Name: Genome Editing in Astyanax mexicanus Verwendung von Transkriptionsaktivator- artigen Effektor Nukleasen (Talens) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Erfahren Sie die gezielte Genmutagenese mit TALENs bei Astyanax mexicanus zur Untersuchung der genetischen Grundlagen von Höhlenanpassungen. Diese Methode ermöglicht präzise Genomeditierung in der evolutionsbiologischen Forschung.

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Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Genetik, Entwicklung und Zellbiologie und Iowa State University und von NIH Zuschusses EY024941 (WJ) .Dr finanziert. Jeffrey Essner Bemerkungen zu dem Manuskript.

Alle Tier Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Iowa State University und der University of Maryland genehmigt. 1. TALEN Entwurf <ol><li> Eingabe gewünschte Zielsequenz zu einem TALEN Design Website. (Zum Beispiel: <a href="https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen">https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen</a> ). Eingang gewählt Spacer / Wiederholung Array Längen. <ol><li> Kopieren Sie die genomische Sequenz in das Feld mit der Bezeichnung &quot;Sequence&quot;. </li><li> Im Rahmen der &quot;Bereitstellung von benutzerdefinierten Spacer / RVD Lengths&quot; wählen Sie die Registerkarte Distanzlänge und Feldlänge. Hinweis: Distanzlängen von 15 Basenpaaren und wiederholen Array Längen von 15-17 Arbeit gut und machen Montage weniger komplex. </li></ol></li><li> Wählen Sie ein TALEN Paar. TALEN Paare entworfen um einen einzigartigen Ort Restriktionsenzym ermöglichen für die Genotypisierung durch Restriktionsenzym-Verdauungein PCR-Produkt. </li><li> Design - Primer der genomischen Region um die TALEN Zielstelle mit einer Website wie Primer3 30-32 zu verstärken. Wenn sie mit einem Restriktionsenzym, Genotypisierung, design Primer eine Region amplifizieren, die nur einmal die Restriktionsenzymstelle enthält. Es wird empfohlen , dass diese Region amplifiziert wird und vor dem Aufbau TALEN sequenziert keine Polymorphismen in der A. zu identifizieren mexicanus Labor Bevölkerung für die Mikroinjektion verwendet werden. </li></ol> 2. TALEN Assembly (Geändert vom TALEN Kit Protocol) 33,34 Weitere Details und Fehlerbehebung finden Sie das Protokoll 34. <ol><li> Vorbereitung und notwendigen Plasmide aus den TALEN kit-Sequenz nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Eingerichtet, um die # 1-Reaktionen für Reaktionen A und B. repeat-variable Include diresidues (RVDS) 1-10 und der Zielvektor pFUS_A in Reaktion A. einschließen RVDS 11- (N-1) -ten unde Zielvektor pFUS_B (N-1) in Reaktion B, wobei N die Gesamtzahl der in der RVDS TALEN ist. <ol><li> In jeder Reaktion: 1 &amp; mgr; l jedes Plasmids jedes RVD (100 ng / &amp; mgr; l) enthält, den Zielvektor (100 ng / ul), 1 ul Bsa I Restriktionsenzym, 1 &amp; mgr; l Rinderserumalbumin (BSA) (2 mg / ml ), 1 ul Ligase, 2 ul 10fach Ligasepuffer und x &amp; mgr; l Wasser für ein Gesamtvolumen von 20 &amp; mgr; l. Zum Beispiel finden Sie in Tabelle 1. Hinweis: Halbreaktionen können auch verwendet werden. </li><li> Reaktionen in einen Thermocycler und der Zyklus ausgeführt: 10x (37 ° C / 5 min + 16 ° C / 10 min) + 50 ° C / 5 min + 80 ° C / 5 min. </li></ol></li><li> Inkubieren Sie die Reaktionen mit Nuklease. Zu jeder Reaktion hinzufügen 1 ul 25 mM ATP und 1 ul Nuklease. Inkubieren Reaktionen bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Verwandeln Reaktionen. <ol><li> Trans 2,5 ul jeder Reaktion in 25 ul chemisch kompetente Zellen. Hinweis: Selbst gemachte zuständigen cells verwendet werden. Allerdings Zellen mit geringer Kompetenz in Mangel an Kolonien führen. <ol><li> Mischungs 2,5 ul der Reaktion mit 25 &amp; mgr; l chemisch kompetente Zellen. Inkubieren auf Eis für fünf Minuten. Inkubieren der Zellen für 30 sec bei 42 ° C. </li><li> Die Röhrchen auf Eis für 2 min. In 125 ul SOB-Medium mit Katabolitenrepression (SOC). Schütteln der Röhrchen bei 37 ° C für 1 Stunde. </li></ol></li><li> Platte 100 &amp; mgr; l der transformierten Zellen auf LB-Platten mit Spectinomycin (50 ug / ml), X-gal und Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG). Wachsen O / N bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Wählen Sie 2-3 weiße Kolonien für jede Reaktion und prüfen Sie durch Kolonie - PCR unter Verwendung von Primern pCR8_F1 und pCR8_R1 (Tabelle 2). <ol><li> Machen Sie einen Master-Mix der Reagenzien. Zum Beispiel finden Sie in Tabelle 3. </li><li> Wählen Sie eine Kolonie und schmiert sie in den Boden eines PCR-Röhrchen, und setzen Sie dann die Reste der Kolonie in 2 ml LB mit Spectinomycin(50 ug / ml). Legen Sie 15 ul des Master-Mix in das Röhrchen mit der Kolonie. </li><li> Führen Sie das folgende PCR - Programm (Tabelle 4) </li><li> Überprüfen Sie die PCR (das gesamte Volumen laufen) auf einem 1,5% Agarose-Gel durch Elektrophorese. Die richtigen Klone eine Bande bei der erwarteten Größe haben sowie einen Abstrich und eine Leiter von Bands. Ein Beispiel für den entsprechenden Abstrich, siehe 34,33. </li><li> Wachsen 2 ml Kulturen der richtigen Klone in LB-Medien O / N bei 37 ° C in einem Schüttelinkubator. </li></ol></li><li> Miniprep der Plasmide gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Sequenz zu überprüfen TALEN-Sequenz mit pCR8_F1 und pCR8_R1. Folgen zuvor beschriebenen Verfahren 35. </li><li> Unter Verwendung der richtigen Klone durch Sequenzierung verifiziert, stellen Sie die Reaktion # 2 (TALEN Kit) auf, der den RVDS aus den A- und B-Vektoren und die endgültige RVD in den Zielvektor platzieren wird. <ol><li> Vorbereitung Mischung für die Reaktion 2 (Tabelle 5). Hinweis: Half Reaktionen verwendet werden. </li><li> Legen Sie die Reaktionen in einem Thermocycler und führen Sie das folgende Programm: 37 ° C / 10 min + 16 ° C / 15 min + 37 ° C / 15 min + 80 ° C / 5 min. </li></ol></li><li> Verwandeln Reaktionen. <ol><li> Trans 2,5 ul jeder Reaktion in 25 ul chemisch kompetente Zellen. <ol><li> Mischungs 2,5 ul der Reaktion mit 25 &amp; mgr; l chemisch kompetente Zellen. Inkubieren auf Eis für 5 min. Hitzeschock der Zellen für 30 Sekunden bei 42 ° C. </li><li> Die Röhrchen auf Eis. In 125 ul SOC. Die Röhrchen in einem Schüttelinkubator bei 37 ° C für 1 Stunde. </li></ol></li><li> Platte 100 &amp; mgr; l der transformierten Zellen auf LB-Platten mit Ampicillin (100 ug / ml), X-gal und IPTG. Wachsen O / N bei 37 ° C </li></ol></li><li> Wählen Sie 1-3 weiße Kolonien für jede Reaktion und prüfen Sie durch Kolonie - PCR unter Verwendung von Primern TAL_F1 und TAL_R2 (Tabelle 2). <ol><li> Machen Sie eine Lösung der Polymerase Mastermix, Wasser und Primer, wiein Tabelle 3 beschrieben. eine Kolonie Auswahl und in den Boden eines PCR - Röhrchen verschmieren, und setzen Sie dann die Reste der Kolonie in 2 ml LB mit Ampicillin (100 ug / ml). Platzieren 15 ul der Lösung in das Röhrchen mit der Kolonie. </li><li> Führen Sie das PCR - Programm (Tabelle 6). </li><li> Überprüfen Sie die PCR auf einem 1,5% Agarosegel durch Elektrophorese. Die richtigen Klone ein Verschmieren und eine Leiter von Bands haben. Ein Beispiel für den entsprechenden Abstrich, siehe 34,33. </li><li> Wachsen 2 ml Kulturen der richtigen Klone in LB-Medien O / N bei 37 ° C in einem Schüttelinkubator. </li></ol></li><li> Miniprep der Plasmide gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Sequenz zu überprüfen TALEN - Sequenz mit TAL_F1 und TAL_R2 folgenden zuvor 35 beschriebenen Verfahren. </li></ol> 3. mRNA Transkription von Talens <ol><li> Digest 4 ug von sequenzüberprüft Vorlage mit 2 ul Sac I für 2 Stunden bei 37 ° C. </li&gt; <li> Lauf 2 ul der Sac I-verdaute Plasmid auf einem 1,5% Agarosegel durch Elektrophorese. Plasmide, die richtig verdaut werden, wird eine einzelne Bande angezeigt werden soll. </li><li> Reinige den verbleibenden Sac I-verdaute Plasmid nach dem PCR Purification Kit - Protokoll. Wasche zweimal mit der Waschlösung vor der Elution. Eluieren in 30 ul Nuklease-freies Wasser. </li><li> Folgen Sie dem Standardprotokoll für die T3-mRNA-Produktion. <ol><li> Richten Sie die Hälfte Reaktionen 0,5 ug linearisierte Vorlage (oben hergestellt). Inkubieren bei 37 ° C für 2 Stunden. </li><li> In 0,5 ul DNase (im Bausatz enthalten) und Inkubation bei 37 ° C für 15 min. </li></ol></li><li> Reinige die mRNA, nach den Anweisungen des Herstellers. Eluieren in 30 ul Nuklease-freies Wasser. </li><li> Führen Sie einen 1,5% Agarose-Gel durch Elektrophorese der mRNA zu überprüfen. <ol><li> Reinigen Sie die Gel-Apparatur mit einem Produkt RNase Kontamination zu beseitigen und eine 1,2% Gel herzustellen. </li><li> Mix 1 &amp; mgr; l mRNA + 4 &amp;# 181; l Nuklease-freies Wasser + 5 ul Glyoxyl Laden Farbstoff. Inkubieren Proben bei 50 ° C für 30 min. Zentrifugieren Sie die Röhrchen kurz und auf Eis, bevor das Gel läuft. </li></ol></li><li> Überprüfen Sie die Konzentration ein Verfahren zur Quantifizierung von Nukleinsäurekonzentrationen und speichern Sie die RNA in Aliquots bei -80 ° C verwendet wird. Wählen Sie eine aliquote Größe, so dass RNA wird nicht mehr eingefroren / aufgetaut als einmal. Hinweis: Die Konzentrationen von 500-1000 ng / nl sind in der Regel erhalten. RNA mit einer geringeren Konzentration kann so lange verwendet werden, wie RNA-Integrität aufrechterhalten wird (wie durch eine Bande beurteilt eher als ein Abstrich auf dem Gel). </li></ol> 4. Inject Astyanax mexicanus Embry mit TALEN mRNA <ol><li> Bereiten Sie Werkzeuge für die Injektion. <ol><li> Gießen Injektion Platten durch Gießen 1,2% Agarose in Fischwasser (Wasseranlage mit Natriumbicarbonat und Meersalz auf pH 7,4 und die Leitfähigkeit 700 uS) in eine Petrischale. Legen Sie eine Form (Kunststoffteil mit Vorsprüngen Vertiefungen für Fische zu machenEier) im Inneren der Schale. Entfernen Sie die Form, wenn die Agarose bei 4 ° C gehärtet und zu speichern ist. Einzelheiten zu der Form siehe 36. </li><li> Ziehen Nadeln für die Injektion einer Nadel Abzieher nach den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Passende Nadellänge für Injektionszwecke wichtig ist. Nadeln, die zu lang sind, werden für Injektionen zu flexibel sein. Das Protokoll zum Ziehen Nadeln werden mit der Ausstattung variieren verwendeten Nadeln zu ziehen. Ein Beispiel einer geeigneten Nadel wird in 1 gezeigt. Für unsere Ausrüstung, wir ziehen Nadeln , die 5-6 cm lang sind, und einen Außendurchmesser an der Spitze von etwa 0,011 mm , wenn sie gebrochen. Nadeln sollten jedoch