Name: Polyelektrolytkomplex für Heparin-Bindungsdomäne Osteogenisches Growth Factor Lieferung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von Polyelektrolytkomplexen aus Heparin und Protamin zur kontrollierten Freisetzung osteogener Wachstumsfaktoren. Diese Methode reduziert die BMP-2-Dosis um das 20-fache.

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Diese Studien wurden finanziert durch den National Medical Research Council Clinician Scientist - Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 und NMRC EDG/0022/2008.

1. Alginatlösung Vorbereitung <ol><li> Man löst 200 mg Natriumalginat (nicht bestrahlten) oder 400 mg 8 MRad bestrahlt Natriumalginat in 10 ml doppelt destilliertem Wasser und Schütteln für 1 Stunde für nicht abgestrahlte Alginat und 15 min für bestrahlte Alginat. Lagern Sie die Alginat-Lösung bei 4 ° C über Nacht. Filtern Sie die Alginat-Lösung mit einem sterilen 0,2 um Spritzenfilter vor Alginat Mikrobead Fertigung. </li></ol> 2. Alginate Microbead Fabrication <ol><li> Desinfizieren Sie die elektrostatische Wulst Generator und Spritzenpumpe mit 70% Ethanol und legen Sie sie in der Klasse II Biologische Sicherheitswerkbank (Abbildung 1). </li><li> Ein Glastisch mit einem magnetischen Rührstab im Inneren des Wulst-Generator. </li><li> Stellen Sie den Arm-Elektrode des Wulst-Generator 9 cm über dem Becken. </li><li> Schließen Sie das Elektrodenkabel des Wulstes Generators an die Rändelschraube 2 des Arm - Elektrode und schütten 80 ml ​​SrCl 2 -Lösung in dieBecken. </li><li> Last 5 ml von 0,2 um filtriert Alginat-Lösung in die Spritze und Gummischlauch. Nach dem Verbinden der Gummischlauch auf den Arm Elektrode, einschalten der Spritzenpumpe bei 5 ml / h für 2 min die Luft innerhalb des Schlauchs zu vertreiben und die Alginatlösung in die Spitze der Düse zu liefern. Drehen Sie die Spritzenpumpe ab. </li><li> Als nächstes schalten Sie den encapsulator und dann auf die Spritzenpumpe Mikrobead Generation beginnen. Stellen Sie die Alginat-Strömungsgeschwindigkeit bei 5 ml / h und die Spannung bei 5,8 kV an der encapsulator. Verwerfen, die während der ersten zwei Minuten erzeugt Mikrokügelchen (oder die anfängliche 0,5 ml Alginatlösung aus der Spritze gepumpt), da diese Mikrokügelchen neigen unregelmäßig dimensioniert und geformt sein. </li><li> Sammeln nachfolgende Mikrobeads in 0,2 M Strontiumchloridlösung. Schalten Sie sowohl die Spritzenpumpe und die encapsulator (in dieser Reihenfolge) nach der im voraus geplanten Volumen von Alginat-Lösung zu pumpen. Wiederholen Sie dies für nachfolgende Chargen von Mikrobead Fertigung. Nach Abschluss der Wendef der Spritzenpumpe zunächst durch die encapsulator gefolgt. </li><li> Speichern der Mikrokugeln in 20 ml 0,2 M Strontiumchloridlösung bei 4 ° C über Nacht Vernetzung zu vervollständigen und um das Gel zu stabilisieren. </li></ol> 3. Größe Messung der Alginate Microbeads <ol><li> Sammeln Sie 0,5 ml Alginat-Mikrokügelchen mit einer Plastikpipette und legen Sie es auf einem Glasträger. Sehen Sie sich die Mikrokügelchen unter einem optischen Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung. Nehmen zehn Bilder der Mikrokügelchen mit einem Mikroskop-CCD-Kamera. Speichern Sie die Bilder mit Skala bar (500 &amp; mgr; m) im TIFF-Format bei einer Auflösung von 2.048 x 1.536. </li><li> Unter Verwendung der Länge Werkzeuge in ImageJ, messen Sie die Größe der Mikrokügelchen und Maßstabsleiste (Abbildung 2). Konvertieren Sie die Mikrokügelchen Länge von Pixel zu Mikrometer. <ol><li> Klicken Sie auf die Zeilentools und eine Linie in der Mitte des Alginatkugel ziehen. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Analysieren&quot; auf der Menüleiste und wählen Sie &quot;Messen&quot;. Ein Pop-up-Fenster erscheint. </li><li&gt; Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1-3.2.2 alle Alginatbeads innerhalb des Bildes zu messen. Messen Sie die Maßstabsleiste auf das Bild. </li><li> Konvertieren den Durchmesser des Alginatkugel der tatsächlichen Länge unter Verwendung der Formel: Länge der Alginatkugel / Länge von Maßstabsleiste x 500 um. Zum Beispiel, 1,420 (Durchmesser gemessen von ImageJ) / 2,657 (Maßstab Länge von ImageJ gemessen) * 500 &amp; mgr; m = 267 &amp; mgr; m. </li></ol></li><li> Betrachten Sie die durchschnittliche Größe von 100 Mikrokugeln (Mittelwert ± Standardabweichung) als Vertreter Größe jeder Charge von Mikrokügelchen. </li></ol> 4. Sterilisation <ol><li> Sammeln Sie die Mikrokügelchen eine 100 &amp; mgr; m Nylon-Sieb verwenden und die Perlen mit doppelt destilliertem Wasser waschen. </li><li> Mit einem Spatel, übertragen alle aus Mikrokügelchen von 0,1 ml Alginatlösung in ein 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben und mit Gaze