Nachweis von RNA-bindenden Proteinen durch In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Kultur
22. Juli 2016
Ein RNA-Pull-down-Protokoll wird für den Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteine (RBPs) und nicht-codierende sowie kodierenden RNAs hier optimiert. Ein RNA-Fragment von Androgen-Rezeptor (AR) wurde als Beispiel verwendet, zu zeigen, wie ihre RBP aus lystate primärer braunen Fettzellen zu erhalten.
Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, RNA-bindende Proteine eines RNA-Transkripts aus braunem Fettgewebe zu gewinnen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen in diesem Bereich zu beantworten, z. B. welche Regulationsmechanismen von langlebiger kodierender RNA und zugehörigen RNA-Proteinen bestehen. Der Hauptvorteil dieser Taktik besteht darin, dass sie einfach durchzuführen ist.
Die RNA, die zur Demonstration dieses Verfahrens verwendet wird, ist ein Fragment der Antigenrezeptor-3-Prime-Region, die im Folgenden als AR 3-Prime-UTR bezeichnet wird. Beginnen Sie mit der Amplifikation des T7 AR-Oligos und der Teilsequenz der Glühwürmchen-Luziferase-DNA aus dem psiCHECK-2-Plasmid. Die verwendeten Primer und Parameter sind im Begleitdokument aufgeführt.
Verwenden Sie nach der Amplifikation die PCR-Produkte als Vorlagen, um biotinylierte RNAs mit einem In-vitro-Transkriptionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu synthetisieren. Dann inkubieren Sie die Mischung vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nach der In-vitro-Transkription fügen Sie der Reaktion einen Mikroliter Dnase hinzu und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Matrizen-DNA abzubauen.
Bringen Sie dann das Gesamtvolumen mit Wasser auf 60 Mikroliter. Wenden Sie die biotinylierten RNAs an Reinigungssäulen an, um das Salz und die nicht eingebauten Nukleotide zu entfernen. Nach der Messung der RNA-Konzentration lagern Sie die RNase bei minus 80 Grad Celsius für nachfolgende Pull-down-Assays.
Tauen Sie am Tag des Assays die gefrorene biotinylierte RNA auf Eis auf. Um sicherzustellen, dass die RNA von Interesse die richtige Sekundärstruktur hat, erhitzen Sie dann 50 Mikroliter davon zwei Minuten lang bei 90 Grad Celsius. Zwei Minuten auf Eis kalt stellen.
Fügen Sie als nächstes 50 Mikroliter 2X RNA-Strukturpuffer hinzu und lassen Sie die RNA 30 Minuten lang bei Raumtemperatur falten. Als nächstes resuspendieren Sie Streptavidin-beschichtete Magnetkügelchen in ihrem ursprünglichen Fläschchen, indem Sie sie kurz vortexen. Übertragen Sie dann 150 Mikroliter der resuspendierten Kügelchen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.
Legen Sie das Röhrchen für eine Minute in einen Magnetständer, um die Magnetkügelchen und den Überstand zu trennen. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen und zu entsorgen. Bewahren Sie das Perlenpellet auf.
Waschen Sie die Kügelchen einmal, indem Sie das Perlenpellet in einem Milliliter des vom Hersteller empfohlenen 1X-Bindungs- und Waschpuffers resuspendieren, und legen Sie das Röhrchen dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Rotater. Mit Puffer A und Puffer B zweimal waschen. Entsorgen Sie nach der Inkubation den Überstand und bewahren Sie das Kügelchen auf.
Als nächstes resuspendieren Sie das Bead-Pellet in 300 Mikrolitern 2X Wasch- und Bindepuffer. Teilen Sie die Kügelchen gleichmäßig in drei 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 100 Mikrolitern Kügelchen pro Röhrchen auf. Fügen Sie 100 Mikroliter RNase-freies Wasser, 100 Mikroliter biotinylierte Glühwürmchen-Luciferase-RNA und 100 Mikroliter biotinylierte AR 3-Prime UTR-RNA hinzu.
Inkubieren Sie jede Bead-Mischung eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit Rotation. Legen Sie dann die Röhren für eine Minute auf den Magneten. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
Bewahren Sie die Perlenpellets auf. Waschen Sie anschließend die Kügelchen zweimal, resuspendieren Sie die Perlenpellets jedes Mal mit 400 Mikrolitern 1X Wasch- und Bindungspuffer und legen Sie sie dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf den Rotater. Legen Sie die Röhrchen für eine Minute auf einen Magneten.
Entfernen und entsorgen Sie dann den gesamten Überstand. Jedes Bead-Pellet wird in 50 Mikrolitern nuklearem Isolationspuffer resuspendiert. Stellen Sie zur Vorbereitung auf den nächsten Teil des Protokolls sicher, dass alle Puffer sowie die dounce Glashomogenisatoren auf Eis gekühlt werden.
Die Zelllysatvorbereitung sollte auf Eis erfolgen. Für jeden durchzuführenden RNA-Pulldown-Assay ist eine 15-Zentimeter-Schale mit differenzierten Präadipozyten von drei Wochen alten C57 Black Six-Wildtyp-Mäusen vorzubereiten. Vier bis fünf Tage später, um die Zellen zu ernten, fügen Sie 10 bis 15 Milliliter PBF hinzu und verwenden Sie dann einen Zellschaber, um die Zellen aus der Schale zu entfernen.