kalibriert werden (Schritt 4.3.4) Öffnungsweite zu bestimmen. Ein Beispielprogramm Nadeln zum Ziehen in Tabelle 7 zu finden. </li><li> Bereiten Glaspipetten für Embryotransfer durch die Pipette zu brechen, so dass die Öffnung groß genug ist, um ein Ei durch. Flamme das gebrochene Ende bises ist nicht mehr scharf. Hinweis: Es ist wichtig , Glaspipetten und Glasschalen zu verwenden , wenn sie mit A. Arbeits mexicanus Eier und Embryonen , wie sie sind klebrig und wird Kunststoff haften. </li></ol></li><li> Sammeln Sie 1-Zell-Stadium Eier. <ol><li> Rasse A. mexicanus nach Standardprotokollen 37. Hinweis: Wenn zum Beispiel Fisch auf einem 14 Licht gehalten werden: 10 Dunkel-Zyklus und mit Zeitgerber Zeit (ZT) mit ZT0 als Lichter an und ZT14 als Licht aus, unsere Oberflächen Fischlaich zwischen ZT15 und ZT19. Genaue Laichzeit ist für jeden einzelnen Labor bestimmt werden. </li><li> Induce Laich von Fisch für 3-4 Tage vor der Paarung überfüttert und Fische in Süßwasser platzieren. Erhöhen Sie die Temperatur 2 ° F. Hinweis: Unsere anfängliche Wassertemperatur liegt bei etwa 74 ° C. </li><li> Sammeln Oberfläche Fischeier im Dunkeln, alle 15 min Kontrolle Eier an der 1-Zellstadium zu erhalten. Hunderte von Eiern aus einem einzigen Paar von Oberflächen Fisch erhalten werden. </li><li> Sammelnin Glasschalen Eier kleben an Kunststoffoberflächen zu verhindern und zu sortieren Embryonen in der 1-Zellstadium vor der Injektion zu isolieren, indem Eier unter dem Mikroskop und sammeln Eier, die eine einzelne Zelle beobachten. Halten Sie Eier in frischem Systemwasser (Tank Wasser, in dem erwachsene Fische untergebracht sind, die für pH-Wert und Leitfähigkeit behandelt wurde). </li></ol></li><li> Injizieren TALEN mRNA. <ol><li> Injizieren Sie unterschiedliche Mengen an Gesamt-mRNA (gleiche Mengen von jedem TALEN im Paar) die optimale Konzentration zur Injektion, um zu bestimmen, wie Toxizität und Wirksamkeit von TALEN Paar variieren. Beginnen Sie mit Konzentrationen von Gesamt-mRNA Injektion, die 400-800 pg sind. Verdünnen und kombinieren mRNA, um die gewünschten Konzentrationen zur Injektion von 1,5 nl. </li><li> Laden verdünnte mRNA in die Rückseite der Nadel und befestigen Sie die Nadel in einem Mikro Injektor. </li><li> Brechen Sie die Nadel mit einer Pinzette. </li><li> Kalibrieren Sie die Nadel. Beispielsweise 10 mal auswerfen und die sich ergebende Abfall in einer Mikrokapillare sammeln. Für 10 x 100 Einweg-1.081; l, 32 mm Mikrokapillare, der Tropfen sollte die Mikrokapillare bis 0,5 mm für 1,5 nl / 1 Injektion zu füllen. Stellen Sie die Einspritzzeit und Druck nach Bedarf. </li><li> Führen Sie die Nadel in die einzelne Zelle und injizieren, um die mRNA. Injizieren Sie die mRNA direkt in die Zelle, nicht in den Dotter. </li><li> Sammeln Sie injizierten Embryonen in Glasschalen. Halten Embryonen bei 23-25 ​​° C. Entfernen Sie tote Embryonen (Embryonen, die trüb und unregelmäßig geformte) regelmäßig für die ersten paar Tage nach der Injektion. Eine Rekordzahl von toten und deformierten Embryonen aus Kontrolle (ohne Injektion) und injiziert Platten. Hinweis: Erhöhte mRNA-Konzentration zu erhöhter Toxizität und Deformierung / Tod von Embryonen führen kann. Somit muss die Toxizität gegenüber Effizienz ausgeglichen werden, um die beste Konzentration der mRNA zu bestimmen, zu injizieren. </li></ol></li></ol> 5. Phänotyps Gründer Fisch und TALEN Effizienz auswerten <ol><li> Sacrifice Embryonen nach dem institutionellen Tier Protokoll. Hinweis: Wir einschläferndurch schnelle Embryonen auf Eis schmetternd. </li><li> Sammeln Embryonen in 0,8 ul PCR-Streifen Röhrchen eine Transferpipette. Hinweis: Die Genotypisierung kann auf einzelne Embryonen oder Pools von Embryonen durchgeführt werden. </li><li> Extrakt DNA. <ol><li> Ort Embryonen in 100 ul 50 mM Natriumhydroxid (NaOH) und 30 min bei 95 ° C inkubieren, dann kühlen auf 4 ° C. </li><li> Hinzufügen 1/10 Volumen (10 ul) von 1 M Tris-HCl pH 8. </li></ol></li><li> Durchführen einer PCR auf die Region unter Verwendung der in Schritt entwickelt Primern 1.3 (siehe Tabellen 8 und 9 für die Probenprotokolle). Für einzelne Embryonen 1 ul DNA für die PCR-Reaktion ausreichend. </li><li> Digest das resultierende PCR-Produkt mit dem geeigneten Restriktionsenzym und führen ein 1,5% Agarosegel durch Elektrophorese. <ol><li> Beispielsweise für die Genotypisierung die oculocutaneous Albinismus 2 (OCA2) locus in injizierten Embryonen verdauen das PCR Produkt das Restriktionsenzym Bsr unter Verwendung von I 0 Zugabe0,5 ul Bsr I direkt auf 12,5 &amp; mgr; l der PCR - Reaktion fertiggestellt, für 2 Stunden bei 65 ° C inkubiert. Führen Sie das unverdaute und das verdaute Produkt auf einem Gel. Restriktionsenzym beständigen Bands (dh Bänder, die nicht verdauen) zeigen , dass TALEN-induzierten Mutationen vorhanden sind (Abbildung 2). </li></ol></li><li> (Optional) Berechnen Rate Prozentsatz Mutation durch den Prozentsatz der ungeschnittenen Produkt Bestimmung von Bildern von Gelen in Fidschi 38 Analyse der Gel - Analyse - Tool mit dem Intensitätswert jedes Bandes zu berechnen , wie zuvor 29 beschrieben. </li><li> Bestimmen Sie die Sequenz von mutierten Allelen durch TA das Gel gereinigt Restriktionsenzym resistente Mutante Band Klonierung und Sequenzierung Klone. <ol><li> Gel reinigt das Restriktionsenzym resistente Mutante Bande nach den Anweisungen des Herstellers. TA klonen die Band nach den Anweisungen des Herstellers. Pick-Kolonien und wachsen in 1,5 ml LB O / N bei 37 ° C in einem geschütteltenInkubator. </li><li> Miniprep Kulturen den Anweisungen des Herstellers folgen. Senden Sie die DNA für die Sequenzierung. </li><li> Mit einem Programm wie Menschenaffe, richten Sie die mutierten Sequenzen zu der Wildtyp-Sequenz. <ol><li> Kopieren Sie beide Sequenzen in ApE Dateien. Wählen Sie die &quot;Align zwei Sequenzen&quot; Werkzeug aus dem Menü &quot;Extras&quot;. </li><li> Geben Sie die beiden DNA-Sequenzen, die die Drop-Down-Menüs. Anmerkung: Die umgekehrte Komplement der klonierten Sequenz müssen die PCR ging in den Klonierungsvektor abhängig von der Richtung verwendet werden. Wenn die Sequenzen nicht fluchten, wiederholen Sie die Schritte, die &quot;Rev-Com&quot; in der Gruppe &quot;Align DNA&quot; Kästchens. </li></ol></li></ol></li><li> Gründer Fisch für Phänotypen bei geeigneten Zeitpunkt und unter Verwendung geeigneter Methoden für den erwarteten Phänotyp 29 (Beispiel : Abbildung 3) auswerten. Verfahren zur Phänotypisierung wird auf dem erwarteten Phänotyp für das Gen durch den Forscher mit Hilfe der Protoc gezielt basierenol. </li></ol> 6. Bildschirm Germline Transmission Anmerkung: A. mexicanus Geschlechtsreife bei 4-8 Monaten erreichen. <ol><li> Überqueren Sie sexuell reifen Gründer Fisch zu Wildtyp-Fisch. </li><li> Screen - Embryonen oder ausgewachsene Fische unter Verwendung von Verfahren in den Schritten 5,1-5,7 (Abbildung 4). Für erwachsene Fisch, kann ein Stück des Schwanzes folgenden anesthetization abgeschnitten. <ol><li> Anästhesieren Fisch von Fisch in einer Lösung von Tricaine (3-Aminobenzoesäure-ethylester) Eintauchen Stress während fin Abschneiden zu reduzieren. Nach Finne Clipping, erlauben Fische in Süßwasser zu erholen. Fisch erholen sich schnell; beobachten, bis sie gewonnen haben (schwimmen normalerweise). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Protas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+cavefish+reveals+molecular+convergence+in+the+evolution+of+albinism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism.</a> Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).</li>
<li>Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+amino+acid+mutation+contributes+to+adaptive+beach+mouse+color+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A single amino acid mutation contributes to adaptive beach mouse color pattern.</a> Science. 313 (5783), 101-104 (2006).</li>
<li>Chan, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+evolution+of+pelvic+reduction+in+sticklebacks+by+recurrent+deletion+of+a+Pitx1+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer.</a> Science. 327 (5963), 302-305 (2010).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+specific+modifications+of+the+Drosophila+genome+by+means+of+an+easy+TALEN+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Efficient and specific modifications of the Drosophila genome by means of an easy TALEN strategy.</a> J Genet Genomics. 39 (5), 209-215 (2012).</li>
<li>Bannister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALENs+mediate+efficient+and+heritable+mutation+of+endogenous+genes+in+the+marine+annelid+Platynereis+dumerilii%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">TALENs mediate efficient and heritable mutation of endogenous genes in the marine annelid Platynereis dumerilii.</a> Genetics. 197 (1), 77-89 (2014).</li>
<li>Lei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+gene+disruption+in+Xenopus+embryos+using+engineered+transcription+activator-like+effector+nucleases+%28TALENs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted gene disruption in Xenopus embryos using engineered transcription activator-like effector nucleases (TALENs).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17484-17489 (2012).</li>
<li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li>
<li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+gene+targeting+in+zebrafish+using+customized+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).</li>
<li>Ansai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+mutagenesis+in+medaka+using+custom-designed+transcription+activator-like+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted mutagenesis in medaka using custom-designed transcription activator-like effector nucleases.</a> Genetics. 193 (3), 739-749 (2013).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+doublesex-+and+mab-3-related+transcription+factor+6+and+its+involvement+in+spermatogenesis+in+tilapia%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Isolation of doublesex- and mab-3-related transcription factor 6 and its involvement in spermatogenesis in tilapia.</a> Biol Reprod. 91 (6), 136(2014).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
<li>Gross, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+origin+of+Astyanax+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">The complex origin of Astyanax cavefish.</a> BMC Evol Biol. 12, 105(2012).</li>