Austrocknen zu verhindern. </li><li> Schließlich sterilisieren die Mikrokügelchen durch Flüssigmodus Autoklavenbehandlung unter Verwendung von (115 ° C, 15 min) oder in Übereinstimmung mit mersteller Angaben. Hinzufügen 1,5 L destilliertem Wasser in die Kammer aus Trockenperlen zu verhindern. </li></ol> 5. Protamin und Heparin-Beschichtung <ol><li> Im Inneren der BSL-2 hood inkubieren die sterile Mikrokügelchen mit 1 ml von 2 mg / ml Protamin Lösung (sterilisiert, um eine 0,2 &amp; mgr; m Spritzenfilter) für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Nach Inkubation der Mikrokugeln für 1 Stunde (Schritt 5.1), sammeln 150 ul der Protaminlösung für die Mikro Bicinchoninsäure (microBCA) Test (Abschnitt 6). </li><li> Waschen Sie die Protamin beschichteten Mikrokügelchen zweimal mit doppelt destilliertem Wasser. Spin down mit einer Tischzentrifuge bei 200 × g für 3 min bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation absaugen Wasser unter Verwendung einer Spritze. </li><li> Inkubieren Protamin beschichteten Mikrobeads mit 1 ml von 0,5 mg / ml Heparinlösung (sterilisiert, um eine 0,2 &amp; mgr; m Spritzenfilter) für 30 min Polyelektrolytkomplex (PEC) zu erstellen. </li><li> Nach dem Protamin beschichteten Mikrokügelchen f Inkubationoder 30 min (Schritt 5.4), sammeln 400 ul der Heparin-Lösung Heparingehalt (Abschnitt 7) zu bestimmen. </li><li> Nach der Inkubation waschen das ungebundene Heparin aus den BBW durch zweimaliges Waschen mit doppelt destilliertem Wasser ab. </li></ol> 6. Protamin Inhalt <ol><li> Führen Sie die microBCA Prüfung nach den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, mit 150 &amp; mgr; l Protaminlösung (vor und nach der Inkubation mit Mikrokugeln gesammelt) in eine 96-Well-Platte. In 150 ul microBCA Arbeitslösung. </li><li> Verwenden Albuminlösung (0, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 und 200 ug / ml) als Kalibrierungsstandards. </li><li> Inkubieren der Mischung für 60 min bei 60 ° C. Messen der Extinktion mit einem Spektrophotometer bei 562 nm. </li><li> Verwenden der Standardkurve, die Protamin-Konzentration von jeder unbekannten Probe zu bestimmen, gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Bestimmen die Protamin-Gehalt der Mikrokügelchen durch die Gesamtmenge von Protamin in der SubtrahierenBeschichtungslösung (vor der Inkubation mit Microbeads) aus der Menge an Protamin in der Beschichtungslösung verbleibende (nach Inkubation mit Microbeads). </li></ol> 7. Heparin Inhalt <ol><li> Bereiten Sie die 10 ml der Arbeitslösung durch Auflösen von 4 mg Toluidinblau und 20 mg Natriumchlorid in 0,01 N Salzsäure. </li><li> Werden 400 ul Probe (aus Schritt 5.5) in die Arbeitslösung in einem Verhältnis von 2: 3 und Vortex für 30 sec. </li><li> Hinzufügen, 600 &amp; mgr; l n-Hexan (äquivalentes Volumen an die Arbeits Reagenslösung) und die Mischung vortexen die Toluidinblau Heparinkomplex zu extrahieren. </li><li> Aspirat 200 &amp; mgr; l der wässrigen Phase durch eine Spritze nach der Phasentrennung. </li><li> Messen der Menge an nicht-extrahierten Toluidinblau in der wässrigen Phase enthielt ein Spektrophotometer bei 631 nm verwendet wird. </li><li> Bereiten Sie Heparin Standardlösungen von 0-20 &amp; mgr; g / ml. </li><li> Zeichnen Sie die 631 nm Lesen jedes Heparin-Standard gegen Heparinkonzentration in g / ml. Verwenden, um die Standardkurve der Heparinkonzentration jeder Probe zu bestimmen. </li></ol> 8. Die konfokale Bild von Schicht-für-Schicht-Struktur <ol><li> Fabrizieren Protamin, Heparin und Nell-1 / BMP-2 Fluoreszenz analog CF-405 Protamin (blau), CF 594 Heparin (rot) und FITC markiertem NELL-1 / FITC markiert (grün) BMP-2 + Heparin + Protamin nach Hersteller technisches Datenblatt. </li><li> Coat 100 &amp; mgr; g Mikrokügelchen mit 300 ul Fluoreszenz analog (Beschichtungsverfahren wie in 5,3-5,6 beschrieben) CF-405 Protamin (blau) (2 mg / ml, 1 h Inkubation), CF 594 Heparin (rot) (0,5 mg / ml, 30 min) und FITC markiert NELL-1 / FITC markiert (grün) BMP-2 (1,5 mg / ml, über Nacht). Waschen der Mikrokügelchen zweimal mit destilliertem Wasser, um die ungebundenen Fluoreszenz Protamin, Heparin und Nell-1 / BMP-2 zu beseitigen. </li><li> Beachten Sie die Schicht- für -Schicht - Struktur (Abbildung 3) durch ein konfokales Mikroskop mit 10 - facher Vergrößerung verwendet wird . 