Name: Kinetische Messung und Echtzeit-Visualisierung von Somatic Reprogrammierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Lernen Sie die kinetische Messung und Echtzeit-Visualisierung der somatischen Reprogrammierung zu induzierten pluripotenten Stammzellen mittels Durchflusszytometrie und bildgebender Verfahren. Diese Methode ermöglicht die Überwachung von Zelloberflächenmarkern während der iPSC-Generierung.

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Die Autoren danken Chad MacArthur für hilfreiche Diskussionen.

<ol><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).</li>
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<li>Ramirez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+report%3A+benchmarking+human+pluripotent+stem+cell+markers+during+differentiation+into+the+three+germ+layers+unveils+a+striking+heterogeneity%3A+all+markers+are+not+equal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Brief report: benchmarking human pluripotent stem cell markers during differentiation into the three germ layers unveils a striking heterogeneity: all markers are not equal.</a> Stem Cells. 29, 1469-1474 (2011).</li>
<li>Huang, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+adhesion+molecule+%28EpCAM%29+complex+proteins+promote+transcription+factor-mediated+pluripotency+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) complex proteins promote transcription factor-mediated pluripotency reprogramming.</a> J Biol Chem. 286, 33520-33532 (2011).</li>
<li>Kolle, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+embryonic+stem+cell+surface+markers+by+combined+membrane-polysome+translation+state+array+analysis+and+immunotranscriptional+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling.</a> Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).</li>
<li>Thyagarajan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+engineered+human+embryonic+stem+cell+lines+using+phiC31+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase.</a> Stem Cells. 26, 119-126 (2008).</li>
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Alle Autoren [RHQ, JSTA, KS, und UL] sind Mitarbeiter von Thermo Fisher Scientific, die in diesem Artikel einige der verwendeten Reagenzien und Instrumente produziert.

Diese Studie bietet Strategien zur Überwachung und Verfolgung des Reprogrammierungsprozesses mit Hilfe von Durchflusszytometrie und bildgebender Echtzeitanalyse. Die kritischen Schritte im Protokoll sind die Initiierung der Reprogrammierung, die Messung des Reprogrammierungsfortschritts auf der Grundlage der Markerexpression und die Echtzeitüberwachung der Reprogrammierung. Jede Reprogrammierungsmethode der Wahl kann verwendet werden, aber hier konzentrieren wir uns auf die Sendai-basierte Reprogrammierung von humanen Fi...

Patienten stammende induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) sind vielversprechende Werkzeuge für Zelltherapie und Wirkstoff-Screening. Sie bieten eine autologe Quelle von Zellen für die Therapie. Darüber hinaus umfassen sie ein sehr breites Spektrum an genetischen Hintergründen, eine detaillierte In - vitro - Analyse von genetischen Erkrankungen jenseits dessen, was Strom an embryonalen Stammzellen (ESC) Linien erlauben würde , zu ermöglichen. Jüngste Fortschritte haben zur Entwicklung verschiedener Methoden geführt iPSCs zur Erzeugung, einschließlich Umprogrammierung mit Sendai - Virus, episomalen Plasmiden oder mRNAs 1,2. Bemerkenswerterweise sind verschiedene Verfahren der Reprogrammierung zugeordnet Ebenen der Effizienz und Sicherheit Variation und sind wahrscheinlich auf andere Weise zu unterscheiden, die ihre Eignung für verschiedene Anwendungen beeinflussen. Mit der Verfügbarkeit von einer Vielzahl von Umprogrammierung Technologien hat es wichtig geworden, Methoden zu entwickeln, um die Reprogrammierung zu bewerten. Die meisten existierenden Verfahren stützen sich auf die qualitative Kontrolle der Morphologie oder Färbungmit Stammzell-spezifische Farbstoffe und Antikörper. Eine kürzlich entwickelte Methode nutzt lentiviralen Fluoreszenz - Reporter , die empfindlich auf PSC-spezifischen miRNAs oder differenzierte zellspezifischen mRNAs 3. Eine solche Überwachungsmethoden, die Auswahl und Optimierung der Reprogrammierung Techniken für unterschiedliche Situationen erleichtern. Zum Beispiel wurde als fluoreszierende Sonde für frühe iPSCs um zu screenen für Umprogrammierung Modulatoren 4 CDY1 verwendet. Die Fähigkeit, zu beobachten und verschiedene Umprogrammierung Experimente vergleichen ist auch entscheidend für sich ein besseres Verständnis des Verfahrens zu gewinnen. Zum Beispiel ist es nun bekannt , dass einige somatische Zelltypen leichter sind als andere umprogrammieren 5, und dass die Zellen gehen durch Zwischenzustände während 6-8 Neuprogrammierung. Leider sind die Mechanismen, die die Reprogrammierung Verfahren zugrundeliegenden noch nicht vollständig verstanden und folglich bleiben die genauen Unterschiede zwischen Umprogrammierung Methoden auch als defined. So Methoden zur Überwachung, Bewertung und Neuprogrammierung Ereignisse Vergleich weiterhin für die Stammzell-Feld kritisch zu sein. Die Verfahren in diesem Protokoll beschrieben ermöglichen die Überwachung und Beurteilung der Umprogrammierung und zeigen, wie diese Techniken verwendet werden können, verschiedene Sätze von Umprogrammierung Reagenzien zu vergleichen. Der erste Ansatz beinhaltet Durchflusszytometrie analysiert Kombinationen von Antikörpern gegen positive und negative pluripotenten Stammzellen (PSC) Marker. Der zweite Ansatz Paare Echtzeit-Bildgebung und die Messung der Gesamt Einmündung (die Fläche Prozent Oberfläche durch die Zellen bedeckt) und Einmündung der Markierungssignale (Bereich Prozent Oberfläche durch die fluoreszierenden Signale abgedeckt).