<li>Wilkens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+genetics+of+epigean+and+cave+Astyanax+fasciatus+%28Characidae%2C+Pisces%29+-+support+for+the+neutral+mutation+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces) - support for the neutral mutation theory.</a> Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).</li>
<li>Teyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+differences+in+neuromasts+of+the+blind+cave+fish+Astyanax+hubbsi+and+the+sighted+river+fish+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Evol%22%5BJournal%5D)">Morphological differences in neuromasts of the blind cave fish Astyanax hubbsi and the sighted river fish Astyanax mexicanus.</a> Brain Behav Evol. 35 (1), 23-30 (1990).</li>
<li>Schemmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetische+Untersuchungen+zur+Evolution+des+Geschmacksapparates+bei+cavernicolen+Fischen%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Zool+Syst+Evolutionforsch%22%5BJournal%5D)">Genetische Untersuchungen zur Evolution des Geschmacksapparates bei cavernicolen Fischen.</a> Z Zool Syst Evolutionforsch. 12, 196-215 (1974).</li>
<li>Burchards, H., Dolle, A., Parzefall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggressive+behavior+of+an+epigean+population+of+Astyanax+mexicanus+%28Characidae%2C+Pisces%29+and+some+observations+of+three+subterranean+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Processes%22%5BJournal%5D)">Aggressive behavior of an epigean population of Astyanax mexicanus (Characidae, Pisces) and some observations of three subterranean populations.</a> Behavioral Processes. 11, 225-235 (1985).</li>
<li>Parzefall, J., Fricke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alarm+reaction+and+schooling+in+population+hybrids+of+Astyanax+fasciatus+%28Pisces%2C+Characidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Memoires+e+Biospeologie%22%5BJournal%5D)">Alarm reaction and schooling in population hybrids of Astyanax fasciatus (Pisces, Characidae).</a> Memoires e Biospeologie. , 29-32 (1991).</li>
<li>Schemmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+Genetics+of+Feeding+Behavior+in+the+Cave+Fish+Astyanax+mexicanus+F.+anoptichthys%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Tierpsychol%22%5BJournal%5D)">Studies on the Genetics of Feeding Behavior in the Cave Fish Astyanax mexicanus F. anoptichthys.</a> Z. Tierpsychol. 53, 9-22 (1980).</li>
<li>Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocortin+4+receptor+mutations+contribute+to+the+adaptation+of+cavefish+to+nutrient-poor+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9668-9673 (2015).</li>
<li>Protas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-trait+evolution+in+a+cave+fish%2C+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+Dev%22%5BJournal%5D)">Multi-trait evolution in a cave fish, Astyanax mexicanus.</a> Evol Dev. 10 (2), 196-209 (2008).</li>
<li>Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Mc1r+in+the+parallel+evolution+of+depigmentation+in+independent+populations+of+the+cavefish+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus.</a> PLoS Genet. 5 (1), e1000326(2009).</li>
<li>Yoshizawa, M., Yamamoto, Y., O'Quin, K. E., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+an+adaptive+behavior+and+its+sensory+receptors+promotes+eye+regression+in+blind+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of an adaptive behavior and its sensory receptors promotes eye regression in blind cavefish.</a> BMC Biol. 10, 108(2012).</li>
<li>Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+genetic+analysis+of+retinal+degeneration+in+the+blind+cavefish+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish Astyanax mexicanus.</a> PLoS One. 8 (2), 57281(2013).</li>
<li>Kowalko, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+in+feeding+posture+occurs+through+different+genetic+loci+in+independently+evolved+cave+populations+of+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Convergence in feeding posture occurs through different genetic loci in independently evolved cave populations of Astyanax mexicanus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), 16933-16938 (2013).</li>
<li>Kowalko, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Schooling+Behavior+in+Cavefish+through+Sight-Dependent+and+Sight-Independent+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of Schooling Behavior in Cavefish through Sight-Dependent and Sight-Independent Mechanisms.</a> Curr Biol. , (2013).</li>
<li>Gross, J. B., Krutzler, A. J., Carlson, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+craniofacial+changes+in+blind+cave-dwelling+fish+are+mediated+by+genetically+symmetric+and+asymmetric+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Complex craniofacial changes in blind cave-dwelling fish are mediated by genetically symmetric and asymmetric loci.</a> Genetics. 196 (4), 1303-1319 (2014).</li>
<li>Yamamoto, Y., Stock, D. W., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signalling+controls+eye+degeneration+in+blind+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signalling controls eye degeneration in blind cavefish.</a> Nature. 431 (7010), 844-847 (2004).</li>
<li>Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+benefit+of+albinism+in+Astyanax+cavefish%3A+downregulation+of+the+oca2+gene+increases+tyrosine+and+catecholamine+levels+as+an+alternative+to+melanin+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis.</a> PLoS One. 8 (11), e80823(2013).</li>
<li>Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+using+TALENs+in+blind+Mexican+Cavefish%2C+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus.</a> PLoS One. 10 (3), e0119370(2015).</li>
<li>Primer3 v. 0.4.0. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ ">http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ </a> (2015).</li>
<li>Untergrasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B. C., Remm, M., Rozen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3-+new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3- new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Res. 40 (15), 115(2012).</li>
<li>Koressaar, T., Remm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancements+and+modifications+of+primer+design+program+Primer3%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Enhancements and modifications of primer design program Primer3.</a> Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).</li>
<li>Cermak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+design+and+assembly+of+custom+TALEN+and+other+TAL+effector-based+constructs+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 82(2011).</li>
<li>Addgene. Golden TALEN assembly. , Available at: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf">https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf</a> (2011).</li>
<li>Addgene. Sequencing TALENs. , Available at: <a target="_blank" href="http://www.addgene.org/static/cms/filer_public/eb/d2/ebd246f3-db1e-499c-85ce-f79c023a726f/sequencing_talens.pdf">http://www.addgene.org/static/cms/filer_public/eb/d2/ebd246f3-db1e-499c-85ce-f79c023a726f/sequencing_talens.pdf</a> (2012).</li>
<li>Weinberg, E. A device to hold zebrafish embryos during microinjection. ZFIN Protocol Wiki. , Available at: <a target="_blank" href="https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection">https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection</a> (2009).</li>
<li>Hinaux, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+staging+table+for+Astyanax+mexicanus+surface+fish+and+Pachon+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish.</a> Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Bitinaite, J., Wah, D. A., Aggarwal, A. K., Schildkraut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FokI+dimerization+is+required+for+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FokI dimerization is required for DNA cleavage.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10570-10575 (1998).</li>
<li>Elipot, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+the+enzyme+monoamine+oxidase+explains+part+of+the+Astyanax+cavefish+behavioural+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A mutation in the enzyme monoamine oxidase explains part of the Astyanax cavefish behavioural syndrome.</a> Nat Commun. 5, 3647(2014).</li>
<li>McGaugh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cavefish+genome+reveals+candidate+genes+for+eye+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss.</a> Nat Commun. 5, 5307(2014).</li>
<li>Yoshizawa, M., Goricki, S., Soares, D., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+a+behavioral+shift+mediated+by+superficial+neuromasts+helps+cavefish+find+food+in+darkness%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness.</a> Curr Biol. 20 (18), 1631-1636 (2010).</li>
<li>Blackburn, P. R., Campbell, J. M., Clark, K. J., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR+system--keeping+zebrafish+gene+targeting+fresh%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">The CRISPR system--keeping zebrafish gene targeting fresh.</a> Zebrafish. 10 (1), 116-118 (2013).</li>
<li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li>
<li>Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+homologous+recombination-mediated+genome+engineering+in+zebrafish+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases.</a> Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).</li>
<li>Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas9+vector+system+for+tissue-specific+gene+disruption+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish.</a> Dev Cell. 32 (6), 756-764 (2015).</li>
<li>Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+for+the+lens+in+cave+fish+eye+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Central role for the lens in cave fish eye degeneration.</a> Science. 289 (5479), 631-633 (2000).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Große Fortschritte wurden in den letzten Jahren zum Verständnis der genetischen Grundlage der Entwicklung der Merkmale vorgenommen. Während Kandidatengene die Entwicklung einer Reihe von Merkmalen zugrundeliegenden identifiziert wurden, ist es schwierig geblieben , diese Gene in vivo zu testen , aufgrund des Fehlens von genetischen Lenkbarkeit der meisten evolutionarily interessante Arten. Hier berichten wir über ein Verfahren zur Genom Bearbeitung in A. mexicanus, eine Spezies verwendet , um die Evolu...