7 </li></ol> 9. BMP-2und Nell-1 Aufnahme und -abgabe <ol><li> Last 13,3 &amp; mgr; l von 1,5 mg / ml BMP-2 oder NELL-1-Lösung auf 100 &amp; mgr; g PEC. Inkubieren PEC bei 4 ° C unter 30 Umdrehungen pro Minute für 10 Stunden Schütteln. </li><li> Tauchen Sie die Mikrokügelchen in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 37 ° C unter konstantem Schütteln (30 rpm). </li><li> Sammeln Sie 1 ml des Überstandes und ersetzen Sie es mit 1 ml PBS nach 1, 3, 6, 10 und 14 Tage. </li><li> Bewerten die Aufnahme und Abgabe Effizienz der BMP-2, um die ELISA-Methode unter Verwendung von nach dem Protokoll des Herstellers. Bewerten die Aufnahme und Abgabe Effizienz NELL-1 die carboxybenzoyl Chinolin-2-carboxaldehyd (CBQCA) Protein-Assay-Verfahren gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Bestimmen Sie kumulative Freisetzung zur Zeit (t): Kumulative Freisetzung zum Zeitpunkt (t) = Freigabe zum Zeitpunkt (t) + vorherige Freigabe zum Zeitpunkt (t-1). </li><li> Plot kumulative Freisetzung von BMP-2 und Nell-1 gegen die Zeit. </li></ol> 10. In - vitro - Bioaktivitätvon Nell-1 Anmerkung: Die Bioaktivität Nell-1 von PEC veröffentlicht wurde durch Messen seiner Fähigkeit bewertet, die Expression von alkalischer Phosphatase (ALP) in Kaninchen-Knochenmark-Stammzellen (rBMSC) zu erhöhen. <ol><li> Seed 20.000 rBMSCs pro Vertiefung in einer Platte mit 24 Vertiefungen und erlauben ihnen 2 einen Tag lang mit 1 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) + 10% fötalem Rinderserum (FBS) bei 37 ° C und 5% CO zu wachsen. </li><li> Nach 24 Stunden, ersetzen Sie das Medium mit 1 ml eines osteogenen Medium (DMEM mit 10% FBS, 2% Penicillin Streptomycin, 50 ug / ml Ascorbinsäure, 10 mmol / L beta-Glycerophosphat und 10 -8 mol / L Dexamethason for) 7 Tage bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Legen 300 &amp; mgr; g PEC-Nell-1 (aus Schritt 8.2) und PEC Inneren Zellkultur-Einsätze (TC Insert), um die PEC halten getrennt von den Zellen (dies vermeidet die Auswaschung von PEC-Mikrokügelchen während der osteogenen Mediumwechsel). Platz TC führen, in den 24-Well-plaß für 14 Tage. </li><li> Sobald alle drei Tage, aspirieren 1 ml des osteogenen Medium durch eine Nadel außerhalb des TC Einsatz platzieren und ersetzen mit 1 ml frischem osteogenen Medium. </li><li> Nach 7 und 14 Tagen Inkubation bestimmen ALP-Aktivität mit einem ALP-Testkit in Übereinstimmung mit dem Protokoll des Kit-Herstellers. <ol><li> Lysieren Zellen mit Assay-Puffer, enthaltend 0,1% Triton X-100 bei 4 ° C für 10 min. Scrape anhaftenden Zellen mit einem Zellschaber aus. Inkubieren bei 4 ° C unter Rühren Zellsuspension für 60 min zumindest. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 2.500 × g bei 4 ° C für 10 min. Sammeln Sie den Überstand für die ALP-Test. </li><li> Zugabe von 50 &amp; mgr; l seriell verdünnte alkalische Phosphatase-Standardlösung 200-0 ng / ml zu den Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen. Die endgültigen Mengen an alkalischer Phosphatase-Standard sind 10, 5, 2,5, 1,2, 0,6, 0,3, 0,15 und 0 ng / Vertiefung. </li><li> Fügen Sie den Überstand von Schritt 10.5.2 (50 &amp; mgr; l / Vertiefung) und verdünnt mit Verdünnung bUffer. </li><li> In 50 ul p - Nitrophenylphosphat (pNPP) Substratlösung in jede Vertiefung. Mischen Sie die Reagenzien durch leichtes Schütteln der Platte für 30 Sekunden. Inkubieren der Mischung für 30 min im Dunkeln. Messen Sie die Absorption bei 405 nm von Plattenleser. </li><li> Berechnen ALP-Aktivität der Kalibrierungskurve. </li></ol></li><li> Bestimmen Proteingehalt des microBCA Protein-Assay-Kit nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. Normalisieren der ALP-Aktivität durch Dividieren ALP-Aktivität von Eiweißgehalt. </li></ol> 11. Zelllebensfähigkeit <ol><li> Inkubieren 200 mg der PEC-NELL-1 mit 1 ml DMEM + 10% FBS bei 37 ° C für 24 Stunden für den 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) Test. </li><li> Seed 2,000 rBMSCs pro Vertiefung (in 100 &amp; mgr; l DMEM mit 10% FBS) in eine 96 - Well - Platte und Inkubation für 1 Tag bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Ersetzen DMEM + 10% FBS mit 100 ul PEC-Nell-1 / PEC-Extrakt und Inkubationbei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Nach 1 Tag oder 3 Tagen Inkubation wurden 10 ul von 5 mg / ml MTT - Lösung hinzufügen und weiter bei 37 ° C, 5% CO 2 für 4 Stunden im Dunkeln inkubieren. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l DMSO-Lösung zu jeder Vertiefung Formazankristalle zu lösen. </li><li> Bestimmen Sie die Absorption bei 570 nm im Mikrotiterplatten-Reader. </li><li> Berechnen Sie die relative Wachstumsrate: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54202/54202eq1.jpg" /></li></ol> 12. Verpackung in Scaffold und BMP-2 &amp; Nell-1 Loading <ol><li> Packen die PECs in die Poren eines bioresorbierbaren medizinischen Grades Polycaprolacton - Tricalciumphosphat (MPCL-TCP) Gerüst eines sterilisierten Spatel in einem BSL-2-Kammer verwendet wird. </li><li> In 1,5 mg / ml Lösung von BMP-2 oder NELL-1 auf den MPCL-TCP Gerüst mit PEC gepackt und Inkubation über Nacht bei 4 ° C. </li></ol>

