Erstellen von Unter 50 Nm nanofluidische Junctions in PDMS mikrofluidischen Chip über Selbstorganisation von kolloidalen Teilchen

Dieses Protokoll demonstriert eine neuartige und einfache Selbstorganisationstechnik von kolloidalen Siliziumdioxid-Nanopartikeln, um eine nanofluidische Verbindung zwischen zwei Mikrokanälen in Polydimethylsiloxan zu erzeugen. Die Kügelchenmembran mit einer Porengröße von etwa 45 Nanometern kann als kationenselektive Membran für die elektrokinetische Konzentration von DNA- und Proteinproben verwendet werden. Überblick:Im ersten Schritt wird das PDMS-Gerät mit Nanofallen durch ein Doppelspritzverfahren gegossen.

Nach dem Plasmakleben des Bauelements mit einem Glassubstrat werden oberflächenfunktionalisierte Siliziumdioxidkügelchen in die Mikrokanäle injiziert, um die kolloidale Membran zur Selbstorganisation zu bilden. Zuletzt wird mit Hilfe eines Quellenmessgeräts und eines Spannungsteilers eine Spannung über die Membran angelegt. Der Ionenabbau und der Konzentrationsanstieg werden mit einem inversen Epifluoreszenzmikroskop mit einer CCD-Kamera beobachtet.

Vorbereitung der kolloidalen Kieselsäurepartikelsuspensionen: Beginnend mit den 300 Nanometer Siliziumdioxidkügelchen; Vortex-Perlenmaterial für 30 Sekunden; 600 Mikroliter Suspension in ein Eppendorf-Röhrchen ziehen und eine Minute lang bei 2.600 g zentrifugieren. Nach dem Zentrifugieren den Überstand vorsichtig entfernen. Resuspendieren Sie die Kügelchen mit 400 Mikrolitern einmillimolarem Natriumphosphatpuffer, um eine Arbeitskonzentration von 15 % zu erreichen.

Vortex, um eine homogene Suspension zu erreichen. Wiederholen Sie die gleichen Schritte, um 500-Nanometer-Siliziumdioxidkügelchen herzustellen. Wiegen Sie für 500-Nanometer-Carboxylkieselsäurekügelchen 100 Milligramm in einer 15-Milliliter-Falcon-Tube.

Übertragen Sie dann 9,8 Milliliter einmolares Natriumchlorid, um die Kügelchen zu resuspendieren. Wirbeln Sie die Röhre kräftig durch. Drehen Sie das Rohr mehrmals um, um die am Boden getroffenen Perlen zu verschieben.

Um die Oberflächenladung auf den Kügelchen zu modifizieren, bereiten wir zwei Polyelektrolyte vor: PAK und PSS. Das 0,9%ige PSS wird hergestellt, indem 180 Milligramm PSS mit 200 Millilitern, einem molaren Natriumchlorid, gelöst werden. Die 0,4%ige PAK wird hergestellt, indem 300 Mikroliter der Stammlösung in 15 Milliliter einmolares Natriumchlorid getäuscht werden.

Wirbeln Sie beide Lösungen vortexen, um sicherzustellen, dass sie vollständig aufgelöst sind. Um eine positiv geladene PAK-Schicht abzuscheiden, geben Sie 200 Mikroliter der PAK-Lösung in die Raupensuspension. Eine Minute lang vortexen und die Suspension eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einem Rotator inkubieren.

Um das ungebundene PAK wegzuwaschen, zentrifugieren Sie die Suspension bei 1.801 g für eine Minute, um die Kügelchen auszufällen. Entfernen Sie den Überstand. Pipettieren Sie ein bis zwei Milliliter Wasser in das Röhrchen, um die Kügelchen aufzubrechen.

Die restlichen acht Milliliter Wasser hinzufügen und dann vortexen. Wiederholen Sie den Waschvorgang noch viermal. Nach dem fünften Waschen und Zentrifugen den Überstand entsorgen und die Kügelchen mit 9,8 Millilitern einmolarem Natriumchlorid wiederherstellen.

