Name: Stencil Mikrostrukturierung von humanen pluripotenten Stammzellen für die Sondierung räumliche Organisation Differenzierung Fates (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Lernen Sie die Stencil-Mikrostrukturierung humaner pluripotenter Stammzellen zur Steuerung räumlicher Differenzierungsmuster. Diese robuste Methode ermöglicht präzise Kontrolle über Zelladhäsion ohne zusätzliche Oberflächenmodifikation.

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Start up Zuschuss (R-397-000-192-133) und ETPL Gap Fund (R-397-000-198-592) Diese Arbeit wird von NUS unterstützt. GS ist ein NUS Forschungswissenschaftler. Autoren möchte Dr. Jiangwa Xing für ihre technische Unterstützung auf Zelle Mikro danken.

Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von PDMS Schablone mit 1000 um Muster durch Laserschneiden und Mikrostrukturierung der hESC Linie, H9 die PDMS-Schablone verwenden. 1. Konstruktion und Herstellung von PDMS-Schablone zur Mikro <ol><li> Gestalten Sie das Schablonieren Blatt mit Durchgangslöchern der gewünschten Geometrie und Größe (zB 1000 um Kreise) und die Schablone Dichtung mit Computer-Aided - Design - Software - 10. </li><li> Laser-schneiden Sie die stenciling Blatt und Dichtung auf 120-150 &amp; mgr; m und 2 mm dicke Polydimethylsiloxan (PDMS) Blätter jeweils einen CO 2 -Laser-Schneider 10 verwendet wird . </li><li> Bond, die PDMS-Dichtung mit der PDMS-Schablonenblatt unter Verwendung von flüssigem nicht gehärtete PDMS und backen bei 60 ° C für 3-4 Stunden die PDMS-Schablone für Mikrostrukturierung zu erhalten. </li><li> Sterilisieren des PDMS Schablone durch Autoklavieren bei 120 ° C für 30 min und Trocknen in einem Ofen vor dem Gebrauch. </li></ol> 2. hESCs HauptWartung <ol><li> Kultur die hESC Linien in einem Zubringer freien Erhaltungsmedium auf 1 × hESC-qualifizierte Basalmembranmatrix beschichtete Zellkultur - Platten bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Passage die hESCs, wenn sie etwa 70% konfluent sind durch 3 min Inkubation bei 37 ° C mit Dispase-Behandlung und mechanisch die HES-Kolonien in 100-200 um Klumpen dissoziiert. Platte , die die hESCs Klumpen in einer Dichte von 30 bis 50 Klumpen pro 9,6 cm 2 Wachstumsbereich auf Basalmembranmatrix beschichteten Gewebekultur Polystyrol bei 1: 6 Teilungsverhältnis. </li></ol> 3. Stencil Mikrostrukturierung von humanen embryonalen Stammzellen <ol><li> Vorbereitung vor Strukturierung der Zelle <ol><li> Siegel eine PDMS Schablone auf eine 60 mm Petrischale durch den Verzicht 700 &amp; mgr; l 70% Ethanol Analysequalität in Reinstwasser in der Petrischale und legen Sie die Schablone an der Spitze. </li><li> Legen Sie die Petrischale innen Biosicherheitsschrank über Nacht zu lassen ter Ethanol trocken. </li><li> Check keine Blase unterhalb der Schablone vorhanden ist, um sicherzustellen, dass die Schablone mit der Petrischale eine gute Dichtung bildet. Dies verhindert ein Austreten von ECM-Beschichtungslösung. Verschließen Sie die Petrischale und speichern unter sterilen Bedingungen, bis sie bereit für die Zellaussaat ist. </li><li> Bereiten Sie Teilmengen von hESC-qualifizierte Basalmembranmatrix nach dem Analysezertifikat. Stellen Sie sicher, dass jeder Teilmenge ergibt 1 × hESC qualifizierte Basalmembranmatrix Lösung, wenn in 25 ml Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium verdünnt: Nährsalzgemisch F-12 (DMEM / F12) nach Herstellerproduktblatt. </li><li> Bereiten Sie die ECM-Beschichtungslösung durch Zugabe eines aliquoten von hESC-qualifizierte Basalmembranmatrix in 16,7 ml DMEM / F12 1,5 × hESC-qualifizierte Basalmembranmatrix Lösung zu machen. Halten Sie alle ECM-Beschichtungslösung auf Eis Gelieren zu verhindern. </li><li> Nachtrag hESC Erhaltungsmedium mit 10 &amp; mgr; M ROCK-Inhibitor (Y27632). </li></ol></li><li><strong&gt; ECM - Beschichtung auf dem Substrat schablonierte <ol><li> Behandeln Sie die Petrischale mit 100 WO 2 Plasma für 90 Sekunden. Um die Sterilität zu gewährleisten, öffnen nur die Petrischale Abdeckung innerhalb der Plasmakammer vor der Plasmabehandlung, und schnell die Petrischale nach Abschluss der Behandlung abdecken zurück. Dies erleichtert die Benetzung der Oberfläche und verhindert die Bildung von Luftblasen in dem Mikrodurchgangslöcher während der Zugabe von ECM Beschichtungslösung. </li><li> In 450 &amp; mgr; l von 1,5 × hESC-qualifizierte Basalmembranmatrix Lösung die gesamte Schablone zu decken. Abdichten der Petrischale mit selbstsiegelfähigen Folie, wie beispielsweise Parafilm, zu verhindern, dass die Lösung vor dem