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</ol>

Wir haben keinen Interessenkonflikt.

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Herstellung von PECs durch die Schicht-für-Schicht self-assembly. Der Schicht-für-Schicht-Struktur wird unter Verwendung von fluoreszierenden Analoga von Protamin, Heparin visualisiert, BMP-2 und Nell-1 und der konfokalen Mikroskopie. Uptake und Release-Tests zeigen, dass auf PEC Heparin osteogenen Wachstumsfaktor Aufnahme und Freisetzung vermittelt. Die Aufnahme Effizienz des PEC Methode ist: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. Der PEC Träger hat eine bessere Modulation Nel...

Die Inzidenz von Pseudoarthrosen wurde berichtet , so hoch wie 10 bis 45% in degenerative Spondylodese und Revisionswirbelsäulenchirurgie 1 sein. Um die Rate der Pseudoarthrose während Wirbelsäulenfusion und andere rekonstruktive Knochenoperationen, osteogenen Wachstumsfaktoren wie BMP-2, Nell-1 1 und von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF) reduzieren wurden eingeführt , um de novo Osteogenese fördern. Unter diesen ist BMP-2 eine beliebte Wahl für Spondylodese 2. Obwohl die Wirksamkeit von BMP-2 bei der Induktion und neue Knochenbildung zu erleichtern wurde gut etabliert 3; klinisch signifikanten Komplikationen wie heterotope Knochenbildung, seroma und Hämatome, Entzündungsreaktion, Radikulitis, Wirbelkörper Osteolyse und rückläufige Ejakulation weiterhin aufgrund der supraphysiologischen Mengen 4,5 Anliegen zu sein. Daher bleibt die Dosis von BMP-2 Absenken einer entsprechenden Strategie in zuminverleitet Nebenwirkungen zu minimieren. Außerdem sind effiziente Trägersysteme erforderlich, um den ersten Ausbruch Freisetzung von BMP-2 beobachtet in der zeitgenössischen Kollagenschwamm Trägersysteme und weiter zu verbessern verlängerte und lokalisierte Abgabe dieses potenten Zytokin zu unterdrücken. Die Schicht- für -Schicht - Selbstorganisation von kationischen und anionischen Polyelektrolyten alternierende kann als abstimmbarer Verfahren eingesetzt werden 6 Polyelektrolytkomplexe zum Aufbau auf der Oberfläche des Gerüsts Matrices oder implantierbare Materialien. In dieser Hinsicht, Heparin (bekannt für die höchste negative Ladungsdichte aller biologischen Agenzien haben) erkannt wurde, mit einer Vielzahl von Wachstumsfaktoren über elektrostatische und Heparin-Bindungsdomänen avidly zu binden. Tatsächlich wurde Heparin gezeigt, um die Halbwertszeit zu verlängern und damit die Bioaktivität von verschiedenen Wachstumsfaktoren zu potenzieren. Auf dieser Basis angepasst unserer Gruppe eine Schicht-für-Schicht self-assembly-Protokoll ein auf Heparin-Basis Polyelektrolytkomplex (PEC) herzustellen, die<html> Lasten und bewahrt die Bioaktivitäten von osteogenen Wachstumsfaktoren während der Immobilisierung 7,8. Die Alginat-Mikrokügelchens Kern wurde durch vernetzende α-L-Guluronat (G) -Resten von Alginat mit zweiwertiges Kation Calcium- oder Strontiumionen hergestellt. Die Alginat-Kern ist ein biologisch abbaubares Gerüst Matrix; die nach der Implantation wird in dem Fusionsbett bietet Raum für das Einwachsen des Knochens resorbiert. Poly-L-Lysin (PLL) oder Protamin als kationische Schicht verwendet mit Interlace sowohl die Gerüstmatrix (in diesem Fall das Alginat Mikrokügelchens Trägerkern) und dem negativ geladenen Heparin; während die anionische Funktionen Heparin Schicht zu stabilisieren und belastet Wachstumsfaktoren zu lokalisieren. Die dreilagige PEC wurde in einem Schweinemodell 9 gezeigt Wachstumsfaktor Belastbarkeit zu erhöhen. Vor kurzem haben PEC Träger wurden in Ratten 10 und Schweinemodellen Spondylodese 8 gezeigt , um erfolgreich die wirksame Dosis von BMP-2 um mindestens das 20-fache zu verringern. ntent &quot;&gt; Hier berichten wir über die Verfahren zur Herstellung von PEC für verbesserte Wachstumsfaktor Lieferung in Spondylodese und den anderen rekonstruktiven Knochenoperationen unter Verwendung von BMP-2 als osteogenen Wachstumsfaktor-Modell.

