Name: Bestimmung von Biofilm Initiation auf Virus-infizierte Zellen durch Bakterien und Fungi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: Erfahren Sie, wie Biofilm-Initiation auf HSV-infizierten HeLa-Zellen durch Staphylococcus aureus und Candida albicans quantifiziert wird. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung mikrobieller Interaktionen bei viralen Infektionen.

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Dieses Projekt wurde unterstützt von der Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) und dem Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).

1. HSV-Stämme und Handhabung Hinweis: Recombinant kein Ausbreiten HSV-1 (KOS) gL86 und HSV-2 (KOS) 333gJ - mit beta-Galactosidase - Reporteraktivität verwendet wurden von V. Twiari 36,37 zur Verfügung gestellt. <ol><li> Verwenden Sie Virus aus einem Los und bei -80 ° C bei einer 1: 1-Verhältnis von Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) und Magermilch bis zur Verwendung. Vor viral Menge Lagerung, Viruskonzentration von o - Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG) und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal) Assay bestimmen. </li><li> Bestimmen die Lebensfähigkeit des Virus und Multiplizität der Infektion (MOI) von X-Gal - Färbung für jeden experimentellen Testlauf unter Verwendung von Reporter - Virus Eintrag Assay, wie vorstehend beschrieben (Figur 1) 14. </li><li> Verdünnte-Virus (Opt-MEM), um die gewünschten MOI. Fix Monolayern (Paraformaldehyd, 0,5 ml / Vertiefung) vor der Färbung. Platzieren Sie die Lebensfähigkeit des Virus Kontrollen in einem separaten microtiter Platte parallel zu polymikrobiellen Testplatten. </li></ol> 2. HeLa 299 Cell Handling <ol><li> Wachsen bei 37 ° C, 5% CO 2 in DMEM mit 4,5 g / L Glucose, 10% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS), Gentamicin (50 ug / ml) und L-Glutamin. Passage-Zellen bei 80% Konfluenz mit Trypsin-Lösung (Ethylendiamintetraessigsäure, 0,53 M EDTA; 0,05% Trypsin; 5 ml / Kolben). </li></ol> 3. C. albicans Handhabung Hinweis: C. albicans aus einem klinischen Labor Quelle erhalten wird bei -80 ° C in Remmel Magermilch 2x Medium gespeichert. <ol><li> Kultur gefroren Lager auf Sabouraud-Dextrose-Medium (37 ° C). Nach 24 Stunden Subkultur der C. albicans auf Fungisel Medium (37 ° C; 48 h) zur Verwendung. </li><li> Generieren Keimschlauch (GT) Formen (Pick repräsentative Kolonien; 3 ml FBS; 3 h; 37 ° C; Abs 600, 0,3). Nach der Inkubation waschen GT (HBSS; 2x; 4000 · g). In gewaschen GT erwärmt HBSS (37 &amp;# 176; C; 0,32 Abs 600). GT Formulare sollten 99% der Zellen beobachtet, wie er durch Haemocytometerzählung bestimmt. </li><li> Machen Sie Hefeform (YF) Stoffsuspensionen durch Picken Vertreter Fungisel Kolonien (HBSS, 3 ml; 0,32 Abs 600). Zählen Sie die Anzahl von YF Formen / ml unter Verwendung von mikroskopisch einer Zählkammer. YF Formulare sollten 99% der Zellen beobachtet, wie er durch Haemocytometerzählung bestimmt. </li><li> Machen Sie arbeiten Pilz-Lager (250 ul GT oder YF Lager in 25 ml HBSS; 37 ° C; 10 5 KBE / ml) </li></ol> 4. S. aureus Handhabung <ol><li> Shop S. aureus ATCC 25923 (-80 ° C; Remmel Milch 2x abschöpfen). Kultur auf Schafblut-Agar (5%; 37 ° C; 24 h). Wählen repräsentative Kolonien und übertragen Salze Mannit Medium innerhalb von 2 Tagen für Lager (37 ° C; 18 h). </li><li> Machen Sie S. aureus Stoffsuspension (3 ml HBSS; 1.32 Abs 600; 10 8 KBE / ml) <ol><li> Machen Sie S. Arbeits aureus Lager (100 &amp; mgr; lder Lager in 25 ml HBSS; 10 5 CFU / ml). </li></ol></li></ol> 5. Candida und S. aureus Suspensions <ol><li> Machen Sie Misch C. albicans und S. aureus - Suspension (250 ul YF oder GT Lager und 100 &amp; mgr; l S. aureus Lager in 25 ml HBSS). </li></ol> 6. polymikrobiellen Biofilm-Assay <ol><li> Seed Platten mit 96 Vertiefungen mit 200 ul 2 x 10 5 HeLa - Zellen / ml (85% Konfluenz Ebene). Gesteinsplatten (30 - 45 min; 37 ° C) vor der Inkubation (37 ° C; 5% CO 2 -Inkubator; 18 h). Wash Monolayern (1x; Opt-MEM) dann Samen mit HSV (HSV-1 (KOS) gL86 oder HSV-2 (KOS) 33 gJ - in 100 ul Opt-MEM; MOI 50 und 10). Inkubieren Platten (3 h; 37 ° C; 5% CO 2). Verwenden Sie nur einen Virusstamm pro Tag. </li><li> Waschen infizierten Monoschichten (1x; phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) mit Mg +2 und Ca +2; 100 &amp; mgr; l). Ersetzen PBS mit warmem HBSS verlassen 25 &amp; #181; l in jeder Vertiefung. <ol><li> In YF, GT und / oder S. aureus Arbeits Suspensionen (100 &amp; mgr; l, Ziel zu Zellenverhältnis = 5: 1; n = 16) dar . Wie in Tabelle 1 angegeben inkubieren Platten (static; 30 min; 37 ° C; 5% CO 2). </li></ol></li><li> Nach der Inkubation aspirate eine Spalte zu einer Zeit sofort mit 300 &amp; mgr; l PBS mit Mg +2 und Ca +2 Nachfüllen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal fügen Sie dann Radio-Immunopräzipitation Lysepuffer (RIPA; Filter sterilisiert; 200 ul einer Verdünnung von 1:50). </li><li> Verreiben schnell die HeLa Zelllysat anschießend auf 50 &amp; mgr; l Mannit Salze (MS) und / oder Fungisel (F) Medien (Abbildung 2). Verbreiten Sie das Lysat mit einem Glasstab gebogen in einem 90 ° Winkel mit. Inkubiere die Platten (18 h bei 37 ° C). zählen manuell die Anzahl der Kolonien pro Platte. Kontrollen bestehen aus S. aureus und / oder C. albicans Einhaltung der HSV-nicht infizierten HeLa - Zellen. </li></ol> 7. Imaging Studies &lt;/ P&gt; <ol><li> Waschen Sie jede Runde Deckglas (12 mm; 50 ml Aceton in 100-ml-Becher). Trockene und sterilisieren Deck (Kimwipes; Petrischalen aus Glas). Legen Sie trockene sterile Deckgläschen in die Vertiefungen von sterilen 24-Well-Platten mit Alkohol Flamme sterilisierten Pinzette. </li><li> Hinzufügen HeLa-Zellen (1 ml; 5x Volumen für 96-Well-Platten verwendet werden) in die Vertiefungen von 24-Well-Platten die gewaschenen sterilen Rundglasplättchen enthält. Fügen Sie die Viren, Bakterien und Pilze nach der Vorlage (Tabelle 2) bei 5x das Volumen der 96 - Well - Platten verwendet, dann brüten und Verfahren , wie 6.2.1 bis 6.4 oben in den Schritten beschrieben. </li><li> Nach dem letzten Waschen, Fixieren der Zellen für die Mikroskopie durch die Folie mit Methanol überschwemmen und ermöglicht es zu verdampfen. Lagern Sie die Platten bei RT bis zur Färbung. </li><li> Für Hellfeldmikroskopie (1,000x letzte Originalvergrößerung) füllen die Vertiefungen mit Methanol fixierten Deck mit entsalztem Wasser enthält. Ab sofort absaugen Wasser. Cover jede Deckglas mit Grams Kristallviolett. Wash Deckgläser frei von nicht gebundenen Fleck (VE-Wasser). Dry Deck in situ haften sie dann mit harten Satz Eindeckmediums zu einem markierten Schieber (Abbildung 3). </li><li> Für Fluoreszenzmikroskopie (100x Objektiv; 1,000x letzte Originalvergrößerung) waschen Deckgläser frei im wesentlichen aus Methanol, wie in Schritt 7.4 beschrieben. Trocknen Sie die Deckgläser in den Vertiefungen. <ol><li> die Deckgläser Nach dem Trocknen entfernen und sie auf markierten Folien. Dann fügen Sie eine ausreichende Menge an 1:20 Verdünnung von Fluorescein (FITC) -konjugierte Herpes Simplex Virus Typ 1 + 2 gD-Antikörper das Deckglas zu bedecken (1 - 5 ul). </li><li> Inkubieren der Objektträger in einer feuchten Kammer bei 37 ° C für 30 min. Nach der Inkubation waschen Sie die Deckgläser in vier Änderungen von PBS. </li><li> Nach dem letzten Waschen, bringen Sie das Deckglas an die markierte Folie. Fleck mit 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; Feuchtigkeitskammer; 37 ° C für 30 min). Nach der Inkubation waschen Sie die Deckgläser in 4 changes von PBS, dann zu dem markierten Schlitten mit harten Satz Eindeckmediums befestigen. </li><li> Ermöglichen die Befestigungsmittel für 24 h bei RT im Dunkeln zu heilen. Untersuchen Sie die Deckgläser unter Öl-Objektiv entweder auf einem Hellfeld-Mikroskop oder Fluoreszenzmikroskop mit FITC und DAPI Cutoff-Filter. Untersuchen Sie Bilder von mindestens 50 Felder (100 Zellen pro Organismus Minimum) für die Co-Lokalisierung (Abbildung 4). </li></ol></li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Derzeit liegen keine Informationen über komplexe Wechselwirkungen zwischen permanent zu semi-permanenten Mitglieder des Host microbiome , die mehrere taxonomische Domänen kreuzen, dh prokaryotischen, eukaryotischen und viral. Deshalb entwickelten wir ein neuartiges in System - vitro - Modell Biofilm Einleitung von S. zu studieren aureus und C. albicans auf HSV-1 oder HSV-2 infizierten HeLa 229 (HeLa - Zellen) 38. Die HeLa-Zellen Modellsystem stellt einen e...

