Stencil Mikrostrukturierung von humanen pluripotenten Stammzellen für die Sondierung räumliche Organisation Differenzierung Fates

Das übergeordnete Ziel dieser schablonenbasierten Mikrostrukturierungsmethode für humane pluripotente Stammzellen ist es, ein einfaches und robustes Mittel zur Erzeugung räumlicher Umweltgradienten bereitzustellen, die die Differenzierungsmuster von Stammzellen steuern. Diese Methode kann Ihnen helfen, wichtige Fragen bei der Gewebemusterung anhand eines menschlichen Stammzellmodells zu beantworten, z. B. wie räumliche Gradienten in den Adhäsionskräften von Zelle zu Zelle und Zellmatrix dazu beitragen können, das Schicksal der Stammzelldifferenzierung zu organisieren. Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es keine zusätzliche Oberflächenmodifikation erfordert, um zelladhäsive ECM-Muster zu erzeugen, an die sich Zellen anheften können.

Das bedeutet, dass die Methode mit verschiedenen ECM- und Substratkonfigurationen kompatibel ist, die für jede Zelllinie spezifisch sind. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Mikrostrukturierung schwer zu erlernen sind. Denn es erfordert einen präzisen und sorgfältigen Umgang mit der Schablone und den Zellen.

Für dieses Verfahren müssen die PTMS-Schablonen bereits konstruiert und gefertigt werden. Ebenso sollten menschliche EFC-Zellen auf der Basalmembranmatrix wachsen, so dass die Kolonien später im Verfahren für die Aussaat bereit sind. Füllen Sie zunächst eine Schale mit 700 Mikrolitern 70 % Ethanol in analytischer Qualität in ultrareines Wasser.

Legen Sie dann die PDMS-Schablone auf die Lösung und stellen Sie die Schale in eine Biosicherheitswerkstatt, damit sie über Nacht austrocknet. Überprüfen Sie am nächsten Tag, ob sich keine Blasen unter der Schablone gebildet haben. Richten Sie dann die Schale aus, bis die Zellen auf die Schablone ausgesät werden können.

Bereiten Sie ein Aliquot einer Basalmembranmatrix in humaner ESC-Qualität vor, indem Sie 16,7 Milliliter DMF12 hinzufügen, um eine 1,5-fache Lösung herzustellen und auf Eis zu halten. Behandeln Sie das Substrat 90 Sekunden lang mit 100 Watt Sauerstoffplasma. Öffnen Sie die Schale erst, wenn sie sich in der Plasmakammer befindet, und decken Sie sie nach der Behandlung schnell ab.

Diese Behandlung verhindert, dass sich Blasen bilden, wenn das Substrat in Lösung getaucht wird. Bedecken Sie nun die Schablone mit 450 Mikrolitern der vorbereiteten 1,5-fachen Basalmembran-Matrix-Lösung. Verschließen Sie dann die Schale mit Parafilm und inkubieren Sie sie fünf Stunden lang.

Bevor Sie fortfahren, überprüfen Sie die sechs Vertiefungsplatten der vorbereiteten HESC-Kolonien. Identifizieren und aspirieren Sie Kolonien differenzierter Zellen, die ihre typische HESC-Morphologie verloren haben. Sie sollten alle rund erscheinen, eine dicht gepackte Epithelmorphologie haben und ein hohes Kern-zu-Zytoplasma-Verhältnis mit prominenten Nukleolen aufweisen.

Waschen Sie dann jede Vertiefung der plattierten Zellen zweimal mit zwei Millilitern DMF12. Geben Sie nach dem zweiten Waschen einen Milliliter Verdauungsenzyme wie Accutase in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte acht Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Klopfen Sie nach der Inkubation vorsichtig auf die Platte, um alle Kolonien vom Substrat zu lösen.

Spülen Sie anschließend jede Vertiefung mit mindestens vier Millilitern Medium für jeden Milliliter Verdauungsenzym, das auf die Vertiefung aufgetragen wird, und sammeln Sie die Zellsuspensionen in einem einzigen konischen 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 g drei Minuten lang bei Raumtemperatur, um ein Zellpellet zu bilden. Aspirieren Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 400 Mikrolitern HESC-Erhaltungsmedium, ergänzt mit 10 Mikromolaren Gesteinsinhibitor.