<table><tbody><tr><td>Biowissenschaften Acrodisc 25&nbsp; mm Spritzenfilter mit 0,2&nbsp; &Mikro; m Supor Membran</td><td>PALL&nbsp;</td><td>PN4612</td><td>Sterile Protamin-Heparin-Lösung durch Ultrafiltration</td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Cell Star&nbsp;</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte Nuclon Delta Surface</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid), MTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5655</td><td>Messung der Zytotoxizität von PEC-NELL-1</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0600/17</td><td>Niederschlag CF-405 markiertes Protamin</td></tr><tr><td>Alamar Blue</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>DAL 1025</td><td>Messung der Zytotoxizität von PEC-BMP-2</td></tr><tr><td>Alkalischer Phosphatase Assay (ALP) Assay Kit</td><td>Anaspec</td><td>AS-72146</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid</td><td>Merck</td><td>Art 1145</td><td>Stoppreagenz in der FITC-Markierung</td></tr><tr><td>Wasserfreies Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>D12345</td><td>Lösungsmittel für fluoreszierendes Isothiocyanat I</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid ( DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Auflösen&nbsp; formazan&nbsp;</td></tr><tr><td>Autoklav</td><td>Hirayama</td><td>HU-110</td><td>Sterilisieren von Alginatkügelchen mit Dampf</td></tr><tr><td>Beta-Glycerophosphat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>BMP-2 (Infusion Bone Graft Large II Kit)&nbsp;</td><td>Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA</td><td>7510800</td><td>Osteogener Wachstumsfaktor, Dialyse ist erforderlich, um die Stabilisatorkomponente zu entfernen, die die FITC-Kopplung stört</td></tr><tr><td>Carboxybenzoylchinolin-2-Carboxaldehyd (CBQCA)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-6222</td><td>Zur Quantifizierung von NELL-1 Protein</td></tr><tr><td>Cell Strainer (100&nbsp; &Mikro; m)</td><td>BD Science</td><td>352360</td><td>PEC für ALP-Assay</td></tr><tr><td>Cell Scraper 290&nbsp; mm Sägebreite 20&nbsp; mm</td><td>SPL Life Science</td><td>90030</td><td>Lösen Sie die Zelle von der 24-Well-Platte</td></tr><tr><td>CF 405S, Succinimidylester</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SCJ4600013</td><td>Blauer Fluoreszenzfarbstoff für die Protaminmarkierung</td></tr><tr><td>CF 594, Hydrazid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SCJ4600031</td><td>Tiefroter Fluoreszenzfarbstoff für die Heparinmarkierung</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 22R</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>Bestandteil des osteogenen Wachstumsmediums</td></tr><tr><td>Dextran Entsalzungssäulen</td><td>Pierce (Thermo Scientific)&nbsp;</td><td>43230</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>12320</td><td></td></tr><tr><td>BMP-2 Quantikine ELISA Kit</td><td>R& D System</td><td>DBP200</td><td>Bestimmung der BMP-2-Freisetzung</td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum FBS</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>Fluoescein Isothiocyananat, Isomer I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7250</td><td>Grüner Fluoreszenzfarbstoff für NELL-1 und BMP-2 Markierung</td></tr><tr><td>ThinCert Zellkultureinsätze, Für 24 Well Platten, steril</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>662630</td><td>Verhindert das Auswaschen von PEC beim Wechsel des osteogenen Mediums</td></tr><tr><td>Havard Appartus Spritzenpumpe (11 plus)</td><td>Havard Apparatur</td><td>70-2208</td><td></td></tr><tr><td>n-Hexan (>99%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>139386</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td>Bindet an den osteogenen Wachstumsfaktor mit Heparin-Bindungsdomäne</td></tr><tr><td>Salzsäure (37%)</td><td>Merck</td><td>100317</td><td>Hochkorrosiver</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Binder</td><td>C8150</td><td></td></tr><tr><td>MicroBCA Protein Assay Kit</td><td>Thermoscientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td>Für ALP- und microBCA-Assays</td></tr><tr><td>Nisco Zellverkapseler</td><td>Nisco Engineering Inc</td><td>Verkapselungseinheit VAR V1</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>mPCL-TCP Gerüst (Porengröße beträgt 1,3&nbsp; mm)</td><td>Osteopore</td><td>PCL-TCP 0/90</td><td>Hold PEC für in vivoStudie</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin 10.000 Einheit/ml, 100&nbsp; ml</td><td>Hyclone Zellkultur</td><td>SV30010</td><td>Antibiotikum</td></tr><tr><td>10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Vivantis</td><td>PB0344-1L</td><td>10x Lösung, ultrareines</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin MW 15.000-30.000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2568</td><td>Polykation</td></tr><tr><td>Protamin Sulfatsalz, aus Lachs</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4020</td><td>Polykation</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Labnet</td><td>S2025</td><td></td></tr><tr><td>Schlangenhaut-Dialyseschlauch 3.500 MWCO 22&nbsp; mm x 35 Fuß</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>68035</td><td>Entfernen Sie nicht umgesetztes FITC durch Dialyse</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Merck</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Qrec</td><td>S5158</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>US Biological</td><td>S4000</td><td>Puffer</td></tr><tr><td>Natriumcarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7795-500G</td><td>Puffer</td></tr><tr><td>Strontiumchlorid Hexahydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>255521</td><td>Vernetzer für Alginatspatel</td></tr><tr><td></td><td>3dia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml Spritze</td><td>Terumo</td><td>140425R</td><td>Durchmesser der Spritze beeinflusst die Durchflussrate</td></tr><tr><td>75 cm2 Zellkulturflasche Canted Neck</td><td>Corning</td><td>730720</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52040</td><td>Heparin-Assay</td></tr><tr><td>Trypsin 1x</td><td>Hyclone Zellkultur</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>Natriumalginat</td><td>Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ)</td><td>Pronova UPMVG</td><td>Kernmaterial von Mikrokügelchen</td></tr></tbody></table>

polyelektrolytkomplex für heparin-bindungsdomäne osteogenisches growth factor lieferung

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Während der rekonstruktiven Knochenoperationen werden supraphysiologischen Mengen von Wachstumsfaktoren empirisch auf Gerüsten geladen erfolgreiche Knochenfusion zu fördern. Große Dosen von hochpotenten biologischen Agenzien werden als Ergebnis der raschen enzymatischen Abbau durch Wachstumsfaktor-Instabilität erforderlich sowie Träger Ineffizienzen in ausreichenden Mengen des Wachstumsfaktors an Implantatstellen zu lokalisieren. Daher Strategien, die die Stabilität von Wachstumsfaktoren wie BMP-2 / NELL-1 und steuern ihre Freilassung zu verlängern könnte tatsächlich ihre wirksame Dosis zu senken und damit die Notwendigkeit für größere Dosen bei zukünftigen Knochenregeneration Operationen reduzieren. Dies wiederum wird Nebenwirkungen und Wachstumsfaktor-Kosten zu reduzieren. Selbstorganisierende PECs wurden hergestellt , eine bessere Kontrolle der BMP-2 / NELL-1 Lieferung über Heparinbindung bereitzustellen , und weiter potenzieren Wachstumsfaktor - Bioaktivität durch Verbesserung in vivo Stabilität. Hier zeigen wir die Einfachheit der PEC Fertigung, die in der delive hilftry einer Vielzahl von Wachstumsfaktoren während der rekonstruktiven Knochen Operationen.

In unserem Träger wurde als Ersatz von Poly-L-Lysin-Protamin gewählt, da sie ähnliche chemische Eigenschaften hat, und es ist von der FDA als Antidot von Heparin zugelassen. Lichtmikroskop zeigte sich, dass die nicht bestrahlten Mikrobeads mit einem Durchmesser von 267 ± 14 &amp; mgr; m in Form sphärisch waren. (0,35 mm Düse, Strömungsgeschwindigkeit von 5 ml / h und 5,8 kV). Die Mehrzahl der bestrahlten Mikrokugeln sind von Tropfenform. Der Durchmesser auf der runden Abschnitt der bestr...

Selbstorganisierte Polyelektrolytkomplexe (PEC), die aus Heparin und Protamin hergestellt wurden, wurden auf Alginatkügelchen abgelagert, um die Freisetzung von osteogenen Wachstumsfaktoren einzufangen und zu regulieren. Diese Verabreichungsstrategie ermöglicht eine 20-fache Reduzierung der BMP-2-Dosis bei Wirbelsäulenfusionsanwendungen. Dieser Artikel veranschaulicht die Vorteile und die Herstellung von PECs.

