Die phänotypische und funktionale Analyse von aktivierten regulatorischen T-Zellen isoliert von chronischer lymphatischer Choriomeningitisvirus-infizierte Mäuse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die in vitro suppressive Funktion von regulatorischen T-Zellen zu bewerten, die aus chronisch virusinfizierten Mäusen isoliert wurden. Diese Methode kann helfen, Fragen zum Phänotyp und zur in vitro suppressiven Funktion von aktivierten regulatorischen T-Zellen während einer chronischen Virusinfektion zu beantworten. Mit dieser Technik kann die direkte Wirkung von regulatorischen T-Zellen auf das Individuum mit einer positiven Reaktion auf T-Zellen in vitro bewertet werden.

Dies ist ein großer Vorteil dieser Technik. Beginnen Sie mit der Übertragung von fünf mal zehn bis zur fünften Gesamtmilzlymphozyten in 50 Mikrolitern facs-Puffer in jede Vertiefung einer neuen U-Bodenplatte mit 96 Vertiefungen, gefolgt von 150 Mikrolitern facs-Puffer. Die Platte zentrifugieren und den Überstand verwerfen.

Rühren Sie dann die Zellpellets und waschen Sie die Zellen zwei weitere Male in 200 Mikrolitern facs-Puffer pro Vertiefung. Nach dem zweiten Waschen resuspendieren Sie die Pellets in 50 Mikrolitern Antikörpercocktail pro Vertiefung für 20 Minuten im Dunkeln bei vier Grad Celsius. Waschen Sie dann die Zellen zweimal in facs-Puffer und dekantieren Sie den Überstand.

Anschließend fixieren Sie die Zellen 20 Minuten lang im Dunkeln bei vier Grad Celsius mit 100 Mikrolitern Fixierungspuffer, gefolgt von zwei Wäschen mit Permeabilisierungs-Waschpuffer. Nach dem zweiten Waschen resuspendieren Sie die Zellen in 50 Mikrolitern Anti-FOXP3-Antikörper. Um die Anti-CD3 CD28-beschichteten Kügelchen herzustellen, geben Sie das entsprechende Volumen der magnetischen Kügelchen in ein 15-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie ein gleiches Volumen PPS hinzu.

Mischen Sie die Lösung vorsichtig durch Pipettieren und zentrifugieren Sie die magnetischen Kügelchen. Entsorgen Sie am Ende des Waschvorgangs den Überstand und verdünnen Sie die Kügelchen in 50 Mikrolitern vollständigem Medium pro Vertiefung. Als nächstes säen 50 Mikroliter von einer mal zehn bis zur fünften CD4-positiven CD25-positiven regulatorischen T-Zellen pro Vertiefung in einer 96-Well-U-Bodenplatte, gefolgt von 50 Mikrolitern von einer mal zehn bis zur fünften CD8-positiven Responder-T-Zellen pro Vertiefung.

Wenn alle Zellen plattiert sind, fügen Sie 50 Mikroliter der verdünnten Anti-CD3-CD28-beschichteten Kügelchen in jede Vertiefung hinzu und fügen Sie bis zu 50 Mikroliter Medium hinzu, um das Gesamtvolumen jeder Vertiefung auf 200 Mikroliter zu erhöhen. Decken Sie dann die Platte mit Folie ab und legen Sie sie bei 37 Grad Celsius für 72 Stunden in einen Kohlendioxid-Inkubator. Um die CD8-positive T-Zell-Zytokinproduktion zu analysieren, werden die Überstände nach dreitägiger Kultur in eine weitere 96-Well-Platte überführt und die Überstände gemäß den Anweisungen des Herstellers mittels ELISA analysiert.

Um die Proliferation der CD8-positiven T-Zellen zu analysieren, waschen Sie die Zellplatte dreimal mit facs-Puffer. Anschließend resuspendieren Sie die Pellets in 50 Mikrolitern eines geeigneten Antikörpercocktails gegen proliferierte CD8-positive T-Zellen für 20 Minuten im Dunkeln bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen zweimal in facs-Puffer und fixieren sie 20 Minuten lang im Dunkeln bei vier Grad Celsius mit 100 Mikrolitern Fixierungspuffer.

Zum Schluss waschen Sie die Zellen noch zwei Mal in facs-Puffer und resuspendieren die Pellets in 200 Mikrolitern facs-Puffer. Messen Sie dann den Prozentsatz der Proliferation von phylat-dimarkierten CD8-positiven T-Zellen mittels Durchflusszytometrie. In Milzlymphozyten, die von naiven und infizierten Mäusen gewonnen wurden, ist PD-1 sowohl in konventionellen FOXP3-negativen CD4-positiven als auch in FOXP3-negativen CD8-positiven Zellen von LCMV-Klon-13-infizierten Mäusen spezifisch hochreguliert.

Die Häufigkeit von FOXP3-positiven CD4-positiven regulatorischen T-Zellen ist bei LCMV-Klon-13-infizierten Mäusen doppelt so hoch wie bei naiven Mäusen, wobei die meisten der FOXP3-positiven CD4-positiven Zellen auch einen aktivierten PD-1-hohen Phänotyp aufweisen. CD8-positive Responder-T-Zellen können erfolgreich abgetrennt werden, ohne dass es zu einer signifikanten Kontamination durch andere Immunzellen kommt. Nach regulatorischer T-Zell-Isolierung kann eine dominante Population von CD25-positiven CD4-positiven T-Zellen mit einer Reinheit von mehr als 80 Prozent gewonnen werden.

Die Stimulation isolierter regulatorischer und Responder-T-Zellen durch anti-CD3-CD28-beschichtete Kügelchen führt zu einer dosisabhängigen Hemmung von CD8-positiven Responder-T-Zellen. Wenn CD8-positive T-Zellen mit chronischen regulatorischen T-Zellen in einem Verhältnis von eins zu eins kokultiviert werden, wird die Proliferation von CD8-positiven T-Zellen signifikant gehemmt. Die Interferon-gamma-Produktion durch CD8-positive Responder-Zellen wird ebenfalls signifikant gehemmt, wenn CD8-positive Responder-T-Zellen mit aktivierten regulatorischen T-Zellen von chronisch infizierten Mäusen kokultiviert werden, verglichen mit der Co-Kultur mit ruhenden regulatorischen T-Zellen von naiven Mäusen.

Wir haben festgestellt, dass diese Technik in 80 Stunden abgeschlossen werden kann, wenn sie richtig ausgeführt wird. Während Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, frisch isolierte regulatorische T-Zellen unmittelbar nach ihrer Isolierung zu verwenden. Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik Forschern aus der Medizin den Weg, um die Funktion regulatorischer T-Zellen bei einer chronisch entzündlichen Erkrankung zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein In-vitro-Verfahren zur regulatorischen T-Zell-Suppression mit einem regulatorischen und ansprechenden T-Zell-Co-Kultursystem einrichten.