Austrocknen, und Inkubation für 5 h bei 37 ° C vor dem Gebrauch. </li></ol></li><li> Seeding hESCs auf die schablonen Substrat <ol><li> Untersuchen Sie hESC Kolonien in 6-Well - Platte , die die differenzierte Zellbereiche zu identifizieren , zeigt Verlust der typischen hESC Morphologie (zB Verlust von gerundeten, dicht packed epitheliale Morphologie, hohe Kern / Zytoplasma-Verhältnis mit prominenten Nukleolen). Entfernen Sie differenzierte Regionen ein Vakuum Absauger verwenden. </li><li> Waschen Sie zweimal mit 2 ml DMEM / F12 pro Vertiefung. </li><li> 1 ml von Verdauungsenzymen, wie Accutase, pro Vertiefung von 6-Well-Platte und inkubiere bei 37 ° C für 8 min. Tippen Sie auf die Platte sanft alle Kolonien von Substrat zu lösen. </li><li> Spülen jede Vertiefung mit mindestens 4 ml DMEM / F12 pro 1 ml von Verdauungsenzymen und sammeln die Zellsuspension in 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 × g für 3 min bei Raumtemperatur. </li><li> Absaugen den Überstand zu entfernen und 400 ul hESC Erhaltungsmedium mit ROCK-Inhibitor (Rocki) ergänzt fügen Sie die Zellen erneut zu suspendieren. Pipette die Zellsuspension nach oben und unten 3-mal sanft Klumpen zu brechen in einzelne Zellen. </li><li> Mischen Sie die Einzelzellsuspension gut und verdünnen 10 ul Zellproben in 190 ul DMEM / F12 (1:20 Verdünnung). Verwenden Sie einen hemocytometer der Zelldichte in der Lager-Zellsuspension zu bestimmen. </li><li> Berechnen Sie die erforderliche Zellansiedlungsdichte für eine gegebene Schablone. HINWEIS: Zum Beispiel haben wir experimentell die Zellansiedlungsdichte bestimmt eine konfluente Monoschicht aus einzelnen Zellen zu erhalten , beträgt etwa 4.444 Zellen / mm 2. Somit wird bei einer Dichte von 2 Millionen Zellen eine Zellsuspension zu erfordern / 400 &amp; mgr; l eine Schablone mit einer Fläche von 450 mm 2 und seeding Volumen von 400 ul wird. </li><li> Von der Stammzellsuspension auf die gewünschte Aussaatdichte mit hESC Kulturmedium (Schritt 3.3.8 HINWEIS) mit Rocki ergänzt. </li><li> Fügen Sie einen bestimmten Volumen der Zellsuspension, die erforderliche Anzahl von Zellen in jeder Schablone enthält, und lassen Sie die Petrischale in der Haube ungestört für 5 Minuten bei Raumtemperatur Zellen absetzen zu lassen. </li><li> Übertragen Sie die Petrischale in Inkubator und Inkubation für 1 Stunde für die Zellbindung zu ermöglichen. Achten Sie auf die Petrischale Ebene während der zu haltenTransfer-Prozess, so dass die Zellen als Monoschicht in der Schablone bleiben. </li></ol></li><li> Stencil Entfernung und Passivierung von nicht gemusterten Substrat <ol><li> Untersuchen Sie die Petrischale unter einem Mikroskop zu überprüfen, ob Zellen richtig auf das darunter liegende Substrat befestigt sind. </li><li> Absaugen weg von der Schablone Zellsuspension. </li><li> 2 ml / Schale von 0,5% der Zellkultur kompatibel nichtionisches Tensid in DMEM / F12 zur Fläche der Schablone umgibt. </li><li> Verwenden Sie ein Paar autoklaviert Zange vorsichtig auf die Schablone abziehen. Swirl das nichtionische Tensid-Lösung um, als die Schablone abgezogen wird, die Zellen zu verhindern, vor dem Austrocknen. Optisch beachten Sie die Mikromuster-Zellen in der Petrischale. </li><li> Inkubieren der Mikromuster-Zellen in 0,5% nicht-ionisches Tensid-DMEM / F12-Lösung für 10 min bei 37 ° C. </li><li> Absaugen entfernt das nichtionische Tensid-DMEM / F12-Lösung. Waschen Sie 3-mal mit 2 ml / Schale DMEM / F12. </li><li> 2 ml / Schale von hESCErhaltungsmedium mit Rocki ergänzt und über Nacht bei 37 ° C inkubiert. </li><li> Nach Inkubation über Nacht mit Rocki ergänzt Erhaltungsmedium absaugen hESC, waschen Sie einmal mit DMEM / F12 und mesoendoderm Differenzierung induzieren durch Zugabe von 2 ml / Schale von Differenzierungsmedium, ergänzt mit 100 ng / ml Activin, 25 ng / ml BMP-4 und 10 ng / ml FGF2 . </li><li> Bewerten Sie die Mikrophasenkontrast - Bildgebung und die durchschnittlichen Brachyurie (T) Intensitätsprofile für jedes Muster berechnen , wie zuvor 8 beschrieben. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die Herstellung von Mikro Schablonen Stencil Mikrostrukturierung ist eine ideale Methode HPSC Mikro zur Untersuchung Nische vermittelte Differenzierung Strukturierung zu erzeugen. Der entscheidende Vorteil der Schablonenmuster über andere Mikrostrukturierungstechniken, wie Mikrokontaktdrucken und Photostrukturierungs, ist, dass sie nicht die Oberflächenmodifikation erforderlich ist und kann auf herkömmliche TCPS Substraten implementiert werden. Daher optimiert Kultu...

Humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs), einschließlich embryonaler Stammzellen (hES-Zellen) und induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) werden in der regenerativen Medizin sowie experimentelle Modellierung von normalen und erkrankten Organogenese aufgrund ihrer Differenzierungspotential in Zelllinien aller weit ausgebeutet drei Keimschichten 1,2. Die Differenzierung Schicksale von hPSCs sind sehr empfindlich auf lokale Umweltfaktoren , die 1 autokrine oder parakrine modulieren können Signalisierung sowie Mechanotransduktion Prozesse durch körperliche Signale vermittelt 3-5. Zelle Mikro umfasst eine Reihe von Techniken , die räumlich zu organisieren , um die Geometrie und die Position einer Zellpopulation als Mittel entwickelt wurden 3 die lokale zelluläre Mikroumgebung zu steuern, wie Zell-Zell - Wechselwirkungen 6 und Zell-Matrix - Wechselwirkungen. Im Rahmen der hPSCs wurde Zelle Mikro wichtige Erkenntnisse darüber zu gewinnen, wie beschäftigt Nischen abhängenent autokrine Signalisieren moduliert hESC Pluripotenz-Differenzierung Entscheidungen 7 und Organisation in der frühen embryonalen Differenzierungsmuster 6. 2D- und 3D mikro hPSCs wurden verwendet , um die Koloniegröße von mehrzelligen Mustern zu steuern, die wiederum beeinflusst Differenzierungs Entscheidungen in die drei Keimschichten 8,9. Wir haben vielzelligen HPSC Mikromuster verwendet , um das Ausmaß der Zell-Zell- und Zell-Matrix - Interaktionen innerhalb einer HPSC Kolonie zu modulieren , zu untersuchen , wie Integrin-E-Cadherin - Übersprechens 10 Anlass zu Zellschicksal Heterogenität geben kann. Die Demonstrationen aus den oben genannten Berichten eröffnen neue Wege in Richtung der Anwendung von mehrzelligen Mikro von hPSCs als experimentelle Modelle für Medikamententoxizität Screening auf Entwicklungsstörungen 11, die Wirkung von Wachstumsfaktoren und Hormone während der Gewebe oder Organentwicklung zu studieren, und die Bildung von zu entwirren Gewebemuster. Eine Vielzahl von Zell micropatterning - Techniken wurden von Falconnet et als prüft entwickelt. al. 12 , aber nur eine Handvoll, wie Mikrokontaktdrucken 7,8,13, Mikrowell - Kultur 14,15, Photostrukturierungs 6 und microstencils 16 wurden mit hPSCs erfolgreich umgesetzt. Die Herausforderung mit Mikro hPSCs liegt in ihrer Verletzlichkeit und einer stringenten Bedingung von spezifischen extrazellulären Matrices (ECM) und die Wachstumsbedingungen für die Zellhaftung und Überleben. Für 2D HPSC Muster ist Mikrokontaktdrucken eine der gebräuchlichsten Methoden HPSC Mikromuster auf Gewebekultur und Glassubstrate 13 zu erzeugen. Das Verfahren kann gemeinsam Muster ECM in HPSC Kultur verwendet werden, einschließlich Laminin und Basalmembran-Matrices wie Matrigel. Allerdings erfordert es in der Regel einen zweistufigen Beschichtungsverfahren unterstützt von Poly-D-Lysine und benötigt spezifische inerten atmosphärischen und Feuchtigkeitsbedingungen stabil ECM Mikromuster zu machen für hPSCs auf 6,13 zu befestigen. Die wichtigste Überlegung jedes Mikro Methode ist, ob die Oberflächenmodifikation Regime HPSC-Klebstoff ECM-Muster in der gewünschten geometrischen Auflösung bei gleichzeitiger Minimierung unspezifischer Zellbindung an die Umgebung