Tissue Engineering von Intrinsic Vaskularisation in ein In Vivo Tissue Engineering Chamber

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen Raum zu schaffen, in dem das Gewebe gleichzeitig mit der Entwicklung einer robusten Blutversorgung wachsen und sich ausdehnen kann, was letztendlich zur Erzeugung eines vaskularisierten, großen, dreidimensionalen Gewebeblocks führt. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Entwicklung von vaskularisiertem Gewebe für rekonstruktive Zwecke sowie für den Organersatz und die Organreparatur zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das neu erzeugte Gewebe intrinsisch von einem eigenen Gefäßnetz versorgt wird, ohne auf die Diffusion aus der Umgebung angewiesen zu sein, um zu überleben.

Das Verfahren wird von Sue McKay und Liliana Pepe vorgeführt. Betäuben Sie eine Ratte mit einem Gewicht von mindestens 250 Gramm und beurteilen Sie die Narkosetiefe mit einem Zehenkneifen. Wenn die Ratte nicht ansprechbar ist, halten Sie ihre Sedierung mit 2 % Isofluran während des gesamten Eingriffs aufrecht.

Tragen Sie anschließend epsomische Salbe auf die Augen auf. Verwenden Sie dann mit der Ratten-Rückenlage elektrische Rasierer, um die Leiste zu rasieren und die Haare mit angefeuchteter Gaze zu entfernen. Reinigen Sie dann die Operationsstellen mit einer Chlorhexidinlösung, die 70 % Ethanol enthält.

Zum Schluss drapieren Sie das Tier mit sterilen Handtüchern und fahren Sie mit der Operation fort. Machen Sie mit einer Klinge der Nummer 15 einen vier Zentimeter langen Hautschnitt in die linke Leiste parallel zum Leistenband. Schneiden Sie anschließend das freiliegende Leistenfettpolster mit einer Schere umlaufend durch und lassen Sie es an seinem Gefäßstiel befestigt, basierend auf den epigastrischen Gefäßen.

Befreien Sie nun mit einer Mikroschere die filmartigen Bindegewebsverklebungen zwischen der Bauchdecke und den darunter liegenden Oberschenkelgefäßen. Platzieren Sie dann einen Retraktor an der Bauchdecke und ziehen Sie ihn medial, um das Leistenband und die gesamte Länge der Oberschenkelgefäße freizulegen. Anschließend wird die Magenvene mit einer Mikrozange und einer gebogenen Schere präpariert und vom umgebenden Fett isoliert.

Diese Vene fungiert als Haltegurt. Fahren Sie fort, indem Sie die perivaskuläre Schleuse öffnen, in der sich die Femurgefäße und der Nerv befinden. Öffnen Sie es vom Leistenband bis zu seiner Bifurkation distal bis zum Magenast.

An dieser Stelle und während des gesamten Eingriffs ist ein schonender Umgang mit den Femurgefäßen entscheidend. Ihre Schädigung kann zu Thrombosen und zum Scheitern des gesamten Experiments führen. Nehmen Sie dann mit einer Mikrozange die Oberschenkelvene an ihrer Adventitia auf und trennen Sie sie vorsichtig vom umgebenden Gewebe und der begleitenden Arterie.

Fassen Sie bei diesem Schritt nicht die gesamte Dicke der Venenwand an, da dies zu einem Trauma der Intima führen und die Vene anfällig für Thrombosen machen könnte. Auch während dieses Schritts ligatisieren Sie die Seitenäste mit einer 10-0 Nylonnaht oder koagulieren Sie sie mit einem bipolaren Koagulator. Wenn die Oberschenkelvene völlig frei ist, ligieren Sie sie proximal und distal mit 4-0-Seidennähten, um ein Venentransplantat zu erhalten, das mindestens 10 Millimeter lang ist und etwa einen halben Zentimeter des epigastrischen Astes umfasst.

Der Ast dient als Abspannseil, um die Schlaufe in der Kammer offen zu halten. Schneiden Sie dann die Adventitia von den Enden des Transplantats ab. Falls erforderlich, kann dieser Schritt auf die Zeit vor den mikrochirurgischen Anastomosen verschoben werden.

Beenden Sie die Vorbereitung des Venentransplantats, indem Sie es mit heparinisierter Kochsalzlösung spülen und mit heparinisierter Kochsalzlösung beladen ruhen lassen. Verschließen Sie dann die Wunde mit einer durchgehend laufenden 4-0-Seidennaht und zwei oder drei zusätzlichen einfachen unterbrochenen Stichen. Legen Sie zunächst das Leistenband und die gesamte Länge des Femurgefäßes der kontralateralen Extremität frei, wie zuvor gezeigt.

Präparieren und isolieren Sie dann mit einer Mikrozange sowohl die Oberbaucharterie als auch die Vene von der umgebenden Fettpolster. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie das Gewebe von den Gefäßen wegziehen. Fahren Sie fort, indem Sie die Oberschenkelarterie an ihrer Adventitia aufnehmen und vom umgebenden Gewebe befreien.

Ligatieren oder koagulieren Sie dabei die Seitenäste der Arterien. Platzieren Sie dann eine Klemme proximal sowohl auf der Oberschenkelarterie als auch auf der Vene. Ligatieren Sie nun mit einer 4-0-Seidennaht die Oberschenkelarterie und die Vene distal zum Austritt der epigastrischen Gefäße.

Legen Sie nun einen sterilen Kontrasthintergrund aus Kunststoff unter die Gefäße und schneiden Sie jedes Gefäß mit einer scharfen, geraden Mikroschere quer durch. Spülen Sie die Gefäße nach dem Schnitt kräftig mit großzügigen Mengen heparinisierter Kochsalzlösung aus, bis das gesamte Blut aus dem Lumen entfernt wurde. Bringen Sie nun das Venentransplantat in das Operationsfeld.