Polyelektrolytkomplex für Heparin-Bindungsdomäne Osteogenisches Growth Factor Lieferung

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Polyelektrolyt-Komplexhülle herzustellen, die als Träger dient und die Einbindung sowie die gezielte Freisetzung einer breiten Palette von Wachstumsfaktoren mit einer Heparin-Bindedomäne ermöglicht. Diese Methode kann zentrale Fragen im Bereich des orthopädischen Gewebeengineerings hinsichtlich der effizienten Einbindung und gezielten Abgabe von Wachstumsfaktoren beantworten.Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie in der Regel keinen Einsatz von organischen Substanzen erfordert, die bekanntermaßen die biologischen Aktivitäten von Wachstumsfaktoren beeinflussen können. Lösen Sie 200 Milligramm nicht bestrahltes Natriumalginat oder 400 Milligramm mit acht Megarad bestrahltes Natriumalginat in 10 Milliliter doppelt destilliertem Wasser auf.Und eine Stunde lang schütteln. Die Alginate-Lösung über Nacht bei vier Grad Celsius lagern. Die Alginate-Lösung vor der Herstellung von Alginate-Mikroperlen mit einem sterilen 0,2-Mikron-Spritzenfilter filtrieren.Desinfizieren Sie den elektrostatischen BE-Generator und die Spritzenpumpe mit 70 % Ethanol und stellen Sie sie in einen Sicherheitswerkbank der Klasse zwei. Stellen Sie anschließend ein Glasgefäß mit einem magnetischen Rührstab in den BE-Generator. Positionieren Sie die Armelektrode des BE-Generators neun Zentimeter über dem Gefäß.Verbinden Sie das Elektrodenkabel des BE-Generators mit der Neuroschraube zwei der Armelektrode. Geben Sie anschließend 80 Milliliter Strontiumchloridlösung in das Becken. Danach füllen Sie fünf Milliliter einer 0,2-Mikron-gefilterten Alginate-Lösung in die Spritze des Gummischlauchs.Nachdem der Gummischlauch an die Armelektrode angeschlossen wurde, schalten Sie die Spritzenpumpe für zwei Minuten mit fünf Millilitern pro Stunde ein, um die Luft innerhalb des Schlauchs zu entfernen und die Alginate-Lösung an die Spitze der Düse zu bringen.Danach schalten Sie die Spritzenpumpe aus. Um die Mikroperlenherstellung zu beginnen, stellen Sie den Kapselungsapparat auf 5,8 Kilovolt ein, gefolgt von der Spritzenpumpe mit einer Alginatflussrate von fünf Milliliter pro Stunde.Entsorgen Sie die während der ersten zwei Minuten erzeugten Mikroperlen, da diese tendenziell unregelmäßige Größe und Form aufweisen. Sammeln Sie die anschließend erzeugten Mikroperlen in der 0,2-molaren Strontiumchloridlösung. Schalten Sie zunächst die Spritzenpumpe und anschließend den Kapselungsapparat aus.Nach dem Abpumpen des geplanten Volumens der Alginate-Lösung. Wiederholen Sie dies für nachfolgende Chargen der Mikroperlen-Herstellung. Lagern Sie die Mikroperlen über Nacht in 20 Millilitern einer 0,2-molaren Strontiumchlorid-Lösung bei vier Grad Celsius, um die Vernetzung abzuschließen und das Gel zu stabilisieren.Sammeln Sie 0,5 Milliliter Alginate-Mikroperlen mit einer Plastikpipette und geben Sie sie auf einen Objektträger. Betrachten Sie die Mikroperlen unter einem optischen Mikroskop bei 10facher Vergrößerung.Nehmen Sie 10 Bilder der Mikroperlen mit einer Mikroskop-CCD-Kamera auf. Speichern Sie die Bilder mit einem Maßstab von 500 Mikrometern im TIFF-Format mit einer Auflösung von 2048 mal 1536. Messen Sie mithilfe der Längenwerkzeuge in ImageJ die Größe der Mikroperlen.Und der Maßstabsbalken. Konvertieren Sie dann die Länge des Mikroperls von Pixel in Mikrometer. Klicken Sie auf das Linienwerkzeug und zeichnen Sie eine Linie über die Mitte der Alginateperle.Klicken Sie auf der Menüleiste auf „Analysieren“ und wählen Sie „Messen“. Ein Popup-Fenster wird angezeigt. Wiederholen Sie diese Schritte, um alle Alginate-Perlen innerhalb des Bildes zu messen.Messen Sie die Maßstabsleiste auf dem Bild. Sammeln Sie die Mikroperlen mithilfe des Nylonfilters mit 100-Mikron-Netz. Und waschen Sie die Perlen mit doppelt destilliertem Wasser.Überführen Sie mit einem Spatel alle Mikroperlen, die aus 0,1 Milliliter der Alginate-Lösung hergestellt wurden, in ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und bedecken Sie sie mit Gaze, um Austrocknung zu verhindern. Sterilisieren Sie die Mikroperlen abschließend durch Autoklavieren im Flüssigkeitsmodus oder gemäß den Herstellerangaben. Geben Sie 1,5 Liter destilliertes Wasser in die Kammer, um zu verhindern, dass die Perlen austrocknen.Im BSL-2-Abzug die sterilen Mikroperlen für eine Stunde bei Raumtemperatur mit einem Milliliter sterilisierter Protaminlösung (2 Milligramm pro Milliliter) inkubieren. Die mit Protamin beschichteten Mikroperlen zweimal mit doppelt destilliertem Wasser waschen. Anschließend durch Zentrifugation bei 200 × g für drei Minuten bei Raumtemperatur sedimentieren.Nach der Zentrifugation das Wasser mit einer Spritze abziehen. Inkubieren Sie protaminbeschichtete Mikroperlen mit einem Milliliter sterilisierter Heparinlösung (0,5 Milligramm pro Milliliter) für 30 Minuten. Dadurch entsteht eine Polyelektrolyt-Komplexhülle