Kinetische Messung und Echtzeit-Visualisierung von Somatic Reprogrammierung
30. Juli 2016
Das Protokoll in dieser Studie präsentierten beschreibt Verfahren zur Echtzeit-Überwachung der Reprogrammierung Progression über die kinetische Messung von positiven und negativen pluripotenten Stammzellmarker Durchflusszytometrie-Analyse. Das Protokoll enthält auch die Imaging-basierte Beurteilung der Morphologie und Marker oder Reporter-Expression während der iPS-Generation.
Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren besteht darin, die Entwicklung der somatischen Zellreprogrammierung zu induzierten pluripotenten Stammzellen oder iPSCs sichtbar zu machen und zu verfolgen. Diese Methode kann verwendet werden, um zentrale Fragen im iPSC-Bereich zu beantworten, beispielsweise wie sich die Reaktionskinetik und die Effizienz der Reprogrammierung durch die verwendeten somatischen Gewebe, die eingesetzten Reprogrammierungstechnologien sowie die verwendeten Kombinationen aus Matrix und Kulturmedien verändern. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass sie Oberflächenmarker der Zellen nutzt, um die Übergänge somatischer Zellen in iPSCs zu untersuchen, sodass mit dieser Technologie die Reprogrammierungsereignisse in Echtzeit überwacht werden können.
Am siebten Tag nach der Transduktion die Fibroblasten mit zwei Milliliter DPBS pro Vertiefung waschen und 0,5 Milliliter 37 °C warmer 0,5 %iger EDTA-Lösung pro Vertiefung hinzufügen, um drei bis fünf Minuten bei 37 °C zu inkubieren. Wenn sich die Zellen abgerundet haben, die Reaktion mit zwei Milliliter 37 °C warmer Fibroblasten-Medium pro Vertiefung stoppen und das Medium vorsichtig über den Boden jeder Vertiefung pipettieren, um die Zellen zu lösen. Die Fibroblasten aus jeder Vertiefung in einzelne 15-Milliliter-Konischgefäße überführen und durch Zentrifugation sammeln.
Suspendieren Sie die Pellets in zwei Milliliter frischem Fibroblasten-Medium bei 37 Grad Celsius und zählen Sie die Zellen aus jeder Kulturbedingung. Anschließend säen Sie eine mal 10 hoch 5 Zellen in vorbereitete, feeder-unabhängige konditionierte Vertiefungen einer sechswelligen Zellkulturplatte aus und inkubieren Sie die transduzierten Zellen über Nacht im Zellkultur-Inkubator. Am nächsten Tag ersetzen Sie das Medium in jeder Vertiefung durch das geeignete Medium für die jeweilige Zellanwendung.
Platzieren Sie dann die Platte im Bildgebungssystem und stellen Sie die Software so ein, dass kontinuierlich Phasenkontrast- und Fluoreszenzbilder des gesamten Wells für jedes Well alle sechs bis acht Stunden für die nächsten 14 Tage aufgenommen werden. Am Ende des Reprogrammierungsversuchs waschen Sie die Wells einmal mit zwei Millilitern DMEM/F12-Medium bei 37 Grad Celsius. Entsorgen Sie die Waschlösung und markieren Sie die Zellen mit je einem Milliliter pro Well der entsprechenden primären Antikörper in frischem DMEM/F12-Medium für 45 Minuten bei 37 Grad Celsius im Inkubator.
Am Ende der Inkubation die Zellen zwei Mal mit DMEM/F12-Medium bei 37 Grad Celsius waschen. Anschließend die Waschlösung entfernen und die Zellen mit einem Milliliter der entsprechenden sekundären Antikörper in DMEM/F12-Medium bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius markieren. Am Ende der Inkubation die Zellen weitere zwei Mal mit DMEM/F12-Medium waschen.
Danach ersetzen Sie die Waschlösung in jedem Well durch zwei Milliliter frisches DMEM/F12-Medium bei 37 Grad Celsius. Stellen Sie die Schale in das Bildgebungsgerät und öffnen Sie die Bildgebungssoftware. Um die Scans in der Bildgebungssystemsoftware einzurichten, wählen Sie zunächst die Position des zu verwendenden Tabletts und anschließend die Art der zu scannenden Schale aus.
Als Nächstes wählen Sie die Ganzbrunnen-Bildgebung, das Muster zum Scannen der gewünschten Brunnen und die geeigneten fluoreszierenden Kanäle für die Echtzeit-Identifizierung der gewünschten Oberflächenmarker aus. Danach kennzeichnen Sie das zu scannende Experiment und legen die Zeitpunkte und Intervalle fest, zu denen die Proben an jedem Tag gescannt werden sollen. Um eine Reihe gescannter Experimente zu analysieren, wählen Sie das gewünschte Experiment aus und klicken Sie auf „Neuen Analyseauftrag starten“.