die genetische Basis der Trait Evolution zu verstehen, ist ein kritischer Forschungsziel von Evolutionsbiologen. Es wurden beträchtliche Fortschritte bei der Identifizierung von Loci zugrunde liegenden , die Entwicklung von Merkmalen und Ortung Kandidatengene innerhalb dieser Loci (zB 1-3) hergestellt. Allerdings Funktionsprüfung die Rolle dieser Gene so viele Organismen, die für die Untersuchung der Evolution von Merkmalen verwendet geblieben ist herausfordernd sind derzeit nicht genetisch manipulierbaren. Das Aufkommen der Genome Editing-Technologien hat sich stark genetische Manipulierbarkeit von einem breiten Spektrum von Organismen erhöht. Transkriptionsaktivator-like Effektor Nukleasen (TALENS) und gruppierten regelmäßig kurzen palindromischen Repeats (CRISPRs) voneinander beabstandete haben gezielte Mutationen in Gene in einer Anzahl von Organismen zu erzeugen , verwendet (beispielsweise 4-11). Diese Werkzeuge, angewandt auf eine evolutionär relevante System, haben das Potenzial, die Art und Weise Evolutionsbiologen die genetische Grundlage der Evolution studieren, um zu revolutionieren. Astyanax mexicanus ist eine Art der Fische, die in zwei Formen existiert: A. ein Fluss lebende Oberflächenform (surface Fisch) und mehrere höhlenbewohnenden Formen (cavefish). mexicanus cavefish von Oberflächenfische Vorfahren ( zusammengefasst in 12) entwickelt. Populationen von cavefish haben eine Reihe von Merkmalen , einschließlich Verlust von Augen, verringern oder Verlust der Pigmentierung entwickelt hat , eine erhöhte Anzahl von Geschmacksknospen und Schädelneuromasten und Veränderungen im Verhalten wie Verlust des Ausbildungsverhalten, erhöhte Aggression, Veränderungen in der Fütterung Haltung und hyperphagia 13 -19. Cavefish und Oberflächenfische sind interfertile und genetische Kartierung Experimente durchgeführt wurden Loci und Kandidatengene für Höhlen Züge 1,20-26 zu identifizieren. Einige Kandidatengene wurden für eine funktionelle Rolle in einen Beitrag zur Höhle Züge in der Zellkultur 1,19, in Modellorganismen anderer Arten 21 oder durch die Überexpression 27 oder transiente Knockdown u getestetMorpholinos 28 in A. singen mexicanus. Jedoch hat jedes dieser Verfahren Grenzen. Die Fähigkeit mutanten Allele dieser Gene in A. zu erzeugen mexicanus ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis ihrer Funktion in der Entwicklung der cavefish. Somit A. mexicanus ist ein idealer Kandidat Organismus für die Anwendung der Genombearbeitungstechnologien. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Genom Bearbeitung in A. mexicanus mit Talens. Dieses Verfahren kann verwendet werden mosaic injizierten Gründer Fisch für Phänotypen zu bewerten und für Linien von Fischen mit stabilen Mutationen in Genen von Interesse 29 zu isolieren.