mit hoher Affinität zur Bindung heparinbindender Wachstumsfaktoren.Nach der Inkubation das Heparin mit einer Spritze abpipettieren. Spülen Sie das nicht gebundene Heparin durch zweimaliges Waschen mit doppelt destilliertem Wasser von den Polyelektrolytkomplexen ab. Geben Sie 13,3 Mikroliter einer Lösung mit 1,5 Milligramm pro Milliliter Knochen-morphogenetischem Protein 2 oder NELL-ähnlichem Molekül 1 auf 100 Mikrogramm des Polyelektrolytkomplexes.Incubieren Sie den Polyelektrolytkomplex bei vier Grad Celsius unter 30 U/min für 10 Stunden unter Schütteln. Danach tauchen Sie die Mikroperlen in ein Milliliter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei 37 Grad Celsius mit konstantem Schütteln ein. Sammeln Sie ein Milliliter des Überstandes und ersetzen Sie ihn durch ein Milliliter PBS nach einem, drei, sechs, 10 und 14 Tagen.Beurteilen Sie die Aufnahme- und Freisetzungsrate des NELL-ähnlichen Moleküls eins unter Verwendung der CBQCA-Protein-Assay-Methode gemäß der Herstelleranleitung. Alternativ kann ein ELISA durchgeführt werden. Die Bioaktivität des aus dem Polyelektrolytkomplex freigesetzten NELL-ähnlichen Moleküls eins wird bewertet, indem seine Fähigkeit gemessen wird, die Expression von alkalischer Phosphatase in Kaninchen-Knochenmark-Stammzellen zu erhöhen.Impfen Sie 20.000 Kaninchen-Knochenmark-Stammzellen pro Vertiefung in eine 24-Loch-Platte. Lassen Sie sie einen Tag lang mit einem Milliliter Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium plus 10 % fetalem Kälberserum bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 wachsen. Nach 24 Stunden ersetzen Sie das Medium durch ein Milliliter osteogenes Medium und inkubieren sie sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius.und 5 % CO₂. Geben Sie 300 Mikrogramm Polyelektrolytkomplex und Polyelektrolytkomplex-NELL-ähnliches Molekül eins in Zellkultur-Einsätze, um die Komplexe von den Zellen getrennt zu halten. Stellen Sie den Einsatz in die 24-Well-Platte, um das Ausspülen der Polyelektrolytkomplex-Mikroperlen während des Mediumwechsels mit osteogenem Medium zu verhindern.Alle drei Tage ein Milliliter des osteogenen Mediums abpipettieren, indem eine Nadel außerhalb des Inserts platziert wird, und durch ein Milliliter frisches osteogenes Medium ersetzen. Nach sieben und 14 Tagen Inkubation die Aktivität der alkalischen Phosphatase mit einem Nachweiskit für alkalische Phosphatase bestimmen.Entsprechend dem Protokoll des Kit-Herstellers. Verpacken Sie die Polyelektrolyt-Komplexe in die Poren eines bioresorbierbaren medizinischen Polycaprolacton-Tri-Calciumphosphat-Gerüsts unter Verwendung eines sterilisierten Spatels in einer BSL2-Kammer.Geben Sie eine 1,5 Milligramm- oder Milliliter-Lösung von Bone Morphogenetic Protein 2 oder NELL-ähnlichem Molekül 1 auf das mit Polyelektrolyt-Komplex beladene Gerüst. Inkubieren Sie über Nacht bei 4 Grad Celsius. Die Alginate-Mikroperlen werden unter dem Mikroskop auf Größe und Morphologie überprüft.Nicht bestrahlte Alginate-Mikroperlen sind kugelförmig, während die bestrahlten perlenförmig wie Tränen sind. Die Größenverteilung ist ein wichtiger Faktor für die Aufnahme von Wachstumsfaktoren. Eine Verringerung der Größe erhöht das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen.Bei der Vermessung von Alginate-Mikrobeads mittels Image-J-Software liefert ein Durchschnitt von 100 Mikrobeads eine gute Schätzung der Größenverteilung in jedem Ansatz von Mikrobeads. Da die Aufnahme von Wachstumsfaktoren von der korrekten Beschichtungstechnik abhängt, wird die Schichtdicke jeder Beschichtung mittels konfokaler Mikroskopie beobachtet. Hier sind konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-Aufnahmen von Alginate-Mikrobeads dargestellt, die mit fluoreszierenden Analoga von Protamin, Heparin, NELL-ähnlichem Molekül eins und knochenmorphogenetischem Protein zwei inkubiert wurden.Die Aktivität der alkalischen Phosphatase wird zur Messung der Bioaktivität des freigesetzten Wachstumsfaktors verwendet. Ein Anstieg der alkalischen Phosphatase-Aktivität um den Faktor 2,2 wurde nach Inkubation mit dem Polyelektrolyt-Komplex NELL-ähnliches Molekül eins am Tag 14 beobachtet. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von fünf Stunden durchgeführt werden.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass die Alginate-Konzentration die Stabilität der Mikroperlen beeinflusst. Für bestrahlte Alginates betrug die erforderliche Konzentration vier Prozent, für nicht bestrahlte Alginates zwei Prozent.Mit diesen Verfahren kann die Wachstumsfaktorbeladung durch mehrschichtige Beschichtung weiter erhöht werden. Diese Technik ermöglicht es Forschern im Bereich des Gewebeengineerings, die Abgabe von Wachstumsfaktoren in anderen Krankheitsmodellen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sind Sie in der Lage, Polyelektrolytkomplexe mit enger Größenverteilung herzustellen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

