Rapid-Scan-Elektronenspinresonanz eröffnet neue Wege für Imaging Physiologisch Wichtige Parameter In Vivo

Das übergeordnete Ziel von Rapid Scan Electron Paramagnetic Imaging (RSEPRI) ist es, quantitative Informationen über die Sauerstoffkonzentration, den pH-Wert, den Redoxstatus und die Konzentration von Signalmolekülen zu liefern, die für die biomedizinische Forschung nützlich sind. EPRI ist ein Werkzeug, mit dem zentrale Fragen der Krebsforschung zur Tumorumgebung beantwortet werden können. Der Hauptvorteil der Rapid-Scan-EPR-Bildgebung besteht darin, dass Sie im Vergleich zur Dauerstrich- oder CW-EPR-Bildgebung mehr Informationen in viel kürzerer Zeit mit einer größeren Vielfalt an Sondenmolekülen erfassen können.

Die Moleküle, die empfindlich auf den Redoxstatus oder den pH-Wert reagieren, sind ein gutes Beispiel dafür, wo das Schnellscan-EPRI wirklich glänzt. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Berechnung der experimentellen Bedingungen für den Schnellscan, wie sie im Textprotokoll festgelegt sind. Ein wichtiger Teil des Rapid-Scans besteht darin, die Abhängigkeit des Signals von der Resonatorbandbreite und experimentellen Bedingungen wie der Sweep-Breite der Scanfrequenz zu verstehen.

Um das Experiment wirklich zu optimieren, müssen Sie alle drei verstehen. Der Rapid-Scan-Spulentreiber verfügt über zwei Verstärker. Bei der Auswahl eines Kondensators muss die Kondensatorbox mit einer gleichen Kapazität auf jeder Seite der Box symmetrisch werden.

Die beiden Seiten sind in Reihe. Schrauben Sie die obere Abdeckung des Kondensatorgehäuses ab und setzen Sie auf beiden Seiten Kondensatoren ein, die dem ermittelten Wert entsprechen. Bringen Sie die Oberseite des Kondensatorgehäuses wieder an und schrauben Sie es fest, um sicherzustellen, dass es eingeschaltet bleibt.

Stellen Sie mit der Frontplatte des Resonanzspulentreibers die Ausgangsfrequenz ein, bis die sinusförmige Wellenform die maximale Amplitude hat. Um die Radikale vorzubereiten, nehmen Sie N-15 PDT aus dem Gefrierschrank und lassen Sie den Behälter auf Raumtemperatur kommen. Wiegen Sie 1,4 Milligramm N-15 PDT mit einer Analysenwaage ab.

Fügen Sie 1,4 Milligramm N-15 PDT zu 15 Millilitern deionisiertem Wasser hinzu, um eine Endkonzentration von 0,5 Millimolar zu erhalten. Kombinieren Sie anschließend 50 Milligramm BMPO mit fünf Millilitern Wasser in einem 16-Millimeter-Quarzbestrahlungsröhrchen. Fügen Sie 100 Mikroliter 300 millimolares Wasserstoffperoxid hinzu.

Bestrahlen Sie das Gemisch in der 16 Millimeter großen Quarz-Bestrahlungsröhre mit einer 450 Watt starken Mitteldruck-UV-Lampe für fünf Minuten. Übertragen Sie mit einer Glastransferpipette zwei Komma fünf Milliliter der bestrahlten BMPO-OH-Lösung aus dem Quarzbestrahlungsröhrchen in eine Seite eines 16-Millimeter-Quarzprobenröhrchens mit einem drei Millimeter großen Teiler. Übertragen Sie die restlichen zwei Komma fünf Milliliter bestrahltes BMPO-OH in die andere Seite des Quarzprobenröhrchens mit dem Teiler.

Ein zweiter wichtiger Schritt ist das Verständnis der Leistungssättigungskurve. Mit zunehmender Abtastrate erhalten Sie höhere Leistungen und größere Signalamplituden, bevor das Signal gesättigt ist. Größere Signalamplituden sind eine weitere Möglichkeit, die Erfassungszeit zu verkürzen.

Stimmen Sie zunächst den Resonator mit einer wässrigen Probe des Nitroxidradikals ab, indem Sie die 15-Milliliter-Probe mit 0,5 Millimolar N-15 PDT in Wasser in eine 16-Millimeter-Quarzelektronen-Paramagnetresonanzröhre einführen. Führen Sie das Quarzrohr in die Detektionsseite des Cross-Loop-Rapid-Scan-Elektronen-, Paramagnetresonanz- oder RSEPR-Resonators ein. Ändern Sie die Frequenz der Gerätequelle, bis sie mit der Frequenz der Detektionsseite übereinstimmt, auf der sich die Probe befindet.