<html> Der menschliche microbiome umfasst unterschiedliche Organismen aus verschiedenen taxonomischen Königreiche, die im Körper geografischen Regionen teilen. Die Einhaltung der Zelloberflächen ist ein wichtiger erster Schritt in die Biofilmbildung, die Teil des microbiome Kolonisierung ist. Eingeschlossen in die microbiome können Viren sein, die chronische und persistente Infektionen verursachen. Die chronische Zellinfektion durch diese Viren kann eine Veränderung in mutmaßlichen Rezeptor Verfügbarkeit führen. 1,2 Zusätzlich Zelleintritt durch intrazelluläre Erreger auch Wirts Membranfluidität / Hydrophobizität, die wiederum verändern können Anbringung weiterer microbiome Mitglieder, einschließlich Bakterien und Pilzen beeinflussen könnten . Um die Wechselwirkungen zu verstehen, die zwischen diesen mehrere Krankheitserreger, die Co-Lokalisierung in den gleichen Regionen des menschlichen Wirts auftreten können, müssen wir die Wechselwirkung von Krankheitserregern zu studieren können, die das Spektrum von taxonomischen Königreiche, die an der Schleimhautoberfläche darstellen. t &quot;&gt; Die Herpesviridae sind eine Familie von Mikroben in 100% der Menschen als ständige Mitglieder des microbiome 3,4. Darüber hinaus können sie auch beide beharrlich vergossen werden in Gegenwart und in Abwesenheit von Symptomen. Insbesondere Herpes - simplex - Virus-1 und Herpes-simplex-Virus-2 (HSV-1 und HSV-2, jeweils) sind permanent Mitglieder der microbiome im oronasopharynx und Genitaltrakt. in immunkompetenten Individuen sowohl HSV-1 und HSV-2 verursachen Gingivostomatitis, sowie Genital - Herpes 5-8. an diesen Stellen verursacht HSV eine latente durch chronische persistente asymptomatischen Virus gekennzeichnet Infektion zu vergießen 9. Eintritt von HSV in Zellen führt zu Veränderungen in der Oberflächenexpression von nectins, Heparansulfat, Lipid Rafts und Herpes - Virus Eintrag Mediator / Tumor - Nekrose Faktor - Rezeptor (HVEM / TNFr) 25.10. Diese potenziell gemeinsamen Rezeptoren für einige Bakterien und Pilze darstellen, zB S. aureus und C. albicans, die während opportunistische Erreger,können auch als Mitglieder der Schleimhaut microbiome des oronasopharynx 26,27 befinden. Innerhalb des oronasopharynx S. aureus und C. albicans belegen zwei verschiedene Stellen der Besiedlung. In Hosts mit natürlichen Zähnen wird die Mundschleimhaut durch HSV-1 geteilt und C. albicans, während die vorderen Nasen nares werden von S. besetzt aureus 28. Doch trotz in - vitro - Ergebnisse , dass S. aureus hält sich an den Mund Epithelzellen, 29,30 S. aureus ist selten von oralen Proben isoliert , wenn die normale Gewebe vorhanden 29,30 ist. Es ist wenig bekannt , Genitaltrakt über Co-Kolonisation Nischen jenseits der klinischen Befunde , dass S. aureus ist mit aerober Vaginitis verbunden sind , gekennzeichnet durch Genital - Entzündung, Entladung und Dyspareunie, während C. albicans erzeugt Schleimhautläsionen ähnlich der in der Mundhöhle beobachtet 31-35. Obwohl also diese Mitglieder der Mund- und Genital microbiome Quer taxonomischen Reiche wenig bekannt ist , ihre Interaktion , wie sie Auswirkungen ihrer Fähigkeit , die Bildung von Biofilmen durch die Einhaltung der Wirtszelloberfläche 5 über einzuleiten. Dieses Protokoll wurde effektiv die funktionellen Folgen der Co-Kolonisation / Infektion zu bestimmen, angewandt.