Danach die geeignete Verarbeitungsdefinition entsprechend der Art der Analyse und den für die Bildgebung verwendeten Kanälen auswählen, beispielsweise PSC Phase Colony Count. Den Analyselauf benennen. Und den Zeitbereich für die Analyse sowie die zu analysierenden Wells auswählen.
Starten Sie dann den Analyselauf. Um die gewünschten Reprogrammierungszeitpunkte aus einzelnen Vertiefungen zu messen, waschen Sie die betreffende Vertiefung einmal mit zwei Milliliter DPBS. Ersetzen Sie dann die Waschlösung durch ein Milliliter vorgewärmte 37 Grad Celsius 0,5 %ige Trypsin-EDTA-Lösung.
Nach fünf Minuten bei 37 Grad Celsius spülen Sie die Trypsinlösung gegen den Boden der Vertiefung, um die Zellen in eine Einzelzell-Suspension zu lösen, und überführen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Konischglas. Spülen Sie mit drei Millilitern DPBS die verbleibenden Zellen aus der Vertiefung und geben Sie sie zum 15-Milliliter-Gefäß hinzu. Fügen Sie den Zellen weitere 10 Milliliter DPBS hinzu und pelletieren Sie sie durch Zentrifugation.
Suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter DMEM/F12-Medium zur Zellzählung. Verdünnen Sie dann die Zellsuspension auf eine Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter und portionieren Sie je ein Milliliter Zellsuspension pro Röhrchen entsprechend der erforderlichen Anzahl an Proben. Markieren Sie anschließend die Zellen mit den gewünschten primären Antikörpern in einem Milliliter DMEM/F12-Medium für 30 bis 45 Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren.
Am Ende der Inkubation die Zellen zwei Mal mit DMEM/F12-Medium bei 37 Grad Celsius waschen. Die Pellets in einem Milliliter DPBS resuspendieren und die Proben in einzelne FACS-Röhrchen überführen. Die Durchflusszytometrieprofile der reprogrammierten Platten erfassen.
Übertragen Sie anschließend die FCS-Dateien auf einen Computer und importieren Sie die Dateien in die entsprechende Analyse-Software. Öffnen Sie die erste Kontrolldatei in einem Streudiagramm mit Vorwärtsstreuung gegen Seitwärtsstreuung und stellen Sie die y-Achse auf eine logarithmische Skala ein. Erstellen Sie dann ein polygonales Gate um die lebende Zellpopulation.
Erstellen Sie anschließend ein Streudiagramm der Seitenstreuung (SSC-A) über die Streulichthöhe (SSC-H) mit den lebenden Zellen und setzen Sie ein rechteckiges Tor, um Doppelzellen auszuschließen. Verwenden Sie diese Tore dann, um die experimentellen Proben unter den entsprechenden fluoreszierenden Kanälen zu analysieren und die Populationen von Interesse in ihren jeweiligen Quadranten zu identifizieren. Die Reprogrammierung von BJ-Fibroblasten mit Sendai-Reprogrammierungsviren erzeugt SSEA4+CD44--Zellen mit einer anderen Rate als die Reprogrammierung von DF1-Fibroblasten, was zeigt, dass ein früher Vergleich des Prozentsatzes an pluripotenten Stammzell-ähnlichen SSEA4+CD44--Zellen zur Verfolgung des Reprogrammierungsfortschritts genutzt werden kann.
In einem Durchflusszytometrie-Zeitverlauf bilden CD24-CD44+ und EpCAM-negative CD44+ Fibroblasten Doppelnegative-Populationen, die später jeweils in CD24+CD44- und EpCAM-positive CD44- pluripotente Stammzell-ähnliche Zellen übergehen, wodurch der Reprogrammierungsfortschritt weiter verdeutlicht wird. Die Echtzeit-Bildgebung der Reprogrammierungskulturen nach erneutem Aussäen zeigt eine schrittweise Koloniebildung, die einem logarithmischen Anstieg ihrer Konfluenz entspricht, und demonstriert den abschließenden Nachweis der positiven pluripotenten und negativen Fibroblasten-Markerexpression am Ende der Reprogrammierung. Außerdem ermöglicht die Verwendung eines Reportergens, die Konfluenz im Phasenkontrast zu messen, wobei ein graduellerer Anstieg der GFP-Konfluenz im Vergleich zur Gesamtkonfluenz beobachtet wird.
