seitlich zur Membran. Ziehen Sie mit einer Pinzette den Xiphoid-Prozess und schneiden Sie die Mitte der Rippen entlang beider Seiten der Brust durch. Ziehen Sie die Rippen und das Brustbein nach oben, so dass der Thymus deutlich sichtbar ist.Schöpfen Sie dann mit einer gebogenen Pinzette vorsichtig die Lappen des Thymus aus dem Bindegewebe und legen Sie sie in Waschlösung. Übertragen Sie den Thymus nach dem Spülen in eine 16-Milliliter-Gewebekulturschale mit fünf bis sechs Millilitern RPMI 1640 und verwenden Sie eine 28-Gauge-Insulinnadel, um das Gewebe in etwa einen Kubikmillimeter große quadratische Stücke zu zerlegen. Verwenden Sie anschließend eine Glaspasteurpipette, um die Gewebefragmente mit dem Medium in der Schale abzuspülen.Kippen Sie dann die Schüssel und lassen Sie die Fragmente auf dem Boden absetzen. Entfernen Sie langsam den Mediumüberstand durch Aspiration. Wiederholen Sie dann die Wäsche noch vier- bis fünfmal mit jeweils fünf bis sechs Millilitern frischem Medium, bis die Lösung weniger undurchsichtig wird.Nach dem letzten Waschen drei Milliliter Aufschlusslösung in die Schüssel geben und die Thymusstücke und die Lösung in ein fünf Milliliter langes Polystyrolröhrchen mit rundem Boden geben. Inkubieren Sie das Gewebe auf einem Röhrenrotator bei 37 Grad Celsius für sechs Minuten bei 12 U/min. Am Ende der Drehung lassen Sie die Fragmente am Boden des Röhrchens absetzen und überführen Sie den Überstand mit einer Pasteurpipette in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern Waschlösung.Zentrifugieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern frischer Waschlösung auf Eis. Verdauen Sie dann die Thymusfragmente noch zwei weitere Male im Rotator, wie gerade gezeigt, und ziehen Sie den Überstand in dasselbe 50-Milliliter-Röhrchen. Nach dem abschließenden Aufschluss verwenden Sie eine serologische Zwei-Milliliter-Kunststoffpipette, um die verbleibenden Fragmente zu zerreiben und die Gewebewirbel in das 50-Milliliter-Röhrchen zu übertragen.Drehen Sie das Rohr herunter, um die Zellen zu sammeln, und resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern Waschpuffer. Filtrieren Sie dann die Zellen durch ein 100-Mikron-Sieb, während das Röhrchen auf Eis gestellt wird. Zur Anreicherung für die Thymusepithelzellen schleudern Sie die Zellen wieder herunter und resuspendieren das Pellet in 2,5 Millilitern Waschpuffer.Geben Sie anschließend 20 Milliliter RPMI 1640 in die Zellen und verwenden Sie eine serologische 10-Milliliter-Pipette, um 12 Milliliter frisch zubereitete Gradientenlösung mit 21 % Dichte vorsichtig durch die Schwerkraft unter die Zellen zu schichten. Trennen Sie nun die Zellen durch Zentrifugation in einem schwingenden Schaufelrotor bei der langsamsten Verzögerungsrate. Am Ende der Zentrifugation überführen Sie die oberste Schicht und die Grenzfläche in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen und geben bis zu 40 Milliliter Waschlösung in die Zellen.Der Dichtegradient wird durch drei aufeinanderfolgende Zentrifugen entfernt, wobei der Überstand nach jedem Waschen mit einer Pipette abgesaugt wird. Dann das endgültige Pellet zum Zählen in zwei Milliliter Waschlösung resuspendieren. Um die EAK-Aggregate für Thymusepithelzellen zu erzeugen, stellen Sie die Thymusepithelzellen auf eine Verdünnung von fünf mal 10 bis vier Zellen pro Milliliter in Waschlösung ein und säen Sie 100 Mikroliter Zellen pro Vertiefung in eine 96-Well-Gewebekulturplatte mit niedrigem Verdunstungspotenzial und rundem Boden aus.Als nächstes gibst du 14,6 Mikroliter frisch zubereitete Protein AG Adapter Komplexe in jede Vertiefung und stellst die Platte auf eine Schaukelplattform bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen nach 20 Minuten mit 200 Mikrolitern Waschlösung pro Vertiefung und entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipette. Waschen Sie dann die Zellen erneut mit 200 Mikrolitern 10%iger Saccharoselösung.Resuspendieren Sie die Pellets in 30 Mikrolitern 10%iger steriler Saccharoselösung pro Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen dann in 10 Mikrolitern EAKIIH6 fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation fügen Sie 20 Mikroliter EAK 16-II hinzu, gefolgt von 100 Mikrolitern vollständigem Medium und stellen Sie die Platte bei Raumtemperatur auf eine Plattform, um die Gelierung zu starten.Nach 15 bis 20 Minuten stellen Sie die Platte für zwei bis vier Stunden in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Geben Sie dann weitere 100 Mikroliter des kompletten Mediums hinzu und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Um das Medium zu wechseln, verwenden Sie eine Mikropipette, um 100 Mikroliter des Mediums von der Oberfläche der Kulturen zu aspirieren, ohne das Gel zu stören, und legen Sie die Spitze an die Wände jeder Vertiefung, um die Kulturen mit 100 Mikrolitern vorgewärmtem Medium zu bepflanzen.Unter Verwendung des soeben gezeigten Protokolls der Dichtegradiententrennung können CD45-negative Stromazellen routinemäßig um das 15- bis 20-fache angereichert werden, wie in diesen repräsentativen Punktdiagrammen dargestellt. Hier wurden Thymus-Epithelzellaggregate, die wie gerade gezeigt von vier Wochen alten rot fluoreszierenden transgenen Mäusen hergestellt wurden, zwei Tage lang in vitro kultiviert und konfokalmikroskopisch untersucht. Einmal gemeistert, können Thymusepithelzellen in drei bis vier Stunden für die Flow-Sortierung angereichert werden.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Thymusgewebes, um injizierbare, funktionelle Mini-Thymuseinheiten zu entwickeln, um das adaptive Immunsystem zu modulieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Video die Herstellung von 2-dGuo behandelten reaggregieren Thymus Kulturen demonstriert.