<table><tbody><tr><td>C.albicans</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BBL Sabouraud Dextrose</td><td>BD</td><td>211584</td><td></td></tr><tr><td>Fungisel Agar</td><td>Dot Scientific</td><td>7205A</td><td></td></tr><tr><td>S.aureus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mannitol Salz Agar</td><td>Troy Biologicals</td><td>7143B</td><td></td></tr><tr><td>Schafblut-Agar</td><td>Troy Biologicals</td><td>221239</td><td></td></tr><tr><td>Hela-Zellen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, mit 4,5 g/L Glucose und L-Glutamin, ohne Natriumpyruvat</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin 50 mg/ml</td><td>Sigma</td><td>1397</td><td>50 &micro; g/ml Endkonzentration im vollständigen DMEM</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA (0,05 % Trypsin, 0,53 M EDTA)Lösung 1x</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>10 % Endkonzentration im vollständigen DMEM</td></tr><<tr><td>strong>Sonstiges Medium und Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Thermo Scientific</td><td>34055</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Pure X gal</td><td>Invitrogen</td><td>15520-018</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution)</td><td>Corning</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Dot Scientific</td><td>30042-500</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lysis</td><td>Life Technologies</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>Staining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>HSV 1& 2, spezifisch für</td><td>gD ViroStat</td><td>196</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D8417-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Gram Crystal Violet</td><td>Troy Biologicals</td><td>212527</td><td></td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 100 x 15</td><td>Dot Wissenschaftliche</td><td>229693&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 150 x 15</td><td>Kord Valmark</td><td>2902</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platten</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8030-01F</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platten</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8044-01F</td><td></td></tr><tr><td>Kulturröhrchen 100 x 13</td><td>Thomas Scientific</td><td>9187L61</td><td></td></tr><tr><td>Deckglaser-Kreise, 12 mm</td><td>Deckglaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr></tbody></table>

bestimmung von biofilm initiation auf virus-infizierte zellen durch bakterien und fungi

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

Die Studie von polymikrobiellen Interaktionen über die taxonomische Königreiche, die Pilze, Bakterien und Viren sind nicht zuvor in Bezug auf, wie virale Mitglieder des microbiome beeinflussen nachfolgende Mikroben-Interaktionen mit diesen Virus infizierten Wirtszellen untersucht worden. Das Zusammenleben von Virus mit Bakterien und Pilzen besteht hauptsächlich darin, die auf den Schleimhäuten der Mundhöhle und des Genitaltrakts. Mucosal Zellen, insbesondere solche mit persistenten chronischen oder persistenten latenten Virusinfektionen, könnte einen erheblichen Einfluss auf die Mitglieder des microbiome durch Virus Veränderung in der Anzahl und Art der Rezeptoren zum Ausdruck gebracht haben. Änderung in Wirtszellmembran Architektur in veränderter Fähigkeit der nachfolgenden Mitglieder der normalen Flora und opportunistischen Erregern würde den ersten Schritt in die Biofilmbildung, das heißt, die Einhaltung zu initiieren. Diese Studie beschreibt ein Verfahren zur Quantifizierung und visuelle Untersuchung des HSV Wirkung auf die Einleitung BIOFILm - Bildung (Adhärenz) von S. aureus und C. albicans.

Der Grad der Zuverlässigkeit der Daten , die aus System in diesem Bericht beschrieben wird , in Abbildung 2 af 38 gezeigt. Durch die Verwendung dieses Systems die Modulation von Staphylokokken und Pilz Wechselwirkung mit viral infizierte Zellen und deren Wirkung auf jedes Anhaften des anderen können abgegrenzt werden. Diese Arten von Studien erfordern mikroskopische Untersuchung der Wechselwirkung , wie in den 3 und 4 gezeigt ...

Hierin wird ein Verfahren zur Bestimmung der Assoziation und Konkurrenz zwischen den Königreichen (bakteriell und pilzlich) für die Adhärenz an virusinfizierten HeLa-Zell-Monoschichten beschrieben. Dieses Protokoll kann auf mehrere Kombinationen von Prokaryoten, Eukaryoten und Viren ausgeweitet werden.

Bestimmung von Biofilm Initiation auf Virus-infizierte Zellen durch Bakterien und Fungi

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Auswirkungen von mit HSV vorinfizierten Zellen auf die anschließende Anheftung bakterieller und pilzlicher opportunistischer Erreger, beispielsweise Staphylococcus aureus und Candida albicans, zu messen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen bezüglich der Rolle, die chronische Virusinfektionen bei der Regulation der jeweiligen Mitglieder des Wirtsmikrobioms spielen, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Wechselwirkung mehrerer Organismen im Initiationsschritt der Biofilmbildung, nämlich der Adhärenz, untersucht und quantifiziert werden kann.Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die Kontrolle kolonisierender opportunistischer Krankheitserreger, da die Voraussetzung einer HSV-Infektion mit asymptomatischer Ausscheidung in der Mehrheit der menschlichen Bevölkerung gegeben ist. Obwohl diese Methode Einblicke in die Kontrolle der nachfolgenden mikrobiellen Anheftung durch HSV ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme wie die CMV-Infektion und die Adenovirus-Infektion übertragbar. Beginnen Sie damit, die Viableität des HSV1- oder HSV2-Virus und die Multiplizität der Infektion, oder MOI, durch X-Gal-Färbung für jeden experimentellen Assaylauf unter Verwendung eines Reporter-Virus-Eintritts-Assays zu bestimmen.Verdünnen Sie das Virus auf die gewünschte MOI und geben Sie die Virus-Vitalitätskontrollen parallel zu den polymikrobiellen Assay-Platten in eine separate Mikrotiterplatte. Anschließend verwenden Sie 100 µL Puffer aus Paraformaldehyd und Glutaraldehyd, um die Monolayer vor der Färbung zu fixieren. Zur Kultivierung von HeLa-Zellen werden diese in DMEM mit 4,5 g/L Glukose, 10 % hitzeinaktiviertem FBS, 50 µg/L Gentamycin und L-Glutamin gezüchtet.Verwenden Sie eine Trypsin-Lösung, um die Zellen bei 80 Prozent Konfluenz zu passagieren. Um C.albicans zu bearbeiten, kultivieren Sie eine gefrorene Aufzucht auf sub um das nährstoffreiche Medium bei 37 Grad Celsius. Nach 24 Stunden subkultivieren Sie C.albicans auf Fungicell-Medium und inkubieren Sie es 48 Stunden vor der Verwendung.Erzeugen Sie Keimschlauch- oder GT-Formen von C.albicans, indem Sie repräsentative Hefezellkolonien auswählen und diese drei Stunden lang in drei Millilitern FPS bei 37 Grad Celsius kultivieren. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Kultur bei 4.000 × g zehn Minuten. Anschließend waschen Sie die Zellen zweimal mit HBSS.Nachdem die Zellen mit einem Hämozytometer gezählt wurden, geben Sie das gewaschene GT in HBSS bei 37 Grad Celsius, um einen OD 600 von null Komma drei zwei zu erreichen. Um Hefeform- oder YF-Stammsuspensionen herzustellen, wählen Sie repräsentative Fungicell-Kolonien aus und verwenden Sie diese, um drei Milliliter HBSS zu beimpfen. Kultivieren Sie die Ansätze auf einen OD 600 von null Komma drei zwei, zählen Sie mit dem Hämozytometer die Anzahl der YF-Formen pro Milliliter, die 99 Prozent der unter dem Mikroskop beobachteten Zellen betragen sollte.Stellen Sie einen Arbeitsstamm von Pilzen her, indem Sie 250&nbsp;Mikroliter GT- oder YF-Stamm in 25&nbsp;Milliliter HBSS bei 37&nbsp;Grad Celsius umimpfen. Dies ergibt zehn hoch fünf KBE pro Milliliter. Um SRES ATCC 25923 vorzubereiten, streichen Sie einen gefrorenen Stamm auf Agar mit fünf Prozent Schafsblut und inkubieren ihn 24&nbsp;Stunden bei 37&nbsp;Grad Celsius.Innerhalb von zwei Tagen repräsentative Kolonien auswählen, in Mannit-Salz-Medium überführen und 18 Stunden bei 37 Grad Celsius kultivieren. Für einen SRES-Stammsatz werden repräsentative Kolonien in drei Milliliter HBSS mit einer Temperatur von 37 Grad Celsius suspendiert, um einen OD600-Wert von 0,132 oder 108 KBE pro Milliliter zu erreichen. Zur Herstellung eines Arbeitsstammsatzes werden 100 Mikroliter der suspendierten Stammlösung in 25 Milliliter HBSS überführt.Dies führt zu zehn hoch fünf KBE pro Milliliter. Der erste entscheidende Schritt bei der Anwendung dieser Methode auf andere Organismen oder Mikrobenstämme ist die Bestimmung der richtigen Anzahl an Bakterien und Pilzen, die zugegeben werden müssen, damit ausreichend Kolonien zum Zählen vorhanden sind. Um einen polymikrobiellen Biofilm-Test durchzuführen, besäen Sie 96-Loch-Platten mit 200 Mikroliter einer Suspension mit zwei mal zehn hoch 15 HeLa-Zellen pro Milliliter.Schwenken Sie die Platten 30 bis 45 Minuten bei 37 Grad Celsius, bevor Sie sie 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in fünf Prozent Kohlendioxid inkubieren. Verwenden Sie One X Optimum, um die Mono-Schichten zu waschen, und besäen Sie diese anschließend mit dem einzelnen HSV-Stamm. Testen Sie jeweils nur einen Stamm gleichzeitig.Die Platten drei Stunden bei 37 Grad Celsius in fünf Prozent Kohlendioxid inkubieren. Die infizierten Mono-Schichten mit 100 Mikroliter PPS bei 37 Grad Celsius mit Magnesium und Calcium waschen. Anschließend das PBS durch HBSS bei 37 Grad Celsius ersetzen.Lassen Sie 25 Mikroliter des HBSS in jedem Well stehen. Geben Sie anschließend die Arbeitsaufschlämmung von YF, GT und/oder SRES hinzu und inkubieren Sie die Platten 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid. Nach der Inkubation saugen Sie jeweils eine Spalte der Platte auf einmal ab. Füllen Sie die Vertiefungen unverzüglich mit 300 Mikroliter PBS mit Magnesium und Calcium wieder auf. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal, und geben Sie anschließend 200 Mikroliter RIPA-Lysepuffer, der filtersterilisiert und im Verdünnungsverhältnis 1:50 vorliegt, zu jeder Vertiefung hinzu. Wenn Sie mit anderen Stämmen von Bakterien oder Pilzen arbeiten, stellen Sie sicher, dass die verwendete Konzentration an RIPA ausreicht, um eine Zelllyse zu ermöglichen, gleichzeitig aber noch verträglich ist für die Überprüfung der mikrobiellen Lebensfähigkeit.Zerkleinern Sie das HeLa-Zelllysat rasch und pipettieren Sie 50 Mikroliter auf Mannit-Salz- und/oder Fungicell-Medium. Verteilen Sie dann das Lysat mit einem in einem 90-Grad-Winkel gebogenen Glasstab gleichmäßig auf der Oberfläche der Platte. Nach einer 18-stündigen Inkubation zählen Sie die Anzahl der Kolonien pro Platte manuell.Die Kontrollen bestehen aus SRES- oder C. albicans-Anhängern an HSV-unausinfizierten HeLa-Zellen. Führen Sie zum Durchführen von Abbildungsstudien jeden runden Glasdeckel vor der Sterilisation mit Aceton ab. Anschließend platzieren Sie mithilfe alkohol- und flammengesterilisierter Pinzetten die trockenen, sterilen Deckel in die Vertiefungen steriler 24-Loch-Platten.Fügen Sie HeLa-Zellen den Vertiefungen der Platten mit den Deckgläsern hinzu. Infizieren Sie die Zellen anschließend mit dem Virus. Nach der Infektion fügen Sie Bakterien und Pilze gemäß der Vorlage hinzu und inkubieren sowie verarbeiten die Zellen wie zuvor für die 96-Well-Platte beschrieben.Nach dem letzten Waschschritt die Zellen zur Mikroskopie fixieren, indem die Deckgläser mit Methanol überschüttet und anschließend das Methanol verdunsten gelassen wird. Für die Hellfeldmikroskopie die Vertiefungen mit den fixierten Deckgläsern mit entionisiertem Wasser füllen. Das Wasser unmittelbar abpipettieren und ausreichend Gram-Kristallviolett hinzufügen, um jedes Deckglas zu bedecken.Nachdem die mit Kristallviolett gefärbten Deckgläser mit entionisiertem Wasser gewaschen wurden, trocknen Sie sie in C2, bevor Sie sie mit einem hart werdenden Montagemedium auf einer beschrifteten Objektträgerplatte befestigen. Für die Fluoreszenzmikroskopie die Deckgläser nach dem Entfernen des Methanols waschen, in den Vertiefungen trocknen lassen und dann mit hart werdendem Montagemedium auf beschrifteten Objektträgern montieren. Geben Sie eine ausreichende Menge einer 1:20-Verdünnung des mit FITC konjugierten HSV1-plus-2GD-Antikörpers hinzu, um das Deckglas zu bedecken.Die Objektträger 30 Minuten lang in einer Feuchtkammer bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die Deckgläser viermal mit PBS waschen. Nach dem letzten Waschgang die Objektträger erneut in die Feuchtkammer zurückstellen.Fügen Sie Dab B hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation waschen Sie die Objektträger viermal mit PBS. Lassen Sie das Eindeckmedium 24 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln aushärten.Danach mindestens 50 Felder unter einem Ölimmersionsobjektiv entweder an einem Hellfeld- oder Fluoreszenzmikroskop auf Kolokalisation untersuchen. Hier werden repräsentative Ergebnisse der Wirkung von HSV auf die Adhärenz von Staphylococcus und/oder Candida albicans gezeigt. Das Vorhandensein von HSV1 hemmte die Adhärenz von Staphylokokken an HeLa-Zellen.Das Vorhandensein von Keimschlauchformen von Candida, jedoch nicht von Hefeformen, führte zu einer Wiederherstellung der Staphylokokken-Adhärenzwerte. Ähnliche Ergebnisse wurden bei mit HSV2 infizierten HeLa-Zellen gemessen. Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, ist das Ausmaß der Adhärenz von Candida-Keimschlauchformen bei mit HSV2 infizierten Zellen signifikant höher als bei mit HSV1 infizierten Zellen.Der umgekehrte Effekt wurde für HSV1 im Vergleich zu HSV2 bei Candida-Hefepilzen gemessen. Die Adhärenzmuster wurden mittels Kristallviolett-Färbung von Monolagen bestimmt, um die Interaktion zwischen Bakterien und Pilzen sichtbar zu machen. Anschließend wurde die Präsenz von HSV mittels Fluoreszenzmikroskopie in Bezug auf die anderen Mikroben ermittelt.Bei Abwesenheit von HSV koinlokalisierten Staphylokokken sowie sowohl Hefe- als auch Keimrohrformen von Candida auf HeLa-Zellen. Auf infizierten Zellen mit HSV wurde jedoch ausschließlich Candida beobachtet. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in acht bis neun Stunden durchgeführt werden.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die differenzielle fluoreszierende Antikörperfärbung angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise zur differenziellen Expression von Oberflächenrezeptoren nach dem Eintritt des Virus in die Zelle. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet des menschlichen Mikrobioms den Weg, Post-Mikroben-Interaktionen in Gewebekultur- sowie Organkultursystemen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein polymikrobielles Interaktionsmodell entwickelt, das die taxonomischen Reiche umfasst.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Krankheitserregern äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung von nicht ausbreitenden Virusstämmen und Barrieretechniken erforderlich sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Der Test beschreibt ein schnelles Mittel zur frühen Bildung von Biofilmen in Bakterien und Pilzen zu messen. Diese Methode verwendet eine Mikrotiterplatte als Substrat für die mikrobielle Bildung von Biofilmen und der Biofilm wird visualisiert Kristallviolett Belastung. Der Test liefert entweder eine qualitative oder quantitative Assay für die frühe Bildung von Biofilmen.

Mikrotiterschale Biofilmbildung Assay

Quelle: Tay, S. B., et al. Antivirulente Störung pathogener Biofilme mit Engineered Quorum-Quenching Lactonasen.  J. Vis. Exp. (2016)Das Video demonstriert eine Methode zur Quantifizierung der Biofilmbiomasse in einem pathogenen Bakterium, indem unbehandelte Kontrollen mit Proben verglichen werden, die mit einem Quorum-Abschreckungsenzym behandelt wurden. Das Enzym stört die bakterielle Signalübertragung während der frühen Inkubation und verringert so die Zelladhäsion. Nach dem Waschen und...

Quantifizierung enzyminduzierter Biofilmsuppression bei pathogenen Bakterien

Quelle: Schlafer, S, und Frost Kristensen, M. Überwachung des extrazellulären pH-Werts in Reichsübergreifenden Biofilmen mittels Konfokalmikroskopie. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video demonstriert die Kultivierung von Streptococcus mutans- und Candida albicans-Reichs-Biofilmen unter oralähnlichen Bedingungen, um bakteriel-pilz-Interaktionen zu modellieren und so die Untersuchung mikrobieller Synergie, glucanvermittelter Adhäsion und acidogener Virulenz in der oralen Pathogenese zu untersuchen.

Etablierung von bakteriellen und pilzreichübergreifenden Biofilmen zur Untersuchung oraler Pathogenese

Quelle: Miquel Guennoc, C., et al. Neue Methode zur qualitativen multiskaligen Analyse bakterieller Biofilme auf filamentösen Pilzkolonien mittels Konfokal- und Elektronenmikroskopie. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Herstellung einer Pilzkultur auf behandelten Zellophanmembranen zur Unterstützung der Koloniebildung und des radialen Wachstums. Anschließend zeigt es die Kultivierung und Vorbereitung von bakteriellen Bodenzellen für Interaktionstests. Abschließend zeigt sie, wie...

Etablierung einer pilzbakteriellen Kokultur zur Biofilmbildung

Dieses Video veranschaulicht die Initiierung der polymikrobiellen Biofilmbildung auf virusinfizierten Zellen durch Bakterien und Pilze. Eine Herpes-simplex-Virusinfektion behindert die bakterielle Anheftung an die Zellen und verhindert so die Kolokalisierung von Bakterien und Pilzen. Im Gegensatz dazu zeigen nicht infizierte Zellen eine bakteriell-pilzliche Kolokalisation und eine Initiierung der Biofilmbildung.

Ein Assay zur Bestimmung der Initiation polymikrobieller Biofilme auf virusinfizierten Zellen

Dieses Video beschreibt eine Methode zur Züchtung und qualitativen Analyse von bakteriellen Biofilmen auf Pilzhyphen mittels Mikroskopie. Bakterielle Biofilme bilden sich häufig auf Pilzoberflächen und sind an zahlreichen bakteriell-pilzlichen Interaktionsprozessen beteiligt, wie z. B. metabolischer Kooperation, Konkurrenz oder Prädation.

Ein Verfahren zur Probenvorbereitung zur Visualisierung von Biofilm-bildenden Bakterien auf Pilzhyphen

Dieses Protokoll beschreibt ein neues Verfahren zu wachsen und qualitativ bakteriellen Biofilmen auf Pilzhyphen durch konfokale und Elektronenmikroskopie analysiert.

Eine neue Methode zur qualitativen Mehrskalige Analyse von bakteriellen Biofilmen auf filamentösen Pilzkolonien mittels konfokaler und Elektronenmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines Geräts anpassbare automatisierte mikrofluidischen Biofilmbildung in Candida Albicans unter physiologischen Bedingungen Host zu visualisieren.

Visualisierung der Biofilmbildung in Candida Albicans ein automatisiertes mikrofluidischen Gerät

Dieses Protokoll ermöglicht dem Leser, Galle Salz-induzierte Biofilmbildung in magensaftresistenten Krankheitserreger mit einem vielschichtigen Ansatz, um die dynamische Natur der bakteriellen Biofilmen zu erfassen, durch die Beurteilung der Einhaltung der extrazellulären Polymeren Stoffes Matrixbildung zu analysieren, und Dispersion.

Galle-Salz-induzierte Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern: Techniken für die Identifizierung und Quantifizierung

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung des Inokulums, die Quantifizierung des Biofilms auf Mikrotiterplatten mit kristallviolettem Farbstoff, die Lebensfähigkeit in Biofilmen und die Visualisierung von Biofilmen von Acinetobacter.

Quantifizierung, Viabilitätsbewertung und Visualisierungsstrategien für Acinetobacter-Biofilme

Erfahren Sie, wie Biofilm-Initiation auf HSV-infizierten HeLa-Zellen durch Staphylococcus aureus und Candida albicans quantifiziert wird. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung mikrobieller Interaktionen bei viralen Infektionen.

Bestimmung von Biofilm Initiation auf Virus-infizierte Zellen durch Bakterien und Fungi

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