Füllen Sie sie in ein 50-Milliliter-Röhrchen und pelletieren Sie sie dann durch Zentrifugation bei 200-facher G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Verwenden Sie nach dem Schleudern eine Ein-Milliliter-Pipette, um den Überstand abzusaugen und zu verwerfen. Dann resuspendieren Sie das Zellpellet in zwei Millilitern hypotonischem Puffer und inkubieren Sie die Zellen fünfzehn Minuten lang auf Eis.
Übertragen Sie die Zellen in einen 15-Milliliter-Dounce-Glashomogenisator und scheren Sie die Zellen mechanisch mit 20 Hüben auf Eis. Pelletieren Sie die Zellkerne durch Zentrifugation bei 3300 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Füllen Sie den Überstand nach dem Schleudern in 1,5-Milliliter-Röhrchen um und bewahren Sie das Pellet für die spätere Verwendung auf Eis auf.
Dem Überstand wird 3-molares Kaliumchlorid zugesetzt, um eine Endkonzentration von 150 Millimolar zu erhalten. Drehen Sie sich 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 20.000 Mal G. Nach der Zentrifugation befindet sich auf der Oberseite eine Lipidschicht.
Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um es vorsichtig zu entfernen. Sammeln Sie dann den citoplasmatischen Zelllysat-Überstand. Als nächstes wird das Kernpellet mit einer Ein-Milliliter-Pipette in einem Milliliter Kernisolationspuffer resuspendiert und in einen 15-Milliliter-Dounce-Glashomogenisator überführt.
Scheren Sie die Kerne mechanisch auf Eis mit 100 Hüben. Pelletieren Sie den nuklearen Schutt durch Zentrifugation bei 20.000 G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand als nukleäres zelluläres Lysat.
Diese können mit dem zuvor gesammelten zytoplasmatischen Lysat kombiniert oder für spätere Anwendungen getrennt aufbewahrt werden. Dabei werden die Proben im Verhältnis eins zu eins kombiniert. Fügen Sie dem unfraktionierten Zelllysat einen RNase-Inhibitor hinzu, um eine Endkonzentration von 0,5 Einheiten pro Mikroliter zu erhalten.
Legen Sie dann 100 Mikroliter des Zelllysats auf Eis als Eingangskontrolle für das Western Blotting beiseite. Das Zelllysat wird in drei gleiche Aliquots mit einem Milliliter Zelllysat in jedes 1,5-Milliliter-Röhrchen aufgeteilt und drei Stunden lang bei vier Grad Celsius mit Rotation mit leeren Glühwürmchen-Luciferase-RNA-konjugierten bzw. AR 3-Prime UTR-konjugierten Kügelchen inkubiert. Legen Sie nach der Inkubation die Röhrchen für eine Minute auf den Magneten.
Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um den Überstand zu sammeln, isolieren Sie dann die RNA und beurteilen Sie die Unversehrtheit der RNA, wie im Begleitdokument beschrieben. Bewahren Sie die Kügelchen auf Eis auf. Waschen Sie die magnetischen Kügelchen sechsmal.
Jedes Mal werden die Bead-Pellets in einem Milliliter nuklearem Isolationspuffer resuspendiert, der 40 Einheiten RNase-Inhibitor und 0,25 Prozent Igepal enthält. Drehen Sie die Röhren zwei Minuten lang bei Raumtemperatur. Legen Sie die Röhrchen in einen Magnetständer, um die Magnetkügelchen und den Überstand zu trennen.
Nach einer Minute aspirieren und entsorgen Sie den Überstand, dann legen Sie die Kügelchen auf Eis. Um die RNA-Proteinkomplexe aus den Kügelchen für das Western-Blotting zu eluieren, resuspendieren Sie zunächst jedes Kügelchenkorn in 75 Mikrolitern Kernisolationspuffer. Fügen Sie dann 25 Mikroliter 4X Western Blot-Loading Puffer hinzu.
SDS enthaltend, um ein Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern zu erhalten. Zum Schluss kochen Sie die Kügelchen in dieser 100-Mikroliter-Lösung fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius. Führen Sie ein Western Blotting zur Überprüfung des RBP durch, wie im Begleitdokument beschrieben.
In diesem Experiment wurde ein Antigenrezeptor-RNA-Fragment als Köder verwendet, um sein Bindungsprotein HuR einzufangen. Sowohl ein Glühwürmchen-Luciferase-RNA-Köder, der nicht mit dem HuR-Protein verwandt ist, als auch ein Aliquot aus unkonjugierten leeren Streptavidin-Kügelchen dienten als Negativkontrollen. RNA-Protein-Wechselwirkungen können entweder im Zellkern oder im Zytoplasma auftreten, und dieses Pull-down-Protokoll kann entweder auf totale oder fraktionierte nukleare oder zytoplasmatische Zelllysate angewendet werden.
Die Analyse durch Western Blotting zeigte das HuR-Protein im unfraktionierten Zelllysat oder Input unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers. Die Antigenrezeptor-RNA-Elusionsfraktion lieferte ebenfalls ein positives Ergebnis, was auf das Vorhandensein des HuR-Proteins im Adipozytenlysat unter Verwendung der Antigenrezeptor-RNA-konjugierten Kügelchen für den RNA-Pulldown-Assay hinweist. Sowohl die Glühwürmchen-Luciferase-RNA-Elutionsfraktion als auch die Blindkugelprobe zeigten negative Ergebnisse, was darauf hindeutet, dass unspezifische Wechselwirkungen mit diesem Ansatz nicht nachweisbar waren.
Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Interaktion zwischen dem Antigen-Rezeptor-RNA-Fragment und dem HuR-Protein spezifisch war. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie RNA-bindende Proteine aus einem RNA-Transkript aus braunem Fettgewebe gewonnen werden können. Einmal gemeistert, kann dies dann in 24 Stunden erledigt werden, wenn es richtig ausgeführt wird.
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Überblick
Dieser Artikel präsentiert ein optimiertes RNA Pull-down-Protokoll zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen RNA-bindenden Proteinen (RBPs) und sowohl nicht-kodierenden als auch kodierenden RNAs. Die Methode wird am Beispiel eines Fragments des Androgenrezeptors (AR) zur Gewinnung seines RBP aus dem Lysat primärer brauner Adipozyten veranschaulicht.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Molekularbiologie
Hintergrund
- RNA-bindende Proteine spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung von RNA-Funktionen.
- Das Verständnis von RBP-Wechselwirkungen kann regulatorische Mechanismen in verschiedenen biologischen Prozessen erklären.
- Diese Studie konzentriert sich auf braunes Fettgewebe, das für die Stoffwechselregulation wichtig ist.
- Die AR 3-Prime UTR dient als Modell zur Untersuchung von RBP-Wechselwirkungen.
Zweck der Studie
- RNA-bindende Proteine, die mit spezifischen RNA-Transkripten assoziiert sind, zu gewinnen.
- Regulatorische Mechanismen von Longlife-Codierungs-RNA und assoziierten RNA-Proteinen zu untersuchen.
- Eine unkomplizierte Methode zur Untersuchung von RBP-Wechselwirkungen bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Amplifikation von T7 AR Oligo und teilweiser Sequenz der Feuerfliegen-Luciferase-DNA.
- Verwendung des psiCHECK-2 Plasmids für die Demonstration von RNA-Fragmenten.
- Detaillierte Parameter und Primer sind in dem begleitenden Dokument angegeben.
- Anwendung von RNA Pull-down-Techniken zur Isolierung von RBPs.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Gewinnung von RBPs aus Lysaten brauner Adipozyten.
- Demonstration der Effektivität der Methode unter Verwendung der AR 3-Prime UTR.
- Einblicke in die Wechselwirkungen zwischen RBPs und RNA-Transkripten.
- Potenzielle Auswirkungen auf das Verständnis der Stoffwechselregulation.
Schlussfolgerungen
- Das optimierte RNA Pull-down-Protokoll ist effektiv für die Untersuchung von RBP-Wechselwirkungen.
- Diese Methode kann weitere Forschung zu RNA-Regulierungsmechanismen erleichtern.
- Die Ergebnisse können zum Verständnis von Stoffwechselprozessen im braunen Fettgewebe beitragen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
RNA-binding protein (RBP) interactions represent a critical regulatory layer in adipocyte biology, impacting gene expression and metabolic function. The optimized in vitro RNA pull-down protocol enables precise identification of RBP partners in lipid-rich adipocyte systems, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. This capability enhances predictive confidence for portfolio decisions involving RNA-centric targets and pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of RBP–RNA interactions to clarify regulatory mechanisms in adipocyte models.
- Supports functional target validation by confirming specific protein–RNA binding events.
- Facilitates mechanistic de-risking for RNA and RBP targets in metabolic research.
Screening & Assay Development
- Prepares validated adipocyte lysates for downstream screening of RBP modulators.
- Standardizes pull-down and detection workflows for reproducible quantitative outputs.
- Enables reliable assessment of compound effects on RBP–RNA interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant adipocyte systems for translational biomarker exploration.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of RBP targets.
- Supports risk-adjusted advancement of RNA-targeted programs in metabolic disease portfolios.
Pipeline & Workflow Integration
This RNA pull-down protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical target validation in adipocyte models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of RBP–RNA regulatory mechanisms in adipose tissue.
- Screening: Provides assay-ready lysates and standardized workflows for compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative western blot outputs for comparative analysis of binding specificity.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to disease-relevant adipocyte biology.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable protocol adaptable to diverse RNA and RBP targets in metabolic research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in RBP target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for RNA–protein interaction studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying target engagement early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of RNA and RBP targets in metabolic disease pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling, adipocyte culture, and western blot analysis.
- Needs access to magnetic bead-based pull-down systems and quantitative detection infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility across experiments.
- Adaptable to both coding and noncoding RNA targets in various adipocyte models.
- High lipid content in adipocytes necessitates optimized lysate preparation and purification steps.
