Entfernen von exogenen Materialien aus dem äußeren Teil der gefrorenen Kerne der Antike biologische Gemeinschaften beherbergte Innen zur Untersuchung

Die Kryosphäre bietet Zugang zu konservierten Organismen, die unter früheren Umweltbedingungen überlebt haben. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, verborgene Vielfalt aufzudecken, indem exogenes Material erfolgreich aus gefrorenen Kernen gesammelt und entfernt wird. Diese Methode kann helfen, wertvolle historische Fragen zu ausgewählten Zeiträumen zu beantworten, indem sie Organismen identifiziert, die aus Gletschereis und Permafrost geborgen wurden.

Die Entnahme eines aspetischen Kerns vor Ort ist angesichts der hohen Wahrscheinlichkeit einer Kontaminationseintragung eine Herausforderung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht daher darin, dass die Entfernung von Verunreinigungen in einer kontrollierten Laborumgebung erfolgt. Die visuelle Demonstration dieses Protokolls ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zum Schaben und Dekontaminieren etwas schwer zu erlernen sein können.

Es ist wirklich ein Zwei-Personen-Job, daher erfordert es viel Geduld und vor allem Teamarbeit. Dieses Verfahren wird von zwei unterstützenden Wissenschaftlern aus meinem Labor, Karen Foley und Robert Jones, demonstriert. Dieses Protokoll erfordert akribische Sauberkeit.

Verwenden Sie einen auf 450 Grad Celsius eingestellten Ofen, um Folgendes vier Stunden lang zu backen. Sterile nukleinsäurefreie Metallgestelle, Glaswaren, Metallzangen und Glaswolle. Verwenden Sie eine Folie aus dicker Folie, um eine erneute Kontamination zu vermeiden.

Als nächstes sterilisieren Sie 85 % Ethanol und Reinstwasser mit 0,22-Mikron-Filtern. Diese Flüssigkeiten müssen bei oder unter vier Grad Celsius bleiben, sonst knacken sie die Probe, was eine Kontamination erleichtert. Lagern Sie das Ethanol bei minus 20 Grad Celsius.

Und lagern Sie das Wasser bei vier Grad Celsius. Sterilisieren Sie dann ein Kunststofflineal mit 70 % Ethanol, gefolgt von einer DNA-Dekontaminationslösung und einer RNase-Dekontaminationslösung. Wischen Sie jede Lösung sofort nach dem Auftragen ab.

Bewahren Sie das Lineal dann in einem sterilen, nukleinsäurefreien Whirl-Pak-Beutel auf. Bereiten Sie als Nächstes den Kühlraum vor, indem Sie zuerst die Wände, Böden und eine Metallwerkbank darin mit 1 % Bleiche schrubben. Stellen Sie dann die Raumtemperatur auf ca. minus 11 Grad Celsius ein.

Tragen Sie nach der Zubereitung leichte Anzüge, Nitrilhandschuhe und Masken, wenn Sie sich im Kühlraum befinden, um die Gefahr einer Kontamination des Raums oder der Proben zu verringern. Dieses Verfahren erfordert, dass zwei Personen im Tandem arbeiten. Dies kann angesichts der vielen Möglichkeiten der Rekontamination eine Herausforderung darstellen.

Um den Erfolg zu sichern, überwachen wir uns gegenseitig, kommunizieren und wechseln häufig die Handschuhe. Wenn alles vorbereitet ist, bringen Sie die sterilisierten Materialien und Proben in den Kühlraum und stellen Sie sie auf den mit Bleiche geschrubbten Tisch. Dazu gehören auch präparierte Kulturen von S.marcescens.

Zuerst wird der Permafrostkern auf ein vorbereitetes Blatt Aluminiumfolie gelegt. Als nächstes wird die Außenseite des Kerns unter Verwendung eines sterilen Schaumstoffstopfens leicht mit einer verdünnten Kultur von S. marcescens beimpft. Legen Sie dann den Kern auf ein steriles Metallgestell über einem Tablett.

Nun wird die Mikrotomklinge aus Stahl mit 70 % Ethanol, DNA-Dekontaminationslösung und RNase-Dekontaminationslösung steril gewischt. Als nächstes reinigt Forscher A seine Nitrilhandschuhe auf die gleiche Weise. Dann hält A den Kern in einem 45-Grad-Winkel über dem Tablett.