Reaggregieren Thymus Kulturen

Wir präsentieren Protokolle für die 3-dimensionale (3D) Verkapselung von Zellen innerhalb synthetischen Hydrogelen. Die Kapselung Verfahren ist für zwei häufig verwendete Methoden der Vernetzung (Michael-Addition und Licht-initiierte radikalische Mechanismen), sowie eine Reihe von Techniken für die Beurteilung der eingekapselten Zellen Verhalten skizziert.

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogele für Tissue Engineering

Hier beschreiben wir die Verwendung eines sich selbst organisierenden 3-dimensionalen Gerüst zur Kultur humaner neuraler Vorläuferzellen. Wir präsentieren ein Protokoll, um die Zellen aus dem Gerüste Freisetzung analysiert anschließend zB mittels Durchflusszytometrie werden. Dieses Protokoll kann zu anderen Zelltypen angepasst werden, um detaillierte mechanistisch Studien durchzuführen.

Kultivierung humaner neuronaler Vorläuferzellen in einer 3-dimensionalen Self-Montage Peptide Hydrogel

Das folgende Protokoll stellt Techniken zur Verkapselung Pankreas β-Zellen in Schritt-Wachstum PEG-Peptid-Hydrogele durch Thiol-En-Foto-Klick-Reaktionen gebildet. Dieses Material-Plattform bietet nicht nur eine cytocompatible Mikroumgebung für Zellverkapselung, sondern erlaubt auch benutzergesteuerten rasche Erholung von Zellstrukturen innerhalb der Hydrogele gebildet.

Erzeugung und Verwertung von β-Zellen Spheroids Von Step-Wachstum PEG-Peptid-Hydrogele

Um hochorganisierte Strukturen aus komplexem Gewebe zu erzeugen, muss man mehrere Materialien und Zelltypen zu einem integrierten Komposit zusammenfügen.  Dieses kombinatorische Design umfasst organspezifische geschichtete Zellblätter mit zwei unterschiedlichen biologisch abgeleiteten Materialien, die eine starke fibröse Matrixbasis enthalten, und Endothelzellen zur Verbesserung der Bildung neuer Gefäße.

Tissue Engineering: Aufbau eines Multizelluläre 3D Gerüst für die Lieferung von Layered Zellschichten

Die Untersuchung medullärer Thymusepithelzellen in vitro war weitgehend erfolglos, da aktuelle 2D-Kultursysteme das in vivo-Szenario nicht nachahmen. Das hierin beschriebene 3D-Kultursystem - ein modifiziertes organotypisches Hautkulturmodell - hat sich bei der Rekapitulation der mTEC-Proliferation, Differenzierung und Aufrechterhaltung der promiskuitiven Genexpression als überlegen erwiesen.

3D Organotypische Cokulturmodell Unterstützung Mark Thymusepithel Zellproliferation, Differenzierung und Genexpression Promiscuous

Rekombinantes Protein-Engineering Hydrogele sind für 3D Zellkultur von Vorteil, da sie für komplette Einstellbarkeit der Polymer-Rückgrat und sich somit die Zelle Mikroumgebung ermöglichen. Hier beschreiben wir den Prozess der rekombinante Elastin-wie Proteinreinigung und ihre Anwendung in 3D Hydrogel Zelle Kapselung.

Produktion von Elastin-Like Protein Hydrogele für Kapselung und Immunostaining Zellen in 3D

Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung eines mikrofluidischen Kanals mit sich ändernder Geometrie entlang der Strömungsrichtung des Fluids, um eine Dehndehnung (Dehnung) zu erzeugen, um Fasern in einem 3D-Kollagenhydrogel (&lt;250 μm Dicke) auszurichten. Die resultierende Ausrichtung erstreckt sich über mehrere Millimeter und wird durch die Dehndehnungsrate beeinflusst.

Mikrotechnische 3D-Kollagen-Hydrogele mit Faserausrichtung mit großer Reichweite

In diesem Artikel wird beschrieben, wie phototunbare Hydrogele in 3D biogedruckt werden, um die Versteifung der extrazellulären Matrix und die Aktivierung von Fibroblasten zu untersuchen.

3D-Bioprinting von phototunbaren Hydrogelen zur Untersuchung der Fibroblastenaktivierung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Bildung von humanen iPSC-abgeleiteten Thymus-Organoiden, die in 3D-Fibrin-Hydrogelen gezüchtet werden, um die Reifung der Thymusepithelzellen (TEC) und deren verlängerte Erhaltung sowie die Thymopoese in vitro zu unterstützen.

Bildung humaner Thymus-Organoide in dreidimensionalen Fibrin-Hydrogelen

Erfahren Sie die 3-D-Aggregation von Thymusepithelzellen mit EAK16-II/EAKIIH6-Selbstaufbau-Hydrogelen. Diese Methode unterstützt die Zellüberlebensfähigkeit und ermöglicht Anwendungen in der Thymus-Bioengineering-Forschung.

Die Förderung der 3-D-Aggregation von FACS Purified Thymusepithelzellen mit EAK 16-II / EAKIIH6 Selbstaufbau Hydrogels

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