<table><tbody><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injektionsstation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelapparat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nadelabzieher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td> Company</td><td>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Supplies</td>Hinweis: Soweit wir wissen, können Verbrauchsmaterialien von verschiedenen Firmen verwendet werden, sofern nicht anders angegeben. Golden Gate TALEN und TAL Effector Kit 2.0 Addgene Kit #1000000024 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents LB Agar, Miller (granuliert)</td><td>Fisher</td><td>BP9724-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Mikrobiologie Medien: LB Broth, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Teknova TET-15 in 50% EtOH</td><td>Teknova (bestellt über Fisher)</td><td>50-843-314</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin Dihydrochlorid, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP2957-1</td><td></td></tr><tr><td>Super Ampicillin (1.000x Lösung)</td><td>DNA Technologies</td><td>6060-1</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific X-Gal Lösung, gebrauchsfertig</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (bestellt über Fisher)</td><td>FERR0941</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP1620-1</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Fisher</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>BsaI</td><td>New England Biolabs (bestellt über Fisher)</td><td>50-812-203</td><td>Verwenden Sie BsaI, nicht BsaI-HF (wie im Golden Gate TALEN- und TAL-Effektor-Kit-Protokoll beschrieben)</td></tr><tr><td>BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>wird mit Restriktionsenzymen</td><td></td>versorgt</tr><tr><td>10x T4-Ligase-Puffer</td><td>Promega (bestellt über Fisher)</td><td>PR-C1263</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix</td><td>Promega (bestellt über Fisher)</td><td>PRM7123</td><td>Andere Taq können verwendet werden, aber die Reaktion sollte entsprechend angepasst werden</td></tr><tr><td>Quick Ligation Kit</td><td>New England Biolabs (bestellt über Fisher)</td><td>50-811-728</td><td>Wir verwenden Quick Ligase für alle TALEN-Assemblierungsreaktionen</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemisch kompetente E.coli</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-06</td><td>Andere chemisch kompetente Zellen oder hausgemachte kompetente Zellen können verwendet werden</td></tr><tr><td>Esp 3I</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (bestellt über Fisher)</td><td>FERER0451</td><td></td></tr><tr><td>Plasmidsicheres ATP-abhängiges DNase-Epizentrum</td><td>(bestellt über Fisher)</td><td>NC9046399</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Das Qiagen Kit sollte für die anfängliche Plasmidvorbereitung verwendet werden (wie im Protokoll des Golden Gate TALEN und TAL Effector Kit beschrieben)</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose</td><td>BioExpress</td><td>E-3119-125</td><td></td></tr><tr><td>Sac I</td><td>Promega (Bestellt über Fisher)</td><td>PR-R6061</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T3 Transkriptionskit</td><td>Ambion</td><td>AM1348M</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy MinElute Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax-Gly Probenladefarbstoff&nbsp;</td><td>Ambion (bestellt über Fisher)</td><td>AM8551</td><td></td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Decon (bestellt über Fisher)</td><td>04-355-32</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Einweg-Soda-Limetten-Glas Pasteur Pipets</td><td>Fisher</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Standard Glaskapillaren</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokappen</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Microloader Spitzen für Femtojet Microinjector</td><td>Eppendorf (bestellt über Fisher)</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr></tbody></table>