erzeugen kann. Hier berichten wir die Verwendung von Schablonenmikro als einfaches Verfahren HPSC Mikro ohne zusätzliche Oberflächenmodifikationsschritte vor der Erzeugung von Klebstoff ECM Muster zu erzeugen, um hPSCs zu befestigen auf. Die Zell Schablone besteht aus einer dünnen Membran, beispielsweise Polydimethylsiloxan (PDMS) -Folie, mit micron Durchgangslöchern bis Millimetergröße auf ein Substrat Zellkultur abzudichtenden physikalisch ECM Beschichtungen und anschließend beimpft hPSCs enthalten. Als Schablonenmuster durch physikalisches Zurückhalten der Position arbeitet, wo HPSC kann an dem darunterliegenden ECM beschichtete Substrat direkt zuzugreifen und diese befestigen, ist dieses Verfahren kompatibel mit verschiedenen Substraten, die HPSC Kulturen unterstützen kann. Die einzigen requirement ist, dass die Wahl des Schablonenmaterial eine reversible Dichtung mit dem Substrat bilden kann. Diese Substrate umfassen herkömmliche Gewebekultur - Polystyrol (TCPS) 17, Liganden konjugiert Substrate 18 sowie elastomere Substrate mit abstimmbaren Steifigkeit (z. B. PDMS) 19. Dieses Verfahren ermöglicht auch das Beschichten von verschiedenen ECM, wie Vitronectin (oder VTN - Protein), Laminin und Basalmembran Matrices (zB Matrigel und Geltrax) für die richtige Befestigung und die Differenzierung von hPSCs zu ermöglichen. Deshalb können wir für eine bestimmte HPSC Linie optimierte ECM-Substrat-Konfigurationen Transfer zum Schablone für eine optimale Zell-Matrix-Adhäsion, das Überleben und die Differenzierung Mikrostrukturierung. Kürzlich wurde ein ähnliches Verfahren auch hepatische Differenzierung von Mikro hESCs unter Verwendung von Poly (methylmethacrylat) (PMMA) Mikroschablonenanordnungen 16 zu leiten berichtet. Zell Schablonen können aus verschiedenen Materialien hergestellt werden, einschließlich erfülltals 20,21, Poly (p-xylylen) Polymere 22,23, PMMA und 16 am häufigsten, PDMS 24-28. Silicon und Poly (p-xylylen) Polymere Schablonen erfordern direkte Ätzen der Durchgangslöcher mit Spezialgeräten 20-23, was deren Zugänglichkeit für die biologische Anwender einschränkt. PDMS Schablonen können durch verschiedene Verfahren hergestellt werden , in Abhängigkeit von der Merkmalsgröße benötigt, die typischerweise von 3 &amp; mgr; m bis 2.000 &amp; mgr; m reicht 11,26-29. Wenn kleine Features gewünscht werden, dünne stenciling Blätter können durch Pressformen PDMS pre-Polymer auf einem mikrostrukturierten Silizium Vorlage mit Reliefs der Mikromuster 28 hergestellt werden. Für Funktionen&gt; 1000 &amp; mgr; m, bietet ein CO 2 Laser - Cutter eine einfache und kostengünstige Methode , um direkt die Muster auf einem bereits gegossenen PDMS Blatt während Schablonenherstellung geschnitten. Die Rezyklierbarkeit von PDMS Schablonen macht sie auch kosteneffektiv eine Reihe von Experimenten mit ausreichender Konsistenz durchzuführen. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Hier präsentieren wir die detaillierte Methodik für die Herstellung eines PDMS Schablone mit 1000 um Funktionen durch Laserschneiden und die Erzeugung von hESC Mikro. Diese hESC Mikro wurden verwendet , um das Ausmaß der Integrin und E-Cadherin vermittelte Verwachsungen innerhalb einer zusammenhängenden hESC Kolonie zu modulieren , um zu untersuchen , wie räumliche Polarisierung der Zelladhäsion führte Zellschicksal Heterogenität 10.