B schabt mit der sterilen Klinge vorsichtig etwa fünf Millimeter von der Außenseite des gesamten Kerns einschließlich der Enden ab, während A den Kern nach jedem Abkratzen dreht. Bei Bedarf muss die Klinge mit den drei Lösungen erneut gereinigt werden. Als nächstes gießt B schnell und vorsichtig filtersterilisiertes 95%iges Ethanol über den Kern, während A den Kern dreht.

Dann wird der Kern schnell mit Wasser abgespült. Das Metallgestell über dem Tablett wird nun ausgetauscht und der Kern auf das neue Gestell gesetzt. A reinigt nun seine Nitrilhandschuhe und legt dann den Kern auf ein sauberes Gestell über der Schale.

In der Zwischenzeit besprüht B den gesamten Kern mit DNA-Dekontaminationslösung, gefolgt von einer Spülung mit filtersterilisiertem Wasser. Als nächstes besprüht B den gesamten Kern mit RNase-Dekontaminationslösung, gefolgt von einer weiteren Spülung mit dem Wasser. Zuletzt wird der Kern in einen sterilen Whirl-Pak-Beutel gegeben.

Beginnen Sie damit, ein Metallgestell über eine Glasschale in einer Biohaube mit laminarer Strömung zu platzieren. Lege dann den Kern auf das Metallgestell. Lassen Sie zwei bis fünf Millimeter der äußeren Oberfläche des Kerns etwa 10 Minuten lang auftauen.

Drehen Sie während dieser Zeit den Kern alle zwei Minuten um 90 Grad. Fassen Sie nach dem Auftauen etwas Glaswolle mit einer Pinzette und tupfen Sie die gesamte Oberfläche des Kerns ab, um Bakterien zu sammeln. Beimpfen Sie dann die beiden Platten mit der Glaswolle.

Messen Sie anschließend die Außenmaße des Kerns mit dem Lineal, berühren Sie jedoch nicht den Kern. Beimpfen Sie außerdem zwei zusätzliche Platten mit der Originalkultur, die zuvor zur Dotierung der Außenseite des Kerns verwendet wurde, um zu überprüfen, ob die Inokulae lebensfähig sind. Füllen Sie dann den Kern in einen großen sterilen Beutel und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius.

Inkubieren Sie die beimpften Platten eine Woche lang bei 23 Grad Celsius und untersuchen Sie sie dann auf S.marcescens-Kolonien, die sich bei dieser Temperatur rot verfärben. Obwohl dieses Protokoll eine Reihe kritischer Schritte umfasst, besteht einer der wichtigsten darin, das Wachstum von Serratia Marcescens zu überprüfen. Wenn es keine sichtbaren S.marcescens-Kolonien gibt, fahren Sie mit der nächsten Auftauphase fort.

Wenn es S.marcescens-Kolonien gibt, dann kratzen Sie weitere fünf Millimeter vom Kern ab und wiederholen Sie den Vorgang. Prüfen Sie, ob S.marcescens aus der ursprünglichen Kultur gewachsen ist, die den kalten Temperaturen des Kühlraums ausgesetzt war. Es wurden Proben aus Eis und Permafrost aus einem 110 Meter langen Tunnel in Fox, Alaska, entnommen.

Der Tunnel ermöglichte den Zugang zu eisreichem Schluff und Schwemmland. Die Proben wurden in dreifacher Ausfertigung entnommen. In Einrichtungen in New Hampshire wurden die beschriebenen Protokolle durchgeführt.

Das 16S rRNA-Gen wurde aus Bakterien sequenziert, die aus den Kernen gezüchtet wurden. Pseudomonas-Arten dominierten, aber auch mit Planctomycetia verwandte Mitglieder waren vorhanden. Und von besonderem Interesse war das Fehlen von Serratia-Arten, was zeigt, dass das Dekontaminationsprotokoll exogene DNA ausreichend entfernt hat.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Eis- und Permafrostkerne erfolgreich dekontaminiert. Einmal gemeistert, können die Verarbeitungsschritte im Kühlraum in 30 bis 45 Minuten durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, auf alles und überall zu achten, was Sie berühren.

Im Zweifelsfall wechseln Sie einfach Ihre Handschuhe und sterilisieren Sie sie erneut. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Amplikonsequenzierung und Schrotflintenmetagenomik durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie die Spezieszusammensetzung in diesem Zeitraum war oder welche funktionellen Attribute unter diesen Umweltbedingungen dominierten.