genome editing in<em&gt; astyanax mexicanus</em&gt; verwendung von transkriptionsaktivator- artigen effektor nukleasen (talens)

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Die Identifizierung von Genen, die evolutionären Veränderungen zugrunde liegen, ist wichtig, um zu verstehen, wie und warum Evolution stattfindet. Zu diesem Zweck haben sich viele neuere Arbeiten auf die Identifizierung von Kandidatengenen für die Evolution von Merkmalen in einer Vielzahl von Arten konzentriert. Bis vor kurzem war es jedoch eine Herausforderung, interessante Kandidatengene funktionell zu validieren. Neu entwickelte Werkzeuge für die Gentechnik ermöglichen es, bestimmte Gene in einer Vielzahl von Organismen zu manipulieren. Die Anwendung dieser Technologie in evolutionär relevanten Organismen wird einen noch nie dagewesenen Einblick in die Rolle von Kandidatengenen in der Evolution ermöglichen. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) ist eine Fischart, die sowohl an der Oberfläche als auch in Höhlen lebt. Aus den angestammten Oberflächenfischen haben sich mehrere unabhängige Linien höhlenbewohnender Formen entwickelt, die untereinander und mit Oberflächenfischen fruchtbar sind, was die Aufklärung der genetischen Grundlagen von Höhlenmerkmalen ermöglicht. A. mexicanus wurde für eine Reihe von Evolutionsstudien verwendet, einschließlich der Kopplungsanalyse, um Kandidatengene zu identifizieren, die für eine Reihe von Merkmalen verantwortlich sind. Somit ist A. mexicanus ein ideales System für die Anwendung von Genome Editing, um die Rolle von Kandidatengenen zu testen. Hier berichten wir über eine Methode zur Verwendung von Transkriptionsaktivator-ähnlichen Effektornukleasen (TALENs), um Gene in Oberflächen-A. mexicanus zu mutieren. Genome Editing mit TALENs in A. mexicanus wurde verwendet, um Mutationen in Pigmentierungsgenen zu erzeugen. Diese Technik kann auch verwendet werden, um die Rolle von Kandidatengenen für eine Reihe anderer Merkmale zu bewerten, die sich in Höhlenformen von A. mexicanus entwickelt haben.