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; 2 mm dicke PDMS-Platte</td><td>Specialty Silicone Products Inc., USA</td><td>SSPM823-.005</td><td>Wird verwendet, um ein Reservoir für die Schablone</td></tr><tr><td>120-150 &mu; zu bilden m dicke PDMS-Platte</td><td>Spezialsilikonprodukte Inc., USA</td><td>SSPM823-.040</td><td>Wird zum Formen von Schablonen verwendet&nbsp;</td></tr><tr><td>60 mm Petrischale</td><td>Nunc Nunclon Delta</td><td>150326</td><td>Substrat für die Mikrostrukturierung</td></tr><tr><td>Accutase Accutase</td><td>, Merck Millipore, Singapur</td><td>SCR005</td><td>Enzym zur Zerlegung von H9-Zellen in Einzelzellen</td></tr><tr><td>Activin&nbsp; &nbsp;</td><td>Forschung & Forschung D Systems, Singapur</td><td>338-AC-010</td><td>Wachstumsfaktor für die H9-Differenzierung</td></tr><tr><td>BMP4&nbsp;</td><td>Forschung & Forschung D Systems, Singapur</td><td>338-BP-010</td><td>Wachstumsfaktor für die H9-Differenzierung</td></tr><tr><td>Plasmasystem&nbsp;</td><td>Femto Science, Korea</td><td>CUTE-MP</td><td>Für die Plasmaoxidation von Schablonendispase</td></tr><tr><td></td><td>StemCell&trade; Technologies, Singapur</td><td>7923</td><td>Enzym zur Schwächung der Zell-ECM-Adhäsion während der Passage</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO, USA</td><td>11330032</td><td>Basalmedium für H9-Zellen</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R& D Systems, Singapur</td><td>233&ndash; FB&ndash; 025</td><td>Wachstumsfaktor für die H9-Differenzierung</td></tr><tr><td>H9-Zelllinie</td><td>WiCell Research Institute, Inc., USA</td><td>WA09</td><td>Humane embryonale Stammzellen</td></tr><tr><td>hESC-qualifizierte Basalmembran-Matrix</td><td>Matrigel, BD Biosciences, Singapur</td><td>354277</td><td>Extrazelluläre Matrixbeschichtung zur Unterstützung des Wachstums von H9-Zellen</td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Leica Microsystems, Singapur</td><td>DMi1</td><td>Zur Erfassung von Hellfeldern Bilder</td></tr><tr><td>Laserschneider</td><td>Epilog Helix 24 Lasersystem</td><td></td><td>Wird zur Erzeugung von Durchgangslöchern in PDMS-Blechen</td></tr><tr><td>verwendet mTeSR&trade; 1 mittel&nbsp;</td><td>StemCell & Handel; Technologies, Singapur</td><td>5850</td><td>Erhaltungsmedium für H9-Zellen</td></tr><tr><td>PDMS&nbsp;</td><td>SYLGARD&reg; 184, Dow Corning Co., USA</td><td>3097358-1004</td><td>Wird zum Aufkleben der PDMS-Schablone und des Reserviors</td></tr><tr><td>verwendet ROCKi Y27632</td><td>Calbiochem, Merck Millipore, Singapur</td><td>688000</td><td>Pflegt H9-Zellen als Einzelzellen&nbsp;</td></tr><tr><td>STEMdiff&handel; APEL&trade; mittel&nbsp;</td><td>StemCell & Handel; Technologies, Singapore</td><td>5210</td><td>Differenzierungsmedium für H9-Zellen</td></tr><tr><td>Polyethylenterephthalat-Film</td><td>SureMark Singapore</td><td>SQ-6633</td><td>Wird zum Formen von Schablonen verwendet;</td></tr><tr><td>Zellkulturkompatibles nichtionisches Tensid</td><td>Pluronsäure F-127, Sigma, Singapur</td><td>P2443</td><td>Passivierendes Reagenz zur Abwehr der Zelladhäsion in nicht mikrostrukturierten Substraten</td></tr></tbody></table>