<table><tbody><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, GlutaMAXSupplement, Pyruvat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, qualifiziert für embryonale Stammzellen, US-Herkunft</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16141-061</td><td></td></tr><tr><td>MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Maus (ICR) Inaktivierte embryonale Fibroblasten</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A24903</td><td></td></tr><tr><td>Attachment Factor Protein (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-006-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut-Serumersatz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>10828010</tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase, Typ IV, Pulver</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzym (1x), kein Phenolrot&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563-011</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, kein Kalzium, kein Magnesium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-frei, hESC-qualifiziert, Basalmembran-Matrix mit reduziertem Wachstumsfaktor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413302</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 1-155) Rekombinantes humanes Protein</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0264</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Rinderalbuminfraktion V (7,5 %ige Lösung)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 m)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>InSolution Y-27632</td><td>EMD Millipore</td><td>688001</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS Sendai Reprogrammierungskit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogrammierungskit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16517</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Automatisierter Zellzähler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess Zellzählkammer</td><td>Objektträger Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>BJ ATCC Humane Vorhaut-Fibroblasten, Neugeborene</td><td>ATCC</td><td>CRL-2522</td><td></td></tr><tr><td>DF1 Erwachsene humane dermale Fibroblasten</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific N/A</td><td></td></tr><tr><td>BG01V/hOG Zellen Variante hESC hOct4-GFP Reporterzellen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R7799-105</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 Antikörper, Alexa Fluor 647 Konjugat (MC813-70)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SSEA421</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 Antikörper, Alexa Fluor 488 Konjugat (eBioMC-813-70 (MC-813-70))</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14810</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 Antikörper (MC813-70)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41-4000</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Antikörper (cl.A)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td> 41-1000</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Ratte Anti-Mensch/Maus mAb (Klon IM7), PE-Cy5 Konjugat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A27094</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Alexa Fluor 488 Konjugat-Kit für die Bildgebung lebender Zellen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25528</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Ratte Anti-Mensch/Maus mAb (Klon IM7)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific RM-5700 (nicht mehr erhältlich)</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 Konjugat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; A-11029</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Ratten-IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 594 Konjugat</td><td>Thermo Fisher Scient</td><td>&nbsp; A-11007</td><td></td></tr><tr><td>Alkalische Phosphatase Lebendfleck</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14353</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Konjugat-Kit für die Bildgebung lebender Zellen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25618</td><td></td></tr><tr><td>CD24 Maus Anti-Human-mAb (Klon SN3), FITC-Konjugat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MHCD2401</td><td></td></tr><tr><td>Beta-2-Mikroglobulin-Antikörper, FITC-Konjugat (B2M-01)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A15737</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM / CD326 Antikörper, FITC-Konjugat (VU-1D9)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A15755</td><td></td></tr><tr><td>CD73 / NT5E Antikörper (7G2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41-0200</td><td></td></tr><tr><td>VECTOR Substrat Kit für rote alkalische Phosphatase (AP)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-5100</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer.Z1 Mikroskop&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>491912-0003-000</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Datenanalyse-Software</td><td>FLOJO, LLC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Attune Akustisches Fokussierungszytometer, blau/rot Laser</td><td>Thermo Fisher</td><td>Wissenschaftliche Nutzung Attune NXT&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>S3e\ Cell Sorter (488/561 nm)</td><td>BIO-RAD</td><td>1451006</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 12 x 75 mm Röhrchen mit Cell Strainer</td><td>Cap Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml, hochklar, kuppeldichtende Schraubkappe</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon T-75 Flask</td><td>Corning</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Falcon T-175 Flask</td><td>Corning</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6-Well-Dish</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Heracell CO2 Rollinkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51013669</td><td></td></tr><tr><td>Antihaftbeschichtete, RNasefreie Mikrofuge-Röhrchen, 1,5 ml</td><td></td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>HulaMixer Probenmischer</td><td></td><td>15920D</td><td></td></tr></tbody></table>

