Name: Nachweis von RNA-bindenden Proteinen durch In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Kultur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Lernen Sie ein optimiertes RNA Pull-down-Protokoll zur Detektion von RNA-bindenden Proteinen in braunen Adipozyten. Diese Methode ermöglicht die Analyse spezifischer RNA-Protein-Interaktionen in vitro.

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Diese Arbeit wurde von Singapur NRF Gemeinschaft (NRF-2011NRF-NRFF001-025) sowie CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014) finanziert.

HINWEIS: Die RNA von Interesse im Rahmen dieser Studie ist ein Fragment von AR 3&#39;UTR. 1. Herstellung von Biotin-markierter RNA <ol><li> Um die RNA zu erhalten, T7-AR-Oligos durch PCR, gefolgt von in vitro Transkription unter Verwendung eines kommerziellen Kits und nach den Anweisungen des Herstellers 11 amplifizieren. HINWEIS: T7-AR-F und T7-AR-R: Primer für die PCR sind in Tabelle 4 aufgeführt. </li><li> Für nicht-spezifische Bindungskontrolle, amplifizieren eine Teilsequenz der Glühwürmchen - Luciferase (FL) DNA durch PCR aus psiCHECK-2 - Plasmid, gefolgt von in vitro Transkription. HINWEIS: Primer für die PCR sind in Tabelle 4: hluc (+) - T7-probe-F und hluc (+) - Sonde-R Tabelle 4 Sequenzen von Template und Primer für die PCR - Amplifikation... </li><li> Für eine 50 &amp; mgr; l PCR-Reaktion, mischen 50 ng DNA (Oligo oder Plasmid), 4 ul dNTPs (2,5 mM jedes einzelnen dNTP), 5 ul 10x Reaktionspuffer, 1 ul 2,5 U / &amp; #181; l DNA-Polymerase, 2 &amp; mgr; l 10 &amp; mgr; M Vorwärtsprimer, 2 ul 10 uM Reverse-Primer und Nuklease-freies Wasser. <ol><li> Führen Sie die PCR-Amplifikation in einem Thermocycler das folgende Programm. Schritt 1: ein Zyklus von 95 ° C für 2 min; Schritt 2: 35 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 55 ° C für 30 sec und 72 ° C für 30 sec (AR) oder 60 s (FL); Schritt 3: ein Zyklus von 72 ° C für 10 min. </li></ol></li><li> Synthetisieren biotinylierten RNAs eine in vitro Transcription Kit folgenden Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von 11. In diesem Experiment verwenden PCR-Produkte als Matrizen für die RNA-Synthese. Für eine 20 &amp; mgr; l in vitro Transkriptionsreaktion, Mischungs 200 ng PCR amplifizierte DNA, 2 &amp; mgr; l jedes einzelnen NTP, 1 ul 10 mM Biotin-CTP, 2 ul 10x Reaktionspuffer und 2 &amp; mgr; l T7 - RNA - Polymerase. Inkubieren der Mischung bei 37 ° C für 4 Stunden. </li><li> Folgende in vitro Transkription, treat Reaktionsmischung mit 1 ul 2 U / &amp; mgr; l DNase bei 37 &amp; #176; C für 15 min Templat-DNA abzubauen. Schließlich wird die biotinylierte RNA auf ein Gesamtvolumen von 60 ul zur anschließenden Reinigung verdünnen. </li><li> Reinige biotinylierten RNAs Salze und nicht eingebauten Nukleotide zu entfernen , indem Reinigungssäulen verwendet folgenden Anweisungen des Herstellers 12. Messen Sie RNA-Konzentration und bei -80 ° C für die nachfolgende Pull-down-Assays. </li><li> Um eine ordnungsgemäße Sekundärstruktur für die RNA von Interesse in der RNA-Protein - Wechselwirkung, Wärme 50 ul biotinyliertes RNA (50 pM) bei 90 ° C für 2 min, Chill auf Eis für 2 min, dann liefern mit 50 ul 2x RNA - Struktur - Puffer (Tabelle 3) und ermöglichen die RNA bei RT für 30 min Falten 13,14. </li></ol> 2. Herstellung von RNA-konjugierten Beads HINWEIS: Verwenden Sie einen Magnetfuß zur Trennung der magnetischen Kügelchen und Überstand. <ol><li> Resuspendieren der Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen in der Originalflasche durch kurze Vortexing folgenden Anweisungen des Herstellers. Übertragen Sie 150 ul resuspendiert Kügelchen in ein 1,5-ml-Röhrchen. Das Röhrchen wird auf Magneten für 1 min. Überstand verwerfen. Halten Wulst Pellet. HINWEIS: In der RNA Pull-down-Assays, wenn erneut suspendiert Perlen aus Originalfläschchen Aliquotierung, verwenden 50 ul Perlen für einen Test durch Western-Blot gefolgt, und 200 &amp; mgr; l Perlen für einen Test von MS gefolgt. </li><li> Waschen Perlen einmal durch Resuspendieren Wulst Pellet mit 1 ml der empfohlenen 1x W &amp; B des Herstellers (Bindungs- und Wasch) Puffer (Tabelle 3), gefolgt von den Röhrchen 5 Minuten bei Raumtemperatur in einem Rotator dreht. Überstand verwerfen. Halten Wulst Pellet. </li><li> Zu inaktivieren RNase on beads, wasche zweimal Perlen, jeweils durch Resuspendieren bead Pellet mit 400 ul Puffer A Puffer A ist eine alkalische Lösung , die 0,1 M NaOH und 0,05 M NaCl (Tabelle 3). Drehen Sie das Rohr für 2 Minuten bei Raumtemperatur in einem Rotator. Überstand verwerfen. Halten Wulst Pellet. </li> &lt;li&gt; Zum