Polyelektrolytkomplex für Heparin-Bindungsdomäne Osteogenisches Growth Factor Lieferung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Herstellung einer Polyelektrolyt-Komplexierungshülle. Ein Träger, der die Freisetzung einer Vielzahl von Wachstumsfaktoren mit einer Heparin-Bindungsdomäne einfangen und regulieren kann. Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich des orthopädischen Tissue Engineering für eine effiziente Einklemmung und Verabreichung von Wachstumsfaktoren beantworten.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass nicht häufig organische Stoffe verwendet werden müssen. Es ist bekannt, dass dies die Bioaktivitäten von Wachstumsfaktoren beeinflusst. 200 Milligramm unbestrahltes Natriumalginat oder 400 Milligramm acht Megarad bestrahltes Natriumalginat werden in 10 Millilitern doppelt destilliertem Wasser gelöst.

Und eine Stunde lang schütteln. Lagern Sie die Alginatlösung bei vier Grad Celsius über Nacht. Filtrieren Sie die Alginatlösung mit einem sterilen 0,2-Mikron-Spritzenvorsatzfilter, bevor Sie Alginat-Mikrokügelchen herstellen.

Desinfizieren Sie den elektrostatischen BE-Generator und die Spritzenpumpe mit 70 % Ethanol und stellen Sie sie in eine biologische Sicherheitswerkbank der Klasse zwei. Stellen Sie dann ein Glasbecken mit einem Magnetrührstab in den BE-Generator. Setzen Sie die Armelektrode des BE-Generators neun Zentimeter über dem Becken ein.

Verbinden Sie das Elektrodenkabel des BE-Generators mit der Neuroschraube zwei der Armelektrode. Und gießen Sie 80 Milliliter Strontiumchloridlösung in das Becken. Laden Sie anschließend fünf Milliliter 0,2 Mikrometer gefilterter Alginatlösung in die Spritze in den Gummischlauch.

Nachdem Sie den Gummischlauch mit der Armelektrode verbunden haben, schalten Sie die Spritzenpumpe mit fünf Millilitern pro Stunde ein. Zwei Minuten lang. Um die Luft aus dem Schlauch auszustoßen und die Alginatlösung an die Spitze der Düse zu liefern.

Schalten Sie dann die Spritzenpumpe aus. Um mit der Erzeugung von Mikrokügelchen zu beginnen, stellen Sie den Verkapselungskörper auf 5,8 Kilovolt ein. Gefolgt von der Spritzenpumpe mit einer Alginat-Durchflussrate von fünf Millilitern pro Stunde.

Entsorgen Sie die Mikrokügelchen, die in den ersten zwei Minuten erzeugt wurden, da diese Mikrokügelchen dazu neigen, unregelmäßig zu sein und zu formen. Sammeln Sie nachfolgende Mikrokügelchen in der 0,2 molaren Strontiumchlorid-Lösung. Schalten Sie die Spritzenpumpe und anschließend den Verkapseler aus.

Nach dem Pumpen der vorgeplanten Menge Alginatlösung. Wiederholen Sie dies für nachfolgende Chargen der Herstellung von Mikroperlen. Lagern Sie die Mikrokügelchen über Nacht in 20 Millilitern 0,2 molare Strontiumchloridlösung bei vier Grad Celsius, um die Vernetzung zu vervollständigen und das Gel zu stabilisieren.

Sammeln Sie 0,5 Milliliter Alginat-Mikrokügelchen mit einer Kunststoffpipette. Und platzieren Sie es auf einem Objektträger. Betrachten Sie die Mikrokügelchen unter einem optischen Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung.

Nehmen Sie 10 Bilder der Mikrokügelchen mit einer CCD-Kamera am Mikroskop auf. Speichern Sie die Bilder mit einem 500-Mikrometer-Maßstab im TIFF-Format bei einer Auflösung von 2048 x 1536. Messen Sie mit den Längenwerkzeugen in Abbildung J die Größe der Mikrokügelchen.