stencil mikrostrukturierung von humanen pluripotenten stammzellen für die sondierung räumliche organisation differenzierung fates

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Humane pluripotente Stammzellen (hPSCs), einschließlich embryonaler Stammzellen und induzierter pluripotenter Stammzellen, haben die intrinsische Fähigkeit, sich in alle drei Keimblätter zu differenzieren. Dies macht sie zu einer attraktiven Zellquelle für die regenerative Medizin und die experimentelle Modellierung normaler und kranker Organogenese. Die Differenzierung von hPSCs in vitro ist jedoch heterogen und räumlich ungeordnet. Technologien zur Zellmikrostrukturierung bieten möglicherweise die Möglichkeit, die Mikroumgebungen von Stammzellen räumlich zu kontrollieren und die daraus resultierenden Differenzierungsschicksale zu organisieren. Bei der Mikrostrukturierung von hPS-Zellen müssen die strengen Anforderungen an das Überleben und die Aufrechterhaltung von hPS-Zellen berücksichtigt werden. Hier beschreiben wir die Schablonen-Mikrostrukturierung als eine Methode, die sehr gut mit hPSCs kompatibel ist. hPSC-Mikromuster werden durch die Geometrien der Durchgangslöcher der Zellschablone spezifiziert, die die Stellen, an denen hPSCs auf das darunter liegende, mit extrazellulärer Matrix beschichtete Substrat zugreifen und sich daran anheften können, physikalisch begrenzen. Aufgrund dieser Funktionsweise besteht im Vergleich zu anderen Zell-Mikrostrukturierungsmethoden eine größere Flexibilität bei der Verwendung von Substraten, die hPSCs angemessen unterstützen können. Wir beleuchten auch kritische Schritte für die erfolgreiche Erzeugung von hPSC-Mikromustern. Als Beispiel zeigen wir, dass die Schablonen-Mikrostrukturierung von hPSCs verwendet werden kann, um die räumliche Polarisation von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Adhäsionen zu modulieren, was wiederum die Differenzierungsmuster des Mesoendoderms bestimmt. Diese einfache und robuste Methode zur Mikrostrukturierung von hPS-Zellen erweitert die Aussichten auf die Etablierung experimenteller Modelle zur Untersuchung der Gewebeorganisation und -musterung während der frühen Embryonalentwicklung.