Tatsächlich betrug die GFP-Konfluenz am 19. Tag in diesem repräsentativen Experiment weniger als die Hälfte der Gesamtkonfluenz, die der vollständigen Reprogrammierung entspricht. Sobald diese Technik beherrscht ist, könnte sie verwendet werden, um Erkenntnisse über Reprogrammierungsereignisse zu gewinnen und die Kinetik der Reprogrammierung menschlicher Fibroblasten zu verfolgen. Diese Technik könnte außerdem genutzt werden, um verschiedene Ausgangsgewebe somatischer Zellen, die verwendeten Reprogrammierungstechnologien sowie Kombinationen von Kulturmedien und Matrixkomponenten zu untersuchen, um Reprogrammierungsereignisse aufzuklären.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Echtzeitüberwachung und die Expression von Zelloberflächenmarkern genutzt werden können, um die Umprogrammierung menschlicher Fibroblasten in iPSCs zu verfolgen.
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Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll für die Echtzeitüberwachung der somatischen Zellreprogrammierung in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) mittels Durchflusszytometrie vor. Dabei liegt der Schwerpunkt auf der kinetischen Messung von Markern pluripotenter Stammzellen und auf bildbasierten Analysen während der iPSC-Generierung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Stammzellbiologie
- Zellreprogrammierung
- Durchflusszytometrie
Hintergrund
- Das Verständnis der iPSC-Generierung ist entscheidend für die regenerative Medizin.
- Die Kinetik der Reprogrammierung kann je nach somatischen Geweben und verwendeten Technologien variieren.
- Die Überwachung von Zelloberflächenmarkern unterstützt die Verfolgung von Reprogrammierungsübergängen.
- Die Echtzeitanalyse verbessert das Verständnis der Reprogrammierungseffizienz.
Zweck der Studie
- Visualisierung und Verfolgung des Fortschritts der somatischen Zellreprogrammierung.
- Beurteilung, wie verschiedene Faktoren die Reprogrammierungskinetik beeinflussen.
- Bereitstellung einer zuverlässigen Methode zur Echtzeitüberwachung der iPSC-Generierung.
Verwendete Methoden
- Durchflusszytometrie zur kinetischen Messung pluripotenter Marker.
- Bildbasierte Beurteilung der Zellmorphologie und Markerexpression.
- Analyse von Oberflächenmarkern zur Überwachung von Übergängen während der Umprogrammierung.
- Detaillierte Protokolle zur Handhabung und Analyse von Fibroblasten.
Hauptergebnisse
- Die erfolgreiche Echtzeitüberwachung der iPSC-Generierung wurde erreicht.
- Es wurden Variationen der Reprogrammierungseffizienz in Abhängigkeit von somatischen Geweben beobachtet.
- Mittels Durchflusszytometrie konnte der Expression von pluripotenten Markern effektiv gefolgt werden.
- Bildgebende Verfahren lieferten Einblicke in die morphologischen Veränderungen während der Reprogrammierung.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine robuste Methode zur Untersuchung der iPSC-Umprogrammierung.
- Die Echtzeitüberwachung kann die Forschung in der Stammzellbiologie erheblich verbessern.
- Das Verständnis der Kinetik der Umprogrammierung ist entscheidend für die Verbesserung von iPSC-Technologien.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Echtzeit-kinetische Messung der somatischen Reprogrammierung ermöglicht der biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung eine quantitative Beurteilung der Effizienz der iPSC-Generierung über verschiedene Zellquellen und Reprogrammierungstechnologien hinweg. Dieser Ansatz unterstützt die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominimierung, indem er eine vorhersagbare Zuversicht bezüglich der Reprogrammierungsergebnisse bietet und Portfolioentscheidungen in der Entwicklung von Zelltherapien informiert. Die Methode verbessert die translationale Kontinuität, indem sie frühe Entdeckungsmetriken über standardisierte, reproduzierbare Endpunkte mit der präklinischen Validierung verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Verfolgung von SSEA4+CD44- und CD24+CD44--Populationen als quantitative Indikatoren pluripotenter Stammzell-ähnlicher Übergänge.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch die mittels Durchflusszytometrie basierende Isolierung unabhängiger Variablen wie somatischer Zelltypen und Reprogrammierungstechnologien.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Identifizierung aussichtsreicher Kandidaten durch den Vergleich der Reprogrammierungskinetik über verschiedene Matrizen und Medienkombinationen hinweg, um Systeme mit hoher Effizienz zu priorisieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Workflows vor, indem konfluenzbasierte semi-quantitative Metriken in Phasenkontrast- oder Fluoreszenzkanälen etabliert werden.