Zum Abscheiden der negativ geladenen PSS-Schicht geben Sie 200 Mikroliter der PSS-Lösung in die Raupensuspension. Eine Minute lang vortexen und die Suspension eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Rotator inkubieren. Waschen Sie die Kügelchen fünfmal mit DI-Wasser, wie es bei der PAK-Beschichtung der Fall ist.

Entsorgen Sie nach dem letzten Waschen den Überstand und resuspendieren Sie die Kügelchen mit 650 Mikrolitern einem Millimolar Natriumphosphatpuffer mit 0,05 % Tween 20. Übertragen Sie die Perlensuspension in ein Eppendorf-Rohr. Für die Herstellung der 500-Nanometer-Amin-Siliziumdioxid-Kügelchen wiederholen Sie das gleiche Verfahren, um eine einzelne negativ geladene PSS-Schicht abzuscheiden.

Herstellung des PDMS Microfluidic Chips: Um den Silizium-Master herzustellen, wird zunächst ein ein Mikrometer dünner Fotolack bei 4.000 U/min auf einen Siliziumwafer aufgewirbelt. Verwenden Sie dann Projektionslithografie und reaktives Ionenätzen, um 700 Nanometer tiefe und zwei Mikrometer breite planare Nanokanäle als Nanofallen für die Kügelchen zu erzeugen. Dann schleudern Sie die zweite Fotolackschicht bei 2.000 U/min und führen Sie eine Ausrichtung an den zuvor gemusterten Nanofallen durch.

Fügen Sie die Mikrokanäle über Kontaktlithographie und durch tiefenreaktives Ionenätzen von Silizium hinzu. Um die Trennschicht zu erzeugen, silanieren Sie den Silizium-Master in einem Vakuumbehälter mit 50 Mikrolitern Trichlorsilan über Nacht. Um die PDMS-Form zu gießen, mischen Sie die PDMS-Basis mit dem Härter im Verhältnis 10:1.

Gießen Sie die Mischung auf den Silikonmaster. Legen Sie den Master mit PDMS in einen Vakuumbehälter, um die Luftblasen zu entfernen, und backen Sie ihn im Ofen bei 70 Grad C, um das PDMS zu vernetzen. Nach zwei Stunden Backen die PDMS-Platte vorsichtig vom Silikon-Master entfernen.

Behandeln Sie die Oberfläche mit Plasma, um eine dauerhafte Verbindung zu einem blanken Siliziumwafer zu erzeugen. Befestigen Sie Klebeband entlang der Kante, um eine Trennlinie für den folgenden PDMS-Umwandlungsschritt zu markieren. Um eine Trennschicht zu erzeugen, silanisieren Sie die PDMS-Form über Nacht in einem Vakuumbehälter

Gießen Sie PDMS auf die PDMS-Form und geben Sie es zum Entgasen in einen Vakuumbehälter. Dann im Ofen backen. Ziehen Sie die ausgehärtete PDMS-Platte entlang der mit Klebeband markierten Trennlinie aus der PDMS-Form ab.

Schneiden Sie die Geräte vorsichtig ab und stanzen Sie mit einem 1,5 Millimeter Biopsienstanzer Löcher in die Reservoire. Nach der Oberflächenreinigung mit Klebeband und IPA wird das PDMS-Gerät mit Plasma auf einen 25 Millimeter x 75 Millimeter großen Objektträger aus Mikroskop geklebt. Unmittelbar nach dem Plasmakleben injizieren Sie 10 Mikroliter der Suspension in die Einlässe vier und sechs der Raupenzufuhrkanäle

Decken Sie nach dem Befüllen der Wulstzufuhrkanäle alle Behälter mit Ausnahme der Auslässe eins und neun der Wulstzufuhrkanäle ab. Trocknen Sie das Gerät drei Stunden lang bei Raumtemperatur an der Luft und lagern Sie es vor dem Gebrauch bei vier Grad C. Mikroskopische Aufnahmen des Geräts zeigen, dass sich die kolloidalen Partikel in den oberen und unteren Bead-Zufuhrkanälen ansammeln.

