Nachweis von RNA-bindenden Proteinen durch

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, RNA-bindende Proteine eines RNA-Transkripts aus braunem Fettgewebe zu isolieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in diesem Forschungsbereich zu beantworten, beispielsweise welche regulatorischen Mechanismen bei langlebigen kodierenden RNAs und assoziierten RNA-Proteinen eine Rolle spielen. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes liegt darin, dass er einfach durchzuführen ist.

Die für diese Methode verwendete RNA ist ein Fragment der Antigenrezeptor-3-Prime-nichtübersetzten Region, im Folgenden als AR 3-Prime UTR bezeichnet. Beginnen Sie mit der Amplifikation des T7-AR-Oligos und der Teili-Sequenz der Firefly-Luciferase-DNA aus dem psiCHECK-2-Plasmid. Die verwendeten Primer und Parameter sind im beigefügten Dokument aufgeführt.

Nach der Amplifikation verwenden Sie die PCR-Produkte als Vorlagen, um mithilfe eines In-vitro-Transkriptionskits biotinylierte RNAs gemäß den Herstelleranweisungen zu synthetisieren. Inkubieren Sie danach das Gemisch vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie nach der In-vitro-Transkription ein Mikroliter DNase zur Reaktion hinzu und inkubieren Sie diese 15 Minuten bei 37 Grad Celsius, um die Vorlagen-DNA abzubauen.

Anschließend das Gesamtvolumen mit Wasser auf 60 Mikroliter auffüllen. Die biotinylierten RNA-Moleküle zur Entfernung von Salz und nicht eingebauten Nukleotiden auf Reinigungssäulen auftragen. Danach, nach der Bestimmung der RNA-Konzentration, die RNase bei minus 80 Grad Celsius für nachfolgende Pull-down-Assays lagern.

Am Tag des Assays das gefrorene biotinylierte RNA auf Eis auftauen. Um sicherzustellen, dass die RNA von Interesse die richtige sekundäre Struktur aufweist, anschließend 50 Mikroliter davon bei 90 Grad Celsius für zwei Minuten erhitzen. Anschließend zwei Minuten auf Eis abkühlen.

Fügen Sie anschließend 50 Mikroliter 2X RNA-Strukturpuffer hinzu und lassen Sie die RNA 30 Minuten bei Raumtemperatur falten. Danach resuspendieren Sie die mit Streptavidin beschichteten magnetischen Perlen durch kurzes Vortexen im ursprünglichen Vial. Überführen Sie dann 150 Mikroliter der resuspendierten Perlen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Stellen Sie das Röhrchen eine Minute lang auf einen Magnethalter, um die magnetischen Kügelchen und den Überstand zu trennen. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette. Behalten Sie das Kügelchen-Pellet.

Waschen Sie die Kügelchen einmal, indem Sie das Kügelchen-Pellet in einem Milliliter des vom Hersteller empfohlenen 1X-Bindungs- und Waschpuffers resuspendieren und anschließend das Röhrchen fünf Minuten bei Raumtemperatur auf einen Rotator stellen. Waschen Sie zweimal mit Puffer A und Puffer B. Nach der Inkubation entsorgen Sie den Überstand und behalten das Kügelchen-Pellet.

Als Nächstes resuspendieren Sie das Bead-Pellet in 300 µL 2X Wasch- und Bindungspuffer. Verteilen Sie die Beads gleichmäßig auf drei 1,5-mL-Röhrchen mit jeweils 100 µL Beads pro Röhrchen. Geben Sie 100 µL RNase-freies Wasser, 100 µL biotinylierte Firefly-Luciferase-RNA und 100 µL biotinylierte AR-3'-UTR-RNA hinzu.

Inkubieren Sie jede Kügelchenmischung eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Rotation. Danach stellen Sie die Röhrchen eine Minute lang auf den Magneten. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand.

Behalten Sie die Bead-Pellets. Waschen Sie die Beads anschließend zweimal, indem Sie die Bead-Pellets jedes Mal mit 400 µL 1X Wasch- und Bindungspuffer resuspendieren und dann für fünf Minuten bei Raumtemperatur auf den Rotator stellen. Stellen Sie die Röhrchen danach für eine Minute auf einen Magneten.

Entfernen und verwerfen Sie anschließend sämtlichen Überstand. Resuspendieren Sie jedes Pellet aus Kügelchen in 50 Mikrolitern Kernisolationspuffer. Stellen Sie für die Vorbereitung auf den nächsten Teil des Protokolls sicher, dass alle Puffer sowie die Dounce-Glashomogenisatoren auf Eis gekühlt sind.

Die Herstellung des Zelllysats sollte auf Eis erfolgen. Für jeden durchzuführenden RNA-Pull-down-Assay bereiten Sie eine 15-Zentimeter-Schale differenzierter Präadipozyten aus dreiwöchigen C57 Black Six Wildtyp-Mäusen vor. Vier bis fünf Tage später geben Sie 10 bis 15 Milliliter PBF hinzu und lösen die Zellen mithilfe eines Zellabstreifers von der Schale ab, um die Zellen zu gewinnen.

Überführen Sie sie in ein 50-Milliliter-Röhrchen und pelletieren Sie sie anschließend durch Zentrifugation bei 200 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Zentrifugieren verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um den Überstand abzusaugen und zu verwerfen. Suspendieren Sie dann das Zellpellet in zwei Milliliter hypotonischem Puffer und inkubieren Sie die Zellen für fünfzehn Minuten auf Eis.