TALEN Paar Injektionen Ergebnis der RVDS an spezifische DNA - Nukleotide in der Bindung und damit die Dimerisierung von FokI - Domänen, in Doppelstrangbrüche 39 führt , die durch nicht-homologe Ende repariert werden kann Beitritt (NHEJ). NHEJ führt häufig Fehler, die in Insertionen oder Deletionen (indels) zur Folge haben. Indels kann durch Amplifizieren der Region um die Website TALEN Ziel identifiziert werden, und das resultierende Amplikon mit einem Restriktionsenz...

Gene-Targeting-Mutagenese ist nun möglich, in einem breiten Spektrum von Organismen unter Verwendung von Genom Bearbeitungstechniken. Hier zeigen wir ein Protokoll für eine gezielte Genmutagenese mit Talens (Talens) in Astyanax mexicanus, Fischarten , die Oberflächenfische und cavefish enthält.

Genome Editing in<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Verwendung von Transkriptionsaktivator- artigen Effektor Nukleasen (Talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Mutationen in spezifische Gene des Höhlenfisches Astyanax mexicanus einzuführen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Evolutionsbiologie zum genetischen Grundlage der Evolution von Höhleneigenschaften zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass nun die Auswirkung des Verlusts eines bestimmten Gens in Astyanax mexicanus getestet werden kann.Nachdem Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektor-Nukleasen oder TALENs gemäß dem Textprotokoll entworfen und zusammengesetzt wurden, verwenden Sie zwei Mikroliter Sac1, um vier Mikrogramm sequenzverifizierter Vorlage bei 37 Grad Celsius zwei Stunden lang zu verdauen. Führen Sie zwei Mikroliter der mit Sac1 verdauten Plasmid-DNA in einem 1,5-prozentigen Agarosegel durch und überprüfen Sie das Vorhandensein einer einzelnen Bande, um den Verdau zu verifizieren. Um die T3-mRNA-Produktion durchzuführen, verwenden Sie 0,5 Mikrogramm linearisierter Vorlage, um halbe Reaktionen gemäß einem Standardprotokoll einzurichten.Inkubieren Sie zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Anschließend 0,4 Mikroliter DNase hinzufügen und 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Reinigung der mRNA zur Überprüfung der Qualität ein Produkt verwenden, das RNase-Kontaminationen beseitigt, um die Gelelektrophorese-Ausrüstung zu reinigen.Dann bereiten Sie ein eins Komma zwei Prozentiges Gel vor. Mischen Sie ein Mikroliter der mRNA, vier Mikroliter nukleasefreies Wasser und fünf Mikroliter Glyoxal-Ladefarbstoff. Inkubieren Sie die Proben bei 50 Grad Celsius für 30 Minuten.Die Röhrchen dann kurz zentrifugieren und vor dem Laufenlassen des Gels auf Eis stellen. Nach Überprüfung der mRNA-Konzentration Aliquots anlegen, bevor die Proben bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Weitere Einzelheiten finden sich im textbasierten Protokoll.Nachdem die Injektionsnadeln und Platten gemäß dem Textprotokoll vorbereitet wurden, induzieren Sie die Fortpflanzung bei A.mexicanus, indem Sie die Fische drei bis vier Tage vor der Zucht überfüttern und sie anschließend ins Frischwasser setzen. Erhöhen Sie die Wassertemperatur um zwei Grad Fahrenheit auf etwa 76 Grad Celsius. Überprüfen Sie alle 15 Minuten im Dunkeln, ob Eier der Oberflächenfische vorhanden sind, und transferieren Sie diese in Glasgefäße, um zu verhindern, dass sie an der Oberfläche haften bleiben.Aus einem einzigen Paar von Oberflächenfischen können Hunderte von Eiern gewonnen werden. Unter dem Mikroskop die isolierten Eier sortieren und diejenigen im Einzelzellstadium in frisches Systemwasser überführen. Die verdünnte mRNA in den hinteren Teil der Nadel laden und die Nadel an einen Mikroinjektor anschließen.Danach die Nadel mit einer Pinzette brechen. Zum Kalibrieren der Nadel 10-mal injizieren und den entstehenden Tropfen in einer Mikroküvette auffangen. Der Tropfen sollte eine 10 × 100 mm Einweg-Mikroküvette mit einem Volumen von einem Mikroliter und einer Länge von 32 Millimetern bis auf null Komma fünf Millimeter pro ein Komma fünf Nanoliter-Injektion füllen.Bringen Sie nun die Nadel in die einzelne Zelle ein und injizieren Sie die mRNA. Sammeln Sie die injizierten Embryonen in Glasgefäßen und inkubieren Sie sie bei 23 bis 25 Grad Celsius. Entfernen Sie in den ersten Tagen nach der Injektion regelmäßig tote Embryonen.Zählen Sie die Anzahl der toten und missgebildeten Embryonen auf den nicht injizierten Kontrollplatten und den injizierten Platten. Weitere Einzelheiten finden Sie im Textprotokoll. Nach der Tötung der Fische gemäß dem IACUC-Protokoll Ihrer Einrichtung sammeln Sie die Embryonen zur DNA-Extraktion in 100 Mikroliter 50 Millimolar Natriumhydroxid und inkubieren sie bei 95 Grad Celsius für 30 Minuten.Dann auf vier Grad Celsius abkühlen. Einem Zehntel des Volumens einmolares Tris-HCl, pH 8, zu den abgekühlten Embryonen hinzufügen. Anschließend PCR mit Primern durchführen, beispielsweise für das Oculocutaneous Albinism Two- oder OCA2-Gen.Für einzelne Embryonen ist ein Mikroliter DNA ausreichend für die PCR-Reaktion. Um den OCA2-Lokus zu genotypisieren, verwenden Sie das Restriktionsenzym DSR1, um das resultierende PCR-Produkt zu verdauen, indem Sie null Komma fünf Mikroliter Enzym direkt zu zwölf Komma fünf Mikrolitern der abgeschlossenen PCR-Reaktion hinzufügen. Nach einer zweistündigen Inkubation bei 65 Grad Celsius führen Sie die Reaktion sowie eine Probe des undigesteden PCR-Produkts auf einem ein Komma fünf Prozentigen Agarosegel durch.Führen Sie zusätzliche Analysen gemäß dem Textprotokoll durch. TALEN-Injektionen können Doppelstrangbrüche in der DNA verursachen, die durch nicht-homologe Endverknüpfung repariert werden können, jedoch auch Insertionen oder Deletionen, sogenannte INDELs, einführen können. Mithilfe einer PCR-basierten Restriktionsverdauung, die auf den Spacer-Bereich der TALEN abzielt, können INDELs durch das Vorhandensein eines restriktionsenzymresistenten Bandes identifiziert werden.TALEN-Injektionen können biallele Genmutationen bei A.mexicanus hervorrufen, sodass einige Phänotypen bereits in den Founder-Fischen bewertet werden können. Beispielsweise wurde das Gen OCA2, von dem vermutet wird, dass es für die Albinismus bei Höhlenfischen verantwortlich ist, untersucht. Wie hier gezeigt, wurden bei mit OCA2-TALEN injizierten Fischen albinoartige Flecken festgestellt, die bei nicht injizierten Fischen nicht vorhanden waren.In diesem Gelelektrophoresebild wurden 306-Basenpaar-lange PCR-Produkte aus Exon neun von OCA2 von A.mexicanus daraufhin untersucht, ob bei F1-Nachkommen eines injizierten Founder-Fisches die Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym in Pools von jeweils 10 F1-Fischen verloren ging. Während das Amplifikat aus einem Kontroll-Embryo durch den Restriktionsverdau geschnitten wurde, war ein Teil des Amplifikats von F1-Embryonen injizierter Fische resistent gegenüber dem Restriktionsverdau. Zudem konnte gezeigt werden, dass die gegenüber dem Restriktionsverdau resistenten Banden INDELs enthalten.Wenn man diese Injektionen einmal beherrscht, können sie bei sachgemäßer Durchführung in weniger als wenigen Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sorgfältig mit RNA umzugehen, um deren Degradation zu verhindern, und während des Ein-Zell-Stadiums zu injizieren. Nach diesem Verfahren kann eine phänotypische Analyse durchgeführt werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob ein bestimmtes Gen bei Mutation in Oberflächenfischen einem wesentlichen Fischphänotyp zugrunde liegt.Diese Technik wird für Forscher im Bereich der Evolutionsbiologie den Weg ebnen, um die Rolle von Kandidatengenen bei der Evolution des Höhlenfisches Astyanax mexicanus zu charakterisieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Astyanax mexicanus-Embryonen mit TALEN-mRNA injiziert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video demonstriert eine Technik der Zinkfinger-Nuklease-basierten Genomeditierung in menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs). Da hPSCs potenziell in verschiedene Zelltypen differenziert werden können, ist diese Technologie hilfreich für patientenspezifische in vitro pathologische und pharmakologische Studien.