Und die Maßstabsleiste. Rechnen Sie dann die Länge der Mikroperlen von Pixeln in Mikrometer um. Klicken Sie auf die Linienwerkzeuge und ziehen Sie eine Linie über die Mitte der Alginatperle.

Klicken Sie in der Menüleiste auf Analysieren und wählen Sie Messen. Ein Popup-Fenster wird angezeigt. Wiederholen Sie diese Schritte, um alle Alginatkügelchen im Bild zu messen.

Messen Sie die Maßstabsleiste auf dem Bild. Sammeln Sie die Mikrokügelchen mit dem 100-Mikron-Nylonsieb. Und wasche die Kügelchen mit doppelt destilliertem Wasser.

Übertragen Sie mit einem Spatel alle Mikrokügelchen aus 0,1 Millilitern der Alginatlösung in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und bedecken Sie es mit Gaze, um ein Austrocknen zu verhindern. Zum Schluss sterilisieren Sie die Mikrokügelchen durch automatisches Spalten im Flüssigmodus oder gemäß den Herstellerangaben. Geben Sie 1,5 Liter destilliertes Wasser in die Kammer, um ein Austrocknen der Kügelchen zu verhindern.

Inkubieren Sie die sterilen Mikrokügelchen in der BSL2-Haube mit einem Milliliter sterilisierter Protaminlösung von zwei Milligramm pro Milliliter eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die mit Protamin überzogenen Mikrokügelchen zweimal mit doppelt destilliertem Wasser. Dann mit einer Tischzentrifuge bei 200-facher G-Temperatur drei Minuten lang bei Raumtemperatur nach unten schleudern.

Nach der Zentrifugation das Wasser mit einer Spritze absaugen. Inkubieren Sie mit Protamin beschichtete Mikrokügelchen mit einem Milliliter sterilisierter 0,5 Milligramm pro Milliliter Heparinlösung für 30 Minuten. Dadurch entsteht eine Polyelektrolyt-Komplexierungshülle mit einer ausgeprägten Affinität zu Heparin-bindenden Wachstumsfaktoren.

Nach der Inkubation aspirieren Sie das Heprain mit einer Spritze. Und waschen Sie das ungebundene Heparin aus den Polyelektrolytkomplexen ab, indem Sie es zweimal mit doppelt destilliertem Wasser waschen. Laden Sie 13,3 Mikroliter 1,5 Milligramm pro Milliliter knochenmorphogenetisches Protein 2 oder NELL wie Molekül 1 Lösung auf 100 Mikrogramm des Polyelektrolytkomplexes.

Inkubieren Sie den Polyelektrolytkomplex bei vier Grad Celsius unter 30 U/min und schütteln Sie ihn 10 Stunden lang. Tauchen Sie die Mikrokügelchen anschließend unter ständigem Schütteln in einen Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 37 Grad Celsius. Sammeln Sie einen Milliliter des Überstands und ersetzen Sie ihn nach einem, drei, sechs, 10 und 14 Tagen durch einen Milliliter PBS.

Bewerten Sie die Aufnahme- und Freisetzungseffizienz von NELL wie Molekül eins mit der CBQCA-Protein-Assay-Methode gemäß dem Protokoll des Herstellers. Alternativ können Sie elisa durchführen. Die Bioaktivität des NELL-ähnlichen Moleküls, das aus dem Polyelektrolytkomplex freigesetzt wird, wird durch Messung seiner Fähigkeit bewertet, die Expression der alkalischen Phosphatase in Kaninchenknochenmarkstammzellen zu erhöhen.