Positionieren Sie das Venentransplantat so, dass das proximale Ende des Venentransplantats bereit ist, an die Oberschenkelvene des Empfängers anastomosiert zu werden, und das distale Ende an die Oberschenkelarterie des Empfängers. Auf diese Weise kann das Blut von der arteriellen zur venösen Seite fließen, ohne dass die Klappen im Venentransplantat Widerstand leisten. Stellen Sie sicher, dass die Oberschenkelgefäße und das Venentransplantat in ihrer natürlichen Position ohne Verdrehungen ruhen.

Führen Sie mit einer 10-0-Nylonnaht eine chirurgische Anastomose auf beiden Seiten durch. Eine gute und atraumatische mikrochirurgische Anastomose ist das A und O. Eine Schädigung der Gefäßintima, eine Austrocknung der Gefäße oder falsch platzierte Stiche machen die Anastomosenstelle anfällig für Thrombusbildung.

Überprüfen Sie dann an beiden Anastomosenstellen auf Undichtigkeiten. Beheben Sie kleine Lecks, die wie nicht pulsierendes Blut aussehen, das aus der Anastomosenstelle austritt, indem Sie ein kleines Stück Fett oder einen Schwamm darauf legen und fünf bis 10 Minuten lang sanft zusammendrücken. Größere pulsierende Lecks, die schnell das gesamte Feld überfluten, müssen zusätzlich genäht werden.

Überprüfen Sie anschließend die Durchgängigkeit der arteriovenösen Schleife. Ein sanfter Verschluss der Oberschenkelarterie sollte diese schrumpfen lassen. Umgekehrt sollte ein Verschluss der Vena femoralis die Schlinge anschwellen.

Platzieren Sie nun den Boden der Tissue-Engineering-Kammer unter der arteriovenösen Schleife. Achten Sie darauf, dass die Schlaufe in ihrer natürlichen Position ohne Verdrehungen oder Knicke aufliegt. Befestigen Sie dann mit 6-0 Nylon-Nähten die Basis der Kammer am Leistenband und der darunter liegenden Muskelfaszie.

Setze dann den Deckel über den Boden der Kammer. Klemmen Sie die epigastrischen Äste unter den Deckel, um die Schlaufe in Position zu halten. Verschließen Sie dann die Wunde mit einer kontinuierlich laufenden 4-0-Seidennaht sowie zwei oder drei zusätzlichen einfachen unterbrochenen Stichen.

Lassen Sie das Tier schließlich in einem Einzelkäfig von der Narkose genesen und verabreichen Sie eine Einzeldosis Carprofen subkutan als Analgetikum. Bereiten Sie das Tier wie zuvor auf die Operation vor. In eine einzelne Ratte können zwei Kammern implantiert werden, eine in jeder Leiste.

Isolieren Sie dann das Oberschenkelgefäß wie zuvor beschrieben. Nachdem sowohl die Arterie als auch die Vene vollständig vom umgebenden Gewebe befreit und ihre Äste ligiert sind, bringen Sie die Kammer in das Operationsfeld. Setzen Sie dann jedes der intakten Oberschenkelgefäße in die entsprechenden Schlitze des Kammerbodens ein.

Stellen Sie sicher, dass keines der beiden verdreht oder geknickt ist. Schließen Sie anschließend die Kammer, indem Sie den Deckel an der Basis befestigen. Schließen Sie dann die Wunde und lassen Sie das Tier sich wie zuvor beschrieben erholen.

Die mikrochirurgische Erstellung von Tissue-Engineering-Kammern wurde wie beschrieben durchgeführt. Verschiedene Gewebetypen wurden erfolgreich unter Verwendung der in vivo vaskularisierten Kammer hergestellt, darunter Herzgewebe mit neonatalen Ratten-Kardiomyozyten, Muskelgewebe mit Rattenskelett-Myoblasten und Fettgewebe mit Hydrogel, das aus der extrazellulären Matrix des Fettgewebes gewonnen wird. Das Stereologiesystem ermöglicht eine unverzerrte Quantifizierung des spezifischen Gewebevolumens.

So wurden beispielsweise Lektin-gefärbte Endothelzellen in Querschnitten zur Abschätzung des Gefäßvolumens verwendet. Nach der In-vivo-Implantation von Zellen, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert wurden, kann ihr Schicksal verfolgt werden. Zum Beispiel wurden neonatale Kardiomyozyten von Ratten, die mit Farbstoff i markiert waren, drei Tage nach der Implantation in den Gewebekonstrukten nachgewiesen.

Alternativ können speziesspezifische Antikörper verwendet werden, um implantierte Zellen in Xenotransplanationsstudien zu identifizieren. So könnten beispielsweise humaninduzierte pluripotente Stammzellen, die in immungeschwächte Ratten implantiert wurden, in dem aus der Kammer entnommenen Gewebe identifiziert werden. Einmal gemeistert, können die Durchflusskammer und die arteriovenöse Schleife in etwa 20 bzw. 90 Minuten implantiert werden.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Sterilität jederzeit aufrechtzuerhalten und die notwendigen Maßnahmen zu ergreifen, falls es zu einer Kontamination kommt. Vergessen Sie nicht, dass ein schonender Umgang mit den Blutgefäßen und eine atraumatische mikrochirurgische Anastomose der Schlüssel zum Erfolg sind. In diesem Sinne empfehlen wir eine mikrochirurgische Grundausbildung vor dem Versuch dieses Eingriffs, insbesondere für den Aufbau der arteriovenösen Schlinge.