Zinkfinger-Nuklease-basierte Genomeditierung: Eine Technik zur Modifikation des Genoms in menschlichen pluripotenten Stammzellen durch doppelsträngigen homologieabhängigen Reparaturmechanismus

Designer-Nukleasen wie Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und Transkriptionsaktivator-Effektor wie Nukleasen (Talens) kann verwendet werden, um das Genom der Maus Präimplantationsembryonen durch Auslösen sowohl die nicht-homologe Ende (NHEJ) und die homologe Rekombination (HR) Wege ändern. Diese Fortschritte ermöglichen die schnelle Generierung von Mäusen, die mit präzisen genetischen Veränderungen.

Maus-Genom-Engineering mit Designer Nukleasen

Transgene Manipulationen und Genom Bearbeitung sind entscheidend für die funktionell die Rolle von Genen und cis Aufsichtsrechtliche Elemente zu testen. Hier ist eine detaillierte Mikroinjektions Protokoll für die Erzeugung von genomischen Modifikationen (einschließlich Tol2-vermittelte Fluoreszenz-Reporter-Transgen-Konstrukte, Talens, und CRISPRs) für das emergent Modell Fisch vorgestellt, die Dreistachliger Stichling.

Mikroinjektions für Transgenese und Genome Editing in Threespine Stichlinge

Unter Verwendung einer vormontierten Cas9 ist Ribonucleoprotein Komplex (RNP) eine leistungsfähige Methode für präzise und effiziente Genom-Bearbeitung. Hier heben wir ihre Nützlichkeit in einem breiten Spektrum von Zellen und Organismen, einschließlich der primären humanen Zellen und sowohl klassische und neue Modellorganismen.

Verbesserte Genom Bearbeitung mit Cas9 Ribonucleoprotein in verschiedenen Zellen und Organismen

Wir beschreiben Ansätze für die Manipulation von Genen im evolutionären Modellsystem Astyanax Mexicanus. Drei verschiedene Techniken beschrieben: Tol2-vermittelte Transgenese, gezielte Manipulation des Genoms mit CRISPR/Cas9 und Zuschlag des Ausdrucks mit Morpholinos. Diese Tools sollten die direkte Untersuchung von Genen zugrunde liegen die Unterschiede zwischen Oberfläche und höhlenbewohnenden Formen erleichtern.

Manipulation der Genfunktion in mexikanischen Cavefish

Hier wird ein Protokoll zur Durchführung zeit- und raumbeschränkter Gen-Knock-out in Axolotl-Rückenmarksen vorgestellt, indem der CAS9-gRNA-Komplex in den Zentralkanal des Rückenmarks injiziert wird, gefolgt von Elektroporation.

Direkter Gene Knock-out von Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

Ziel dieses Protokolls ist es, eine nahtlose CRISPR/Cas9-Bearbeitung des C. elegans-Genoms unter Verwendung von zusammengesetzten Ribonukleoproteinkomplexen und dem dpy-10-Co-CRISPR-Marker für das Screening zu ermöglichen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine Vielzahl von genetischen Modifikationen in C. elegans vorzunehmen, einschließlich Insertionen, Deletionen, Genersatz und Codon-Substitutionen.

CRISPR/Cas9-Editierung des C. elegans rbm-3.2-Gens mit dem dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker und Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine effiziente Adeninbasen-Editierung ohne PAM-Beschränkung durchgeführt werden kann, um ein präzises Zebrafisch-Krankheitsmodell mit zSpRY-ABE8e zu konstruieren.

Effizientes PAM-loses Baseneditieren für die Zebrafisch-Modellierung menschlicher genetischer Erkrankungen mit zSpRY-ABE8e

Die Effizienz der I-GONAD-Methode (Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery) ist vergleichbar mit der herkömmlichen Mikroinjektion, bei der Zygotenentnahme von Spenderinnen und die Übertragung auf pseudoschwangere Frauen erforderlich ist. Dieses Protokoll demonstriert seine Wirksamkeit durch die Einführung von CRISPR/Cas9-induzierten Mutationen in den ROSA26-Locus auf Chromosom 6.

Verbesserte Genom-Editierung durch die Verabreichung von eiduktalen Nukleinsäuren In-vivo-Elektroporationstechnik für die Erzeugung von Knockout-Mäusen

Die Abgabe von Genomeditoren als RNAs ist ein besonders wirkungsvolles Mittel zur Modifikation der Genome primärer Säugetierzellen und -zelllinien. Ziel dieses Protokolls ist es, Genom-Editoren als mRNA in primäre Säugetierzellen und -zelllinien zu liefern, gefolgt von gezielter Illumina-Sequenzierung und Analyse zur Quantifizierung der Editierergebnisse.

Genom-Editierung in primären Säugetierzellen mittels Elektroporation von Editor-RNA

Erfahren Sie die gezielte Genmutagenese mit TALENs bei Astyanax mexicanus zur Untersuchung der genetischen Grundlagen von Höhlenanpassungen. Diese Methode ermöglicht präzise Genomeditierung in der evolutionsbiologischen Forschung.

Genome Editing in

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