Das REM-Bild zeigt selbstorganisierte kolloidale 300-Nanometer-Siliziumdioxidpartikel, die mit den Nanofallen-Arrays zwischen der Probe und dem Pufferkanal gefangen sind. Die Einlässe drei und sieben der Pufferkanäle werden mit 10 Mikrolitern einmillimolarem Natriumphosphatpuffer gefüllt. Füllen Sie den fünften Probenkanaleinlass mit 10 Mikrolitern 10-nanomolarer DNA-Probe.

Üben Sie mit einer umgekehrten Pipettenspitze einen sanften Unterdruck auf alle Auslässe aus, um die Kanäle ohne Luftblasen mit den Lösungen zu füllen. Geben Sie 10 Mikroliter Natriumphosphatpuffer in die Reservoire zwei und acht und 10 Mikroliter DNA-Probe in die Reservoirs 10, um den Druck fünf Minuten lang zu stabilisieren. Experiment zur elektrokinetischen Konzentration der DNA: Verbinden Sie den mikrofluidischen Chip mit einem Spannungsteiler, der mit einem Quellenmessgerät verbunden ist.

Stecken Sie die PT-Drähte in die Behälter drei, sieben, fünf und 10. Anlegen einer Spannung an einem nanofluidischen Übergang. Legen Sie zuerst 30 Volt an die Behälter fünf und 10 an und erden Sie an den Behältern drei und sieben.

Verringern Sie die Spannung am Behälter 10 nach ca. 30 Sekunden auf 25 Volt. Ergebnisse der elektrokinetischen Vorkonzentration: Der mikrofluidische Kanal ist mit DNA gefüllt, mit einer Anfangskonzentration von 10 Nanomolaren. Zeitraffer-Mikroskopaufnahmen zeigen die Bildung einer Ionenverarmungsregion, entweder nanofluidischer kolloidaler Verbindungen.

Der Ionenabbaubereich wurde in 10 Sekunden eingeleitet. Ein konzentrierter DNA-Stecker wurde erzeugt, wenn die Spannung an den Probenkanal angelegt wurde, während die Pufferkanäle geerdet wurden. Die gestrichelten Linien wurden verwendet, um die Kanalwände hervorzuheben.

Mit einer kolloidalen Membran von 300 Nanometern wird innerhalb von 15 Minuten ein Konzentrationsfaktor von etwa dem 1.700-fachen erreicht. Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität der DNA nimmt in einer nanoporösen Membrabe in Abhängigkeit von der Zeit zu. Die gestrichelten Linien stellen den Signalpegel für 10-nanomolare, 17-mikromolare, zwei-mikromolare und 10-mikromolare DNA dar.

Der konzentrierte Pfropfen wird an der nanoporösen Membran der 300 Nanometer großen Siliziumdioxidkügelchen erzeugt; die 500-Nanometer-Siliziumdioxidkügelchen; die 500-Nanometer-Siliziumdioxid-Amin-Kügelchen, die mit einer einzigen Schicht PSS beschichtet sind; und die 500-Nanometer-Siliziumdioxid-Carboxyl-Kügelchen, die mit zwei Schichten PAK und PSS beschichtet sind. Schlussfolgerungen:Unter Verwendung der selbstorganisierten kolloidalen Siliziumdioxidmembran mit einer geschätzten Porengröße von 45 Nanometern zeigten wir die Polarisation der Ionenkonzentration in der Nähe des nanofluidischen Übergangs und konzentrierten eine DNA-Probe innerhalb von 15 Minuten um das 1700-fache. Im Vergleich zu den siliziumbasierten Nanokanälen besteht der Hauptvorteil der selbstorganisierten kolloidalen Membran in der Möglichkeit, die Oberflächenfunktionalisierung vollständig außerhalb des versiegelten mikrofluidischen Geräts in einem separaten Fläschchen durchzuführen.

Wir glauben, dass dieser Ansatz eine Möglichkeit eröffnet, schnell eine mikronanofluidische Plattform mit leicht einstellbaren Porengrößen herzustellen, indem die Bead-Größe, die Ionenstärke oder der pH-Wert der Pufferlösung gesteuert wird, um den Ionen- und Molekulartransport im Bereich von 10 bis 100 Nanometern zu untersuchen.