Zerreiben Sie die Zellen vorsichtig dreimal, um die Klumpen aufzubrechen. Korrigieren Sie als Nächstes die Dichte der Aufhängungen. Mischen Sie es gut und verdünnen Sie es mit 200 Mikrolitern 1:20 in Medien.

Zählen Sie die Zellen in der Verdünnung mit einem Hämozytometer. Dann wird die Hauptsuspension nach Bedarf mit einem Medium mit Gesteinsinhibitor verdünnt. Um fortzufahren, fügen Sie die erforderliche Anzahl von Zellen auf jede vorbereitete Schablone hinzu.

Es sollte nur eine Monoschicht von Zellen abgelagert werden, verteilen Sie diese also gleichmäßig. Lassen Sie die Schablone fünf Minuten lang ungestört ruhen, damit sich die Zellen absetzen können. Übertragen Sie dann die geladenen Schablonen vorsichtig in einen Inkubator und halten Sie die Schalen während des gesamten Transfers waagerecht.

Lassen Sie die Zellen über eine einstündige Inkubation an den Schablonen anheften. Nachdem Sie die Zellen anheften konnten, untersuchen Sie sie unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie dies richtig getan haben. Übertragen Sie die Schablone zurück auf die Haube und saugen Sie die nicht gebundenen Zellen von der Schablone ab.

Geben Sie anschließend zwei Milliliter 0,5 %-kompatibles nichtionisches Tensid in DMF12 in den Bereich um die Schablone. Schwenke die Lösung, um die Schablone zu bedecken. Ziehe dann mit einer autoklavierten Pinzette die Schablone vorsichtig von der Schale ab.

Nach dem Entfernen der Schablone werden die Mikromusterzellen unter dem Mikroskop untersucht. Das nichtionische Tensid verhindert das Austrocknen dieser Zellen. Lassen Sie die Mikromuster-Zellen 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in der mit Tensiden angereicherten Medienlösung inkubieren.

Saugen Sie die Lösung nach 10 Minuten ab und waschen Sie die Platte dreimal mit zwei Millilitern normalem DMF12-Medium. Nach den Wäschen zwei Milliliter HESC-Erhaltungsmedium mit Gesteinsinhibitor hinzufügen. Untersuchen Sie die Zellen erneut, um zu überprüfen, ob sich die Mikromuster richtig gebildet haben.

Dann inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag aspirieren Sie das Medium, waschen Sie die Zellen einmal mit DMF12 und fügen Sie dann zwei Milliliter ergänztes Differenzierungsmedium hinzu, um die Zellen zu einer Mesoendoderm-Differenzierung zu veranlassen. Analysieren Sie später die Ergebnisse.

Die Herstellung der Zellschablone mit einem Laserschneider lieferte 1000-Mikron-Merkmale. Die Schablone bestand aus einem dünnen Schablonenblatt mit mikrostrukturierten Durchgangslöchern und einer PDMS-Dichtung, die zur Aufnahme der Zellen verwendet wurde. Mit diesem Tool wurden mikropatterierte HESCs während der Mesoendoderm-Differenzierung untersucht.

H9-HESC-Kolonieperipherien weisen höhere Integrin-Adhäsionen auf als Zellen im Inneren der Kolonie. So differenzieren sich die Zellen in brachiäre T-positive Mesoendodermzellen, wenn sie mit activan, BMP4 und FGF2 induziert werden. Wenn solche Zellen in Monoschichten unterschiedlicher Geometrien strukturiert wurden, führten geometrische und isotrope rechte Winkel und konvexe Krümmungen zu einer lokalen Konzentration von Integrin-vermittelten Zugkräften und führten zu einer erhöhten Differenzierung des Mesoendoderms.

Die T-Expressionsintensität an verschiedenen Lokalitäten innerhalb einer einzigen Kolonie zeigte, dass das Ausmaß der Mesoendoderm-Induktion in scharfen Ecken von quadratischen und rechteckigen Kolonien und an den konvexen Krümmungen eines halbkreisförmigen Bogens tatsächlich höher war. Dies zeigt, dass zelladhäsionsvermittelte mechanische Kräfte mit der beschriebenen Methode moduliert werden können. Bevor Sie das Verfahren versuchen, ist es wichtig, die Matrixbeschichtungszeit, den Zellverdau und die Anheftungszeit für die spezifische humane pluripotente Stammzelllinie, mit der Sie arbeiten, zu optimieren.