- Reproduzierbarkeit: Gewährleistet die Standardisierung von Assays durch Echtzeit-Bildgebung der Koloniebildung und zeitliche Durchflusszytometrie-Analysen, die Doubletts ausschließen und lebende Zellpopulationen gezielt erfassen.
- Skalierbarkeit im Screening: Unterstreicht die Wiederverwendbarkeit der Plattform, indem kontinuierliche Ganzfeld-Bildgebung alle sechs bis acht Stunden über einen Zeitraum von 14 Tagen für die longitudinale kinetische Analyse ermöglicht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Erläutert die Krankheitsrelevanz, indem der Vergleich des Reprogrammierungsverlaufs über verschiedene genetische Hintergründe und Krankheitsphänotypen hinweg ermöglicht wird.
- Präklinische Abstimmung: Beschreibt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem die Expression finaler pluripotenter positiver und fibroblastischer negativer Marker zum Abschluss der Reprogrammierung gemessen wird.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Bezieht sich auf Fortschrittsentscheidungen, bei denen Korrelationen zwischen Reportergen und Konfluenz genutzt werden, um partielle von vollständiger Reprogrammierung zu unterscheiden, wie beispielsweise beobachtet, wenn die GFP-Konfluenz am Tag 19 weniger als die Hälfte der Gesamtkonfluenz betrug.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung über die Identifizierung von Leitverbindungen bis hin zur präklinischen Forschung, indem sie quantitative, zeitlich aufgelöste Daten zum Fortschritt der Umprogrammierung liefert.
- Entdeckungsbiologie: Erläutert, wie die Methode Hypothesentests, die Aufklärung von Signalwegen und die biologische Risikominimierung unterstützt, indem sie einen frühen Vergleich der Anteile SSEA4+CD44- zwischen verschiedenen Zelltypen wie BJ- und DF1-Fibroblasten ermöglicht.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft des Assays, dessen Reproduzierbarkeit und quantitative Ergebnisse mittels Durchflusszytometrie-Analyse von lebenden Einzelzell-Suspensionen sowie konfluenzbasierten Bildgebungsanalysen.
- Analytik: Betont die durchgeführten Messungen, Nachweise und statistischen Auswertungen, einschließlich des Prozentsatzes pluripotenter Marker-positiver Zellen, der Konfluenz-Kinetik und der Ausschluss von Doppelzellen anhand von Streulichtfläche zu Streulichthöhe-Diagrammen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Methode mit der präklinischen Kontinuität, indem sie morphologische Veränderungen und die Expression von Markern während der Umwandlung von Fibroblasten in iPSCs verfolgt und die Abstimmung von Biomarkern durch Färbungen für SSEA4 und TRA-1-60 unterstützt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbare Fähigkeit dar, nicht als Einmalverfahren, anwendbar auf verschiedene somatische Ausgangsgewebe, Reprogrammierungstechnologien und Kombinationen von Kulturmedien-Matrizes.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung und Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten bei Reprogrammierungsverläufen.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit kinetischer Messungen über verschiedene Labore und Zelllinien hinweg.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitalwirksamkeit und geringeres biologisches Risiko in fortgeschrittenen Entwicklungsphasen bei der Therapieentwicklung auf Basis von iPSCs.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Voranbringungsentscheidungen basierend auf quantitativen Reprogrammierungseffizienzen und kinetischen Profilen.
Durchführungsüberlegungen
- Notwendige wissenschaftliche Expertise in Durchflusszytometrie, Immunfluoreszenz und Live-Cell-Imaging.
- Instrumentelle und analytische Infrastrukturanforderungen, einschließlich Inkubatoren, Bildgebungssysteme mit Ganzbrunnen-Scanning und FACS-kompatible Durchflusszytometer.
- Anforderungen an die Standardisierung über Teamgrenzen hinweg hinsichtlich Antikörpansets, Gating-Strategien und Protokolle zur Bildanalyse.
- Überlegungen zur Anpassung an verschiedene Modellsysteme, wie unterschiedliche Fibroblastenquellen und Reprogrammierungsvektoren.
- Praktische Einschränkungen, einschließlich der Notwendigkeit einer sorgfältigen Titration von Trypsin-EDTA, um Zellschäden während der Dissoziation zu vermeiden, sowie der semi-quantitativen Natur von Konfluenzbasierten Messgrößen.