In den folgenden Abschnitten beschreiben wir Verfahren zur Herstellung von Alginat-Mikrokugeln für den Einsatz in biomedizinischen Anwendungen. Wir illustrieren speziell eine Technik zur Erstellung mehrschichtiger Alginat-Mikrokugeln für den doppelten Zweck der Zell-und Protein-Kapselung als potenzielle Therapie für Typ 1 Diabetes.

Erzeugung von Alginat-Mikrokugeln für biomedizinische Anwendungen

Wir beschreiben ein Verfahren zum Erreichen effizienten Immobilisierung von BMP-2 auf die Oberflächen. Unser Ansatz beruht auf der Bildung einer selbstorganisierten Monoschicht, um die kovalente Bindung des BMP-2 mit seinem freien Aminresten zu erreichen basiert. Dieses Verfahren ist ein nützliches Werkzeug, um Signalisierung auf der Zellmembran zu studieren.

Die kovalente Bindung von BMP-2 auf Oberflächen mit einem selbstorganisierten Monoschicht-Ansatz

Dieses Protokoll kombiniert Elektrospinnen und Mikrosphären, um Gewebegerüste zu entwickeln, die Neuronen lenken. Der Nervenwachstumsfaktor wurde in PLGA-Mikrosphären eingekapselt und in faserige Gerüste aus Hyaluronsäure (HA) elektrogesponnen.  Die Proteinbioaktivität wurde getestet, indem die Gerüste mit den Spinalwurzelganglien des Primärkükens besät und 4-6 Tage lang kultiviert wurden.

Elektro Growth Factor Releasing Mikrosphären in Fasergerüste

Ein Schritt-für-Schritt-Prozess zur Erstellung einer knochenähnlichen Vorlage mit künstlichen Mikrokanälen wird vorgestellt. Die hohe Absorptions- und Retentionsfähigkeit des Templates wird durch die Kapillarwirkung über Mikrokanäle demonstriert.

Distinctive Kapillarwirkung durch Mikrokanäle in knochenähnliche Vorlagen können Rekrutierung von Zellen für die Wiederherstellung der Große Knochendefekt Enhance

Gerüste für das Tissue Engineering müssen die komplexe biochemische und biophysikalische Mikroumgebung der zellulären Nische rekapitulieren. Hier zeigen wir die Verwendung von Grenzflächen-Polyelektrolyt-Komplexierungsfasern als Plattform zur Herstellung von zusammengesetzten, mehrkomponentigen Polymergerüsten mit anhaltender biochemischer Freisetzung.

Verbund Scaffolds für Grenzflächen Polyelectrolyte Fasern für zeitlich kontrollierte Freisetzung von Biomolekülen

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Anreicherung von Thymusepithelzellen (TECs) mit einem Dichtegradienten für die FACS-Isolierung. Es zeigt auch die Verwendung von EAK16-II/EAKIIH6-Peptiden zur Förderung der TEC-Aggregatbildung. Die Mikroumgebungen des Hydrogels EAK16-II/EAKIIH6 bieten die 3-D-Konfiguration, die zur Aufrechterhaltung des Überlebens und der Funktion der TECs erforderlich ist.

Die Förderung der 3-D-Aggregation von FACS Purified Thymusepithelzellen mit EAK 16-II / EAKIIH6 Selbstaufbau Hydrogels

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Blutgefäß Bildung in Vivo zu visualisieren und in Echtzeit in 3D Gerüste multiphoton Mikroskopie. Angiogenese in gentechnisch veränderten Gerüste wurde in einem murinen calvarial kritische Knochen-defekt-Modell untersucht. Mehr neue Blutgefäße waren in der Behandlungsgruppe als Kontrollen erkannt.

Visualisierung von Angiogenese durch Multiphoton Mikroskopie In Vivo in gentechnisch veränderten 3D-PLGA/nHAp Gerüst für Calvarial kritische Knochen defekt Reparatur

Biomaterialien, dotiert mit Knochen morphogenetische Protein-2 (BMP2) wurden als neue therapeutische Strategie zur Pseudarthrose Knochenbrüche zu heilen. Um Nebenwirkungen durch eine unkontrollierbare Freigabe des Faktors zu überwinden, schlagen wir eine neue Strategie zur Website-Faktors, wodurch Materialien mit verbesserten osteogene Funktionen direkt zu immobilisieren.

Site-verwiesene Immobilisierung von Knochen morphogenetische Protein 2 an feste Oberflächen durch Click-Chemie

Ein In-vitro-Modell der Gefäßnische des Knochenmarks wird erstellt, indem mesenchymale und endotheliale Zellen auf vorgegossene 3D-PEG-Hydrogele gesät werden. Die endothelialen Netzwerke, die EZM-Komponenten und die ALP-Aktivität der Nischen variieren je nach verwendetem Wachstumsfaktor. Die Plattform kann für fortgeschrittene Krebsmodelle verwendet werden.

Einfache Etablierung einer vaskularisierten osteogenen Knochenmarksnische unter Verwendung von vorgegossenen Poly(ethylenglykol) (PEG)-Hydrogelen in einer bildgebenden Mikrotiterplatte

Die Knochentherapie über endochondrale Ossifikation durch Implantation von künstlichem Knorpelgewebe aus mesenchymalen Stammzellen hat das Potenzial, die Nachteile konventioneller Therapien zu umgehen. Hyaluronsäure-Hydrogele sind wirksam bei der Skalierung gleichmäßig differenzierter Knorpeltransplantate sowie bei der Schaffung von integriertem Knochen mit Vaskularisierung zwischen fusionierten Transplantaten in vivo.

Integrierte Knochenbildung durch in vivo ennochondrale Ossifikation mit mesenchymalen Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese, Hämoglobin-Einkapselung und Oberflächen-PEGylation hierarchisch poröser UiO-66-Nanopartikel, die für die Sauerstoffabgabe entwickelt wurden. Das Verfahren kombiniert Defekttechnik mit dehnungsgeförderter biorthogonaler Konjugation, um hochdurchlässige und physiologisch stabile Träger zu erzeugen, die für biomedizinische Anwendungen geeignet sind.

Synthese, Hämoglobinkapselung und biorthogonale PEGylation in hierarchisch porösen UiO-66-Nanopartikeln für Anwendungen zur Sauerstoffabgabe

Erfahren Sie die Herstellung von Polyelektrolytkomplexen aus Heparin und Protamin zur kontrollierten Freisetzung osteogener Wachstumsfaktoren. Diese Methode reduziert die BMP-2-Dosis um das 20-fache.

Polyelektrolytkomplex für Heparin-Bindungsdomäne Osteogenisches Growth Factor Lieferung

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