Kinetische Messung und Echtzeit-Visualisierung von Somatic Reprogrammierung

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren ist es, das Fortschreiten der somatischen Zellreprogrammierung in induzierte pluripotente Stammzellen oder iPSC sichtbar zu machen und zu verfolgen. Diese Methode kann verwendet werden, um Schlüsselfragen im iPS-Bereich zu beantworten, z. B. wie die Reprogrammierungskinetik und die Reprogrammierungseffizienz durch das verwendete somatische Gewebe, die angewandten Reprogrammierungstechnologien und die damit verwendeten Matrix- und Medienkombinationen verändert werden. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie Zelloberflächenmarker verwendet, um die Übergänge von somatischen Zellen in iPSCs zu untersuchen, so dass Sie diese Technologie nutzen können, um die Reprogrammierungsereignisse in Echtzeit überwachen zu können.

Waschen Sie die Fibroblasten am siebten Tag nach der Transduktion mit zwei Millilitern DPBS pro Vertiefung und geben Sie 0,5 Milliliter 37 Grad Celsius 05 % EDTA in jede Vertiefung für eine drei- bis fünfminütige Inkubation bei 37 Grad Celsius. Wenn sich die Zellen gerundet haben, stoppen Sie die Reaktion mit zwei Millilitern 37 Grad Celsius heißem Fibroblastenmedium pro Vertiefung und pipettieren Sie das Medium vorsichtig über den Boden jeder Vertiefung, um die Zellen zu entfernen. Übertragen Sie die Fibroblasten aus jeder Vertiefung in einzelne konische 15-Milliliter-Röhrchen und sammeln Sie sie durch Zentrifugation.

Resuspendieren Sie die Pellets in zwei Millilitern frischem 37 Grad Celsius heißem Fibroblastenmedium und zählen Sie die Zellen aus jeder Kulturbedingung. Anschließend säen Sie eine mal 10 bis fünfte Zellen in eine vorbereitete Feeder-unabhängige konditionierte Vertiefung in einer Sechs-Well-Gewebekulturplatte aus und inkubieren Sie die transduzierten Zellen über Nacht im Zellkultur-Inkubator. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium in jeder Vertiefung durch das geeignete Medium für die Zellanwendung.

Setzen Sie dann die Platte in den Imager ein und stellen Sie die Software so ein, dass sie in den nächsten 14 Tagen alle sechs bis acht Stunden kontinuierliche Ganzwell-, Phasenkontrast- und Fluoreszenzbilder für jede Vertiefung aufnimmt. Am Ende des Reprogrammierungsexperiments waschen Sie die Vertiefungen einmal mit zwei Millilitern 37 Grad Celsius heißem DMEM/F12-Medium. Entsorgen Sie die Wäsche und markieren Sie die Zellen mit einem Milliliter pro Vertiefung der entsprechenden Primärantikörper in frischem DMEM/F12-Medium für 45 Minuten bei 37 Grad Celsius im Inkubator.

Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation zweimal mit 37 Grad Celsius heißem DMEM/F12-Medium. Entsorgen Sie dann die Wäsche und markieren Sie die Zellen mit einem Milliliter der entsprechenden Sekundärantikörper in 37 Grad Celsius DMEM/F12 Medium für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation noch zwei weitere Male mit DMEM/F12-Medium.

Ersetzen Sie dann die Wäsche in jeder Vertiefung durch zwei Milliliter frisches DMEM/F12-Medium mit 37 Grad Celsius. Setzen Sie die Schale in den Imager ein und öffnen Sie die Imaging-Software. Um Scans in der Imaging-Systemsoftware einzurichten, wählen Sie zunächst die Position des zu verwendenden Tabletts und dann die Art der zu scannenden Schüssel aus.

Wählen Sie als Nächstes Whole Well Imaging, das Muster zum Scannen der gewünschten Wells und die entsprechenden Fluoreszenzkanäle für die Echtzeit-Identifizierung der interessierenden Oberflächenmarker aus. Beschriften Sie dann das zu scannende Experiment und legen Sie die Zeitpunkte und Intervalle für die täglich zu scannenden Proben fest. Um eine Reihe von gescannten Experimenten zu analysieren, wählen Sie das gewünschte Experiment aus, und wählen Sie Neuen Analyseauftrag starten aus.

Wählen Sie dann die geeignete Verarbeitungsdefinition für den Analysetyp entsprechend den für die Bildgebung verwendeten Kanälen aus, z. B. PSC Phase Colony Count. Benennen Sie den Analyseauftrag. Und wählen Sie den Zeitbereich für die Analyse und die zu analysierenden Bohrungen aus.