In diesem Papier beschreiben wir die Herstellung einer Zelle Schablone durch einen Laserschneider 1000 um Merkmale zu erzeugen. Die Schablone wurde aus 2 Teilen: einem dünnen Blech Schablonieren (ungefähr 100-200 &amp; mgr; m dick), enthaltend die Mikrodurchgangslöchern und einem PDMS Dichtung die ECM Beschichtungslösung oder Zellsuspension zu enthalten. Hier, 127 &amp; mgr; m und 2 mm dicken handelsüblichen PDMS Bleche wurden als Schablonieren Folie und Dichtung verwendet wurden. Andere...

Humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) haben die intrinsische Fähigkeit zu differenzieren und sich selbst zu organisieren in verschiedene Gewebemuster; obwohl dies erfordert die Darstellung der räumlichen Umweltgradienten. Wir präsentieren Schablone Mikro als einfache und robuste Methode biochemische und mechanische Gradienten zu erzeugen, für HPSC Differenzierungsmuster zu steuern.

Stencil Mikrostrukturierung von humanen pluripotenten Stammzellen für die Sondierung räumliche Organisation Differenzierung Fates

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Das übergeordnete Ziel dieser Schablonen-basierten Mikrostrukturierungsmethode für humane pluripotente Stammzellen besteht darin, ein einfaches und robustes Verfahren bereitzustellen, um räumliche Umweltgradienten zu erzeugen, die die Differenzierungsmuster der Stammzellen steuern. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen zur Gewebestrukturierung mithilfe eines humanen Stammzellmodells zu beantworten, beispielsweise wie räumliche Gradienten in Zell-Zell- und Zell-Matrix-Adhäsionskräften zur Organisation der Differenzierungsschicksale von Stammzellen beitragen können. Der Vorteil dieser Methode liegt darin, dass keine zusätzlichen Oberflächenmodifikationen erforderlich sind, um zelladhäsive ECM-Muster zu erzeugen, an die sich die Zellen anheften können.Dies bedeutet, dass die Methode mit verschiedenen ECM- und Substratkonfigurationen kompatibel ist, die jeweils spezifisch für eine Zelllinie sind. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Mikromusterungsschritte schwer zu erlernen sind, da sie ein präzises und sorgfältiges Handling der Schablone und der Zellen erfordern.Für dieses Verfahren müssen die PTMS-Schablonen bereits entworfen und hergestellt

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Developmental Biology

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Gerichtete Differenzierung von hES-Zellen in spezifische hat viel Interesse in der regenerativen Medizin erzeugt. Wir bieten Ihnen eine präzise, ​​Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Bestimmung...

Fate Mapping von humanen embryonalen Stammzellen durch Teratom Formation

Einzelzell-Genexpression Test wird für das Verständnis der Stammzell Heterogenitäten benötigt.

Profiling Individuelle humanen embryonalen Stammzellen durch quantitative RT-PCR

Mit der Absicht, Veränderungen in miRNAs auf differenzierten humanen neuralen Stammzellen (hNSCs) zu charakterisieren, beschreiben wir die hNSC-Differenzierung auf einem dreidimensionalen System, die Bewertung von Veränderungen in der microRNA-Expression durch miRNA-PCR-Arrays und computergestützte Analysen zur Vorhersage von miRNA-Zielen und deren Validierung durch duale Luciferase-Assays.

Differenzierung einer Menschen Neural Stem Cell Line auf Dreidimensional Kulturen, Analyse der MicroRNA und mutmaßlichen Zielgene

Hier präsentieren wir menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC) Kultur Protokolle verwendet, um hPSCs in CD34 unterscheiden+ hämatopoetischen Vorläuferzellen. Diese Methode nutzt Bühne-spezifische Manipulation von kanonischer WNT signalisieren Zellen ausschließlich entweder die definitive oder primitive hämatopoetischen Programm angeben.

Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für die effiziente, Bulk und schnelle chemische Rückfall von konventionellen Linie grundiert menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSC) in einen Epigenomically-Stall naiv Präimplantations Epiblast-ähnliche pluripotenten Zustand. Diese Methode ergibt verringerte Abstammung grundiert Genexpression und deutliche Verbesserung der gerichteten multilineage Differenzierung über ein breites Repertoire von konventionellen hPSC Linien.