Überführen Sie die Zellen in einen 15-Milliliter-Dounce-Glashomogenisator und zerkleinern Sie die Zellen mechanisch auf Eis mit 20 Stößen. Pelletieren Sie die Zellkerne durch Zentrifugation bei 3300 × g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Überführen Sie nach der Zentrifugation das Überstandsgemisch in 1,5-Milliliter-Röhrchen und bewahren Sie das Pellet auf Eis für die spätere Verwendung auf.

Zum Überstand 3-molare Kaliumchloridlösung hinzufügen, um eine Endkonzentration von 150 Millimolar zu erreichen. Bei vier Grad Celsius 15 Minuten lang mit 20.000 ×g zentrifugieren. Nach der Zentrifugation befindet sich eine Lipidschicht an der Oberseite.

Entfernen Sie es vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Pipette. Sammeln Sie dann den zytoplasmatischen Zelllysat-Überstand. Resuspendieren Sie anschließend das Nuklei-Pellet unter Verwendung einer Ein-Milliliter-Pipette in einem Milliliter Nukleus-Isolierpuffer und überführen Sie es in einen 15-Milliliter-Dounce-Glashomogenisator.

Zerreißen Sie die Kerne mechanisch auf Eis mit 100 Stößen. Pelletieren Sie die nukleären Rückstände durch Zentrifugation bei 20.000 × g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand als nukleären Zelllysat.

Diese können mit dem zuvor gesammelten zytoplasmatischen Lysat kombiniert oder für spätere Anwendungen getrennt aufbewahrt werden. Hier werden die Proben im Verhältnis eins zu eins kombiniert. Geben Sie einen RNase-Inhibitor zum unfractionierten Zelllysat hinzu, um eine Endkonzentration von 0,5 Einheiten pro Mikroliter zu erreichen.

Danach 100 Mikroliter des Zelllysats auf Eis beiseitestellen, um als Input-Kontrolle für die Westernblot-Analyse zu dienen. Das Zelllysat in drei gleiche Aliquots aufteilen, wobei jeweils ein Milliliter Zelllysat in je eine 1,5-Milliliter-Röhrchen gegeben wird, und jeweils mit unbeladenen Firefly-Luciferase-RNA-gebundenen sowie AR-3'-UTR-gebundenen Kügelchen drei Stunden bei vier Grad Celsius unter Rotation inkubieren. Nach der Inkubation die Röhrchen eine Minute lang auf den Magneten stellen.

Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um den Überstand zu sammeln, isolieren Sie anschließend die RNA und überprüfen Sie die Integrität der RNA wie in dem begleitenden Dokument beschrieben. Bewahren Sie die Pellets der Kugeln auf Eis auf. Waschen Sie die magnetischen Kugeln sechsmal.

Wiederholen Sie diesmal das Resuspendieren der Bead-Pellets in einem Milliliter Nukleus-Isolierpuffer, der 40 Einheiten eines RNase-Inhibitors und 0,25 Prozent Igepal enthält. Inkubieren Sie die Röhrchen unter Schwenken für zwei Minuten bei Raumtemperatur. Stellen Sie die Röhrchen anschließend auf einen Magnethalter, um die magnetischen Beads vom Überstand zu trennen.

Nach einer Minute den Überstand abpipettieren und verwerfen, dann die Pellets mit den Kügelchen auf Eis stellen. Um die RNA-Protein-Komplexe zur Western-Blot-Analyse von den Kügelchen zu eluieren, resuspendieren Sie zunächst jeden Kügelchen-Pellet in 75 µL Puffer zur Isolierung von Zellkernen. Anschließend 25 µL 4X Western-Blot-Lade-Puffer hinzufügen.

mit SDS, um ein Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern zu erhalten. Schließlich die Kügelchen in dieser 100-Mikroliter-Lösung fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius zum Kochen bringen. Führen Sie die Westernblot-Analyse zur Bestätigung des RBP wie in dem begleitenden Dokument beschrieben durch.

In diesem Experiment wurde ein RNA-Fragment des Antigenrezeptors als Köder verwendet, um das bindende Protein HuR anzureichern. Sowohl ein Firefly-Luciferase-RNA-Köder, der nicht mit dem HuR-Protein verwandt ist, als auch eine Portion unkonjugierter blanker Streptavidin-Kügelchen dienten als negative Kontrollen. RNA-Protein-Interaktionen können entweder im Zellkern oder im Zytoplasma auftreten, und dieses Pull-down-Protokoll kann entweder auf gesamte oder fraktionierte nukleäre bzw. zytoplasmatische Zelllysate angewendet werden.

Die Analyse mittels Western-Blot zeigte das HuR-Protein im unfractionierten Zelllysat bzw. Input unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers. Auch die Elutionsfraktion der Antigenrezeptor-RNA ergab ein positives Ergebnis, was auf das Vorhandensein des HuR-Proteins im Adipozytenlysat hinweist, das mit antigenrezeptor-RNA-konjugierten Kügelchen für den RNA-Pull-down-Assay verwendet wurde. Sowohl die Elutionsfraktion der Feuerlysen-Luciferase-RNA als auch die Probe mit unbeladenen Kügelchen ergaben negative Ergebnisse, was darauf hindeutet, dass unspezifische Wechselwirkungen mit diesem Ansatz nicht nachweisbar waren.

Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Wechselwirkung zwischen dem Antigenrezeptor-RNA-Fragment und dem HuR-Protein spezifisch war. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man RNA-bindende Proteine von einem RNA-Transkript aus braunem Fettgewebe isolieren kann. Wenn man die Methode einmal beherrscht, kann dies innerhalb von 24 Stunden durchgeführt werden, vorausgesetzt, sie wird korrekt durchgeführt.