Starten Sie dann den Analyseauftrag. Um die gewünschten Reprogrammierungszeitpunkte aus einzelnen Vertiefungen zu messen, waschen Sie die gewünschte Vertiefung einmal mit zwei Millilitern DPBS. Ersetzen Sie dann die Wäsche durch einen Milliliter vorgewärmte 37 Grad Celsius 05%ige Trypsin-EDTA-Lösung.

Nach fünf Minuten bei 37 Grad Celsius spülen Sie das Trypsin gegen den Boden der Vertiefung, um die Zellen in eine Einzelzellsuspension zu dissoziieren und die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen zu überführen. Waschen Sie mit drei Millilitern DPBS alle verbleibenden Zellen aus der Vertiefung und ziehen Sie sie in das 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie weitere 10 Milliliter DPBS in die Zellen und schleudern Sie sie durch Zentrifugation herunter.

Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter DMEM/F12-Medium zum Zählen. Dann verdünnen Sie die Zellsuspension auf ein mal Zehntel der sechs Zellen pro Milliliter Konzentration und aliquotieren Sie einen Milliliter Zellen pro Röhrchen für die entsprechende Anzahl von Proben. Als nächstes markieren Sie die Zellen mit den primären Antikörpern von Interesse in einem Milliliter DMEM/F12-Medium für 30 bis 45 Minuten bei Raumtemperatur unter Mischen.

Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation zweimal in 37 Grad Celsius heißem DMEM/F12-Medium. Resuspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter DPBS und überführen Sie die Proben in einzelne FACS-Röhrchen. Erfassen Sie die Durchflusszytometrie-Profile der neu programmierten Platten.

Übertragen Sie dann die FCS-Dateien auf einen Computer und importieren Sie die Dateien in die entsprechende Analysesoftware. Öffnen Sie die erste Steuerdatei in einem Vorwärts-nach-Seite-Streudiagramm, und stellen Sie die y-Achse auf eine logarithmische Skala ein. Erstellen Sie dann ein polygonales Tor um die lebende Population.

Erstellen Sie als Nächstes ein Diagramm für die seitliche Streufläche nach Streuhöhe mit den aktiven Zellen und legen Sie ein rechteckiges Tor fest, um die Dubletten auszuschließen. Verwenden Sie dann diese Gates, um die experimentellen Probendateien unter den entsprechenden Fluoreszenzkanälen zu analysieren und die interessierenden Populationen in ihren jeweiligen Quadranten zu identifizieren. Die Reprogrammierung von BJ-Fibroblasten mit Sendai-Reprogrammierungsviren erzeugt SSEA4+CD44-Zellen mit einer anderen Geschwindigkeit als die Reprogrammierung von DF1-Fibroblasten, was zeigt, dass ein früher Vergleich des Prozentsatzes pluripotenter Stammzell-ähnlicher SSEA4+CD44-Zellen verwendet werden kann, um den Fortschritt der Reprogrammierung zu verfolgen.

In einem durchflusszytometrischen Zeitverlauf bilden CD24-CD44+- und EpCAM-negative CD44+-Fibroblasten doppelt negative Populationen, die später in CD24+CD44- bzw. EpCAM-positive CD44-pluripotente Stammzell-ähnliche Zellen übergehen, was den Fortschritt der Reprogrammierung weiter beschreibt. Die Echtzeit-Bildgebung der Reprogrammierungskulturen nach der Neuaussaat zeigt eine allmähliche Koloniebildung, die einer logarithmischen Zunahme ihrer Konfluenz entspricht, und zeigt die endgültige Expression der pluripotenten positiven und fibroblastennegativen Marker nach Abschluss der Reprogrammierung. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines Reportergens die Messung der Konfluenz im Phasenkontrast, wobei eine allmählichere Zunahme der GFP-Konfluenz im Vergleich zur Gesamtkonfluenz beobachtet wird.

In diesem repräsentativen Experiment betrug die GFP-Konfluenz an Tag 19 weniger als die Hälfte der gesamten Konfluenz, die der vollständigen Reprogrammierung entspricht. Sobald diese Technik gemeistert ist, könnte sie verwendet werden, um Informationen über Reprogrammierungsereignisse aufzuklären und die Kinetik der Reprogrammierung menschlicher Fibroblasten zu verfolgen. Diese Technik könnte auch verwendet werden, um verschiedene beginnende somatische Zellgewebe, die verwendeten Reprogrammierungstechnologien und die Kombinationen der Medienmatrix zur Aufklärung von Reprogrammierungsereignissen zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Echtzeitüberwachung und die Expression von Zelloberflächenmarkern nutzen können, um die Reprogrammierung von menschlichen Fibroblasten in iPSCs verfolgen zu können.