Chemischen Rückfall von herkömmlichen menschlichen pluripotenten Stammzellen in eine naiv-artigen Zustand mit verbesserten Multilineage Differenzierung Potenz

Die hier vorgestellte Methode verwendet Mikromuster ungemilzt mit quantitativer Bildgebung, um die räumliche Organisation innerhalb von Säugetierkulturen aufzuzeigen. Die Technik ist in einem Standardlabor für Zellbiologie leicht zu etablieren und bietet ein beschreibbares System zur Untersuchung von Mustern in vitro.

Kartierung der Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells mit Mikromustern und quantitativer Bildgebung

Extrazelluläre Matrixliganden können auf Polyacrylamid-Hydrogele gemustert werden, um die Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen in geschlossenen Kolonien auf konformen Substraten zu ermöglichen. Diese Methode kann mit Traktionskraftmikroskopie und biochemischen Assays kombiniert werden, um das Zusammenspiel zwischen Gewebegeometrie, zellgenerierten Kräften und Schicksalsspezifikation zu untersuchen.

Musterung der Geometrie menschlicher embryonaler Stammzellkolonien auf konformen Substraten zur Kontrolle der Gewebe-Level-Mechanik

Die Zellumprogrammierung erfordert die Einführung von Schlüsselgenen, die den pluripotenten Zellzustand regulieren und aufrechterhalten. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Bildung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen dermalen Fibroblasten ohne virale/integrierende Methoden, aber unter Verwendung nicht modifizierter RNAs (NM-RNAs) in Kombination mit Immunumgehungsfaktoren, die die zellulären Abwehrmechanismen reduzieren.

Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Dieses Protokoll führt eine lithographiefreie Mikromustermethode ein, die einfach und zugänglich für Personen mit einem begrenzten Bioengineering-Hintergrund ist. Diese Methode verwendet maßgeschneiderte lasergeschnittene Schablonen, um extrazelluläre Matrixproteine in einer Form von Interesse für die Modulation von Zellmorphologien mikromustern zu lassen. Das Verfahren zur Mikromusterung wird mit induzierten pluripotenten Stammzellabgeleiteten Kardiomyozyten demonstriert.

Einfache Lithographie-freie Einzelzell-Mikromusterung mit Laser-Cut Schablonen

Wir präsentieren detaillierte Protokolle für die Erzeugung und Charakterisierung von 2D- und 3D-Modellen für humane induzierte pluripotente Stammzellen (hIPSC) der neokortikalen Entwicklung sowie ergänzende Methoden, die eine qualitative und quantitative Analyse der primären Cilium (PC) -Biogenese und -Funktion ermöglichen.

2D- und 3D-humaninduzierte pluripotente Stammzell-basierte Modelle zur Sezierung der primären Ciliumbeteiligung während der neokortikalen Entwicklung

Die verfügbaren Systeme zur Differenzierung von pluripotenten Stammzellen (PSC) zu funktionellen Zellen werden derzeit durch Probleme mit starker Variabilität von Linie zu Linie und von Charge zu Charge behindert. Hier stellen wir am Beispiel der kardialen Differenzierung ein Protokoll vor, um den Prozess der PSC-Differenzierung auf Basis von bildbasiertem maschinellem Lernen intelligent zu überwachen und zu modulieren.

Eine auf Lebendzellen basierende Strategie für maschinelles Lernen zur Überwachung der Differenzierung pluripotenter Stammzellen

Lernen Sie die Stencil-Mikrostrukturierung humaner pluripotenter Stammzellen zur Steuerung räumlicher Differenzierungsmuster. Diese robuste Methode ermöglicht präzise Kontrolle über Zelladhäsion ohne zusätzliche Oberflächenmodifikation.

Stencil Mikrostrukturierung von humanen pluripotenten Stammzellen für die Sondierung räumliche Organisation Differenzierung Fates (Video) | JoVE Journal

Stencil Mikrostrukturierung von humanen pluripotenten Stammzellen für die Sondierung räumliche Organisation Differenzierung Fates

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