Keimen Sie 20.000 Kaninchenknochenmarkstammzellen pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte. Und lassen Sie sie einen Tag lang mit einem Milliliter modifiziertem Adlermedium von dulbecco plus 10 % fötalem Rinderserum bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 wachsen. Ersetzen Sie das Medium nach 24 Stunden sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius durch einen Milliliter eines osteogenen Mediums.

und 5% CO2. Geben Sie 300 Mikrogramm des Polyelektrolytkomplexes und des Polyelektrolytkomplexes NELL wie das Molekül eins in die Zellkultureinsätze, um die Komplexe von den Zellen getrennt zu halten. Setzen Sie den Einsatz in die 24-Well-Platte ein, um das Auswaschen von Polyelektrolyt-Komplex-Mikrokügelchen während des osteogenen Mediumwechsels zu vermeiden.

Aspirieren Sie alle drei Tage einen Milliliter des osteogenen Mediums, indem Sie eine Nadel außerhalb des Einsatzes platzieren. Und ersetzen Sie es durch einen Milliliter frisches osteogenes Medium. Bestimmen Sie nach sieben und 14 Tagen Inkubation die Aktivität der alkalischen Phosphatase mit einem Assay-Kit für alkalische Phosphatase.

In Übereinstimmung mit dem Protokoll des Kit-Herstellers. Verpacken Sie die Polyelektrolytkomplexe in die Poren eines bioresorbierbaren Polycaprolacton-Tricalciumphosphat-Gerüsts in medizinischer Qualität. Verwendung eines sterilisierten Spatels in einer BSL2-Kammer.

Geben Sie eine 1,5 Milligramm oder Milliliter Lösung des knochenmorphogenetischen Proteins zwei oder NELL ähnliches Molekül eins auf das Gerüst, das mit dem Polyelektrolytkomplex gefüllt ist. Und über Nacht bei 4 Grad Celsius inkubieren. Alginat-Mikrokügelchen werden unter dem Mikroskop untersucht, um ihre Größe und Morphologie zu überwachen.

Nicht bestrahlte Alginat-Mikrokügelchen sind kugelförmig und das bestrahlte Gegenstück ist tropfenförmig. Die Größenverteilung ist ein wichtiger Faktor für die Aufnahme von Wachstumsfaktoren. Und die Reduzierung der Größe erhöht das Verhältnis von Oberfläche zu Fläche.

Bei der Messung von Alginat-Mikrokügelchen mit der Software image J liefert ein Durchschnitt von 100 Mikrokügelchen eine gute Abschätzung der Größenverteilung in jeder Übereinstimmung der Mikrokügelchen. Da die Aufnahme des Wachstumsfaktors von der richtigen Beschichtungstechnik abhängt, wird die Schichtdicke jeder Beschichtung durch konfokale Mikrosopie beobachtet. Hier werden konfokale Laserscanning-Mikrosopy-Bilder von Alginat-Mikrokügelchen gezeigt, die mit fluoreszierenden Analoga von Protamin, Heparin, NELL wie Molekül eins und knochenmorphogenetischem Protein zwei inkubiert wurden.

Die alkalische Phosphataseaktivität wird verwendet, um die Bioaktivität des freigesetzten Wachstumsfaktors zu messen. Ein 2,2-facher Anstieg der alkalischen Phosphataseaktivität wurde nach Inkubation mit dem Polyelektrolytkomplex NELL like molecule one an Tag 14 beobachtet. Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von fünf Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass die Alginatkonzentrationen die Stabilität der Mikrokügelchen beeinflussen. Für bestrahlte Alginate benötigten wir vier Prozent. Für nicht bestrahlte Gegenstücke benötigten wir einen Zwei-Wege-Prozentsatz.

Nach diesem Verfahren können wir die Belastung mit Wachstumsfaktoren durch die Mehrschichtbeschichtung weiter erhöhen. Diese Technik ermöglicht es Forschern im Bereich Tissue Engineering, die Verabreichung von Wachstumsfaktoren in anderen Krankheitsmodellen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sind Sie in der Lage, einen Polyelektrolytkomplex mit enger Größenverteilung herzustellen.