Ändern Sie nun die Frequenz der Anregungsseite so, dass sie den Frequenzen der Experimentquelle und der Detektionsseite des Resonators entspricht. Ändern Sie die Frequenz der Anregungsseite, indem Sie einen variablen Kondensator innerhalb des Resonatorhohlraums drehen. Um die Instrumentenkonsole und den Hauptmagneten einzurichten, schalten Sie das Spektrometer ein und wählen Sie ein Experiment, das transiente Daten mit der Zeit auf der Abszisse aufzeichnet.

Es wird eine Leistungssättigungskurve an einer Standard-Nitroxidradikalprobe unter den gleichen experimentellen Bedingungen durchgeführt, die auch für die Untersuchung von Radikalen verwendet werden, die empfindlich auf den pH-Wert oder den Redoxstatus reagieren. Sobald das System eingerichtet ist, werden die Gradienten manuell oder über ein Computerprogramm für das Bildgebungsexperiment angewendet. Die Intensität des EPR-Signals ist direkt proportional zum Mikrowellenfeld im Resonator, das den Spin von einem Energieniveau zum nächsten bewegt

Dieses Mikrowellenfeld wird als B1 bezeichnet. B1 ist proportional zur Quadratwurzel der Mikrowellenleistung. Wenn die Mikrowellenleistung vervierfacht wird, verdoppelt sich B1. In dieser Abbildung wird die Leistung von acht auf 32 Milliwatt vervierfacht und B1 von 18 auf 36 MilliGauß verdoppelt.

Eine Leistungssättigungskurve kann konstruiert werden, indem die relative Amplitude als Funktion der Quadratwurzel der Mikrowellenleistung oder, wenn der Wirkungsgrad des Resonators bekannt ist, B1 aufgetragen wird. Der Bereich dieser Kurve, der linear ist, zeigt den Leistungsbereich, in dem das EPR-Signal nicht gesättigt oder verzerrt ist. Einer der Vorteile eines Rapid-Scan-Experiments besteht darin, dass der lineare Leistungsbereich, dargestellt durch die farbigen Punkte, im Vergleich zum regulären CW-Experiment, dargestellt durch die schwarzen Punkte, erweitert wird. Hier ist ein zweidimensionales spektrales räumliches Bild von Phantomen zu sehen, das aus einem drei Millimeter voneinander entfernten BMPO-OH-Addukt bei einer Konzentration von fünf Mikromolaren besteht.

Ein Schnitt durch das Bild zeigt die spektrale Form bei 250 Megahertz. Dieses Bild zeigt das N-14-Nitanylradikal, das zum Einfangen von Stickstoffmonoxid in vivo in einem Phantom verwendet werden kann, wobei eine fünf Millimeter dicke Wand zwei Probenkammern trennt. Hier ist die spektrale Form bei 250 Megahertz dargestellt.

Das zweidimensionale Bild der pH-empfindlichen Triarylmethylradikale spiegelt den Unterschied in den spektralen Merkmalen wider, wenn der pH-Wert des Phosphatpuffers gleich sieben Komma null oder der pH-Wert sieben Komma vier beträgt. Dieses Bild zeigt N-15-Dinitroxid in einem Phantom mit zwei Kompartimenten und einem 10-Millimeter-Spacer. Zunächst enthalten beide Kompartimente eine 0,5 millimolare Sonde.

Die Zugabe von Glutathion zum Dinitroxid bricht die reduzierte Linkerregion und erzeugt zwei Mononitroxide, eine Veränderung, die sich im zweidimensionalen Bild widerspiegelt. Die Entwicklung des Schnellscan-EPR ist ein totaler Paradigmenwechsel in unserer Fähigkeit, Moleküle mit ungepaarten Elektronen zu untersuchen. Sie haben heute gesehen, dass es auf in vivo EPR angewendet wird, aber es bietet auch wunderbare Möglichkeiten für Tieftemperaturstudien von Verbindungen, die Metalle enthalten, und viele andere Arten von Systemen.

Bei allen Stichproben, die wir bisher untersucht haben, haben wir Verbesserungen des Signal-Rausch-Verhältnisses von mindestens einer Größenordnung und manchmal sogar mehr erzielt.