kinetische messung und echtzeit-visualisierung von somatic reprogrammierung

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Die somatische Reprogrammierung hat die Umwandlung von adulten Zellen in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen und Krankheitsphänotypen ermöglicht. Jüngste Fortschritte haben effizientere und sicherere Methoden für die Einführung von Reprogrammierungsfaktoren aufgezeigt. Es gibt jedoch nur wenige Tools, um den Fortschritt der Neuprogrammierung zu überwachen und zu verfolgen. Derzeitige Methoden zur Überwachung der Reprogrammierung beruhen auf der qualitativen Inspektion der Morphologie oder der Färbung mit stammzellspezifischen Farbstoffen und Antikörpern. Werkzeuge zur Analyse des Fortschreitens der iPS-Erzeugung können helfen, den Prozess unter verschiedenen Bedingungen aus verschiedenen Zellquellen besser zu verstehen. 
Diese Studie stellt Schlüsselansätze für die kinetische Messung des Reprogrammierungsfortschritts mittels Durchflusszytometrie sowie Echtzeitüberwachung mittels Bildgebung vor. Um die Kinetik der Reprogrammierung zu messen, wurde eine Flussanalyse zu diskreten Zeitpunkten mit Antikörpern gegen positive und negative pluripotente Stammzellmarker durchgeführt. Die Kombination aus Echtzeit-Visualisierung und Strömungsanalyse ermöglicht die quantitative Untersuchung der Reprogrammierung in verschiedenen Stadien und ermöglicht einen genaueren Vergleich verschiedener Systeme und Methoden. Die bildbasierte Echtzeitanalyse wurde für die kontinuierliche Überwachung von Fibroblasten verwendet, während sie in einem Feeder-freien Mediumsystem umprogrammiert werden. Die Kinetik der Koloniebildung wurde anhand der Konfluenz in den Phasenkontrast- oder Fluoreszenzkanälen nach Färbung mit lebenden alkalischen Phosphatasefarbstoffen oder Antikörpern gegen SSEA4 oder TRA-1-60 gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Messung der Konfluenz semi-quantitative Metriken liefert, um den Fortschritt der Reprogrammierung zu überwachen.

Überwachung Reprogrammierung Kinetics Mit Flow Cytometry CD44 ist ein Fibroblasten - Marker während SSEA4 ein PSC Marker 6,10 ist. Wie aus diesem Expressionsmuster erwartet, Durchflusszytometrie von BJ Fibroblasten zeigt eine SSEA4 - CD44 + Population, die die Schaffung von Quadranten Toren in Kombination mit der ungefärbten Probe erleichtert. Während Reprogrammierung von DF1 Fibroblas...

Das Protokoll in dieser Studie präsentierten beschreibt Verfahren zur Echtzeit-Überwachung der Reprogrammierung Progression über die kinetische Messung von positiven und negativen pluripotenten Stammzellmarker Durchflusszytometrie-Analyse. Das Protokoll enthält auch die Imaging-basierte Beurteilung der Morphologie und Marker oder Reporter-Expression während der iPS-Generation.

Kinetische Messung und Echtzeit-Visualisierung von Somatic Reprogrammierung

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren besteht darin, die Entwicklung der somatischen Zellreprogrammierung zu induzierten pluripotenten Stammzellen oder iPSCs sichtbar zu machen und zu verfolgen. Diese Methode kann verwendet werden, um zentrale Fragen im iPSC-Bereich zu beantworten, beispielsweise wie sich die Reaktionskinetik und die Effizienz der Reprogrammierung durch die verwendeten somatischen Gewebe, die eingesetzten Reprogrammierungstechnologien sowie die verwendeten Kombinationen aus Matrix und Kulturmedien verändern. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass sie Oberflächenmarker der Zellen nutzt, um die Übergänge somatischer Zellen in iPSCs zu untersuchen, sodass mit dieser Technologie die Reprogrammierungsereignisse in Echtzeit überwacht werden können.Am siebten Tag nach der Transduktion die Fibroblasten mit zwei Milliliter DPBS pro Vertiefung waschen und 0,5 Milliliter 37 °C warmer 0,5 %iger EDTA-Lösung pro Vertiefung hinzufügen, um drei bis fünf Minuten bei 37 °C zu inkubieren. Wenn sich die Zellen abgerundet haben, die Reaktion mit zwei Milliliter 37 °C warmer Fibroblasten-Medium pro Vertiefung stoppen und das Medium vorsichtig über den Boden jeder Vertiefung

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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Stabile und effiziente genetische Veränderung von Zellen in der erwachsenen Maus V-SVZ für die Analyse von Neural Stem Cell Autonome und Nicht autonome Effekte

Lernen Sie die kinetische Messung und Echtzeit-Visualisierung der somatischen Reprogrammierung zu induzierten pluripotenten Stammzellen mittels Durchflusszytometrie und bildgebender Verfahren. Diese Methode ermöglicht die Überwachung von Zelloberflächenmarkern während der iPSC-Generierung.

Kinetische Messung und Echtzeit-Visualisierung von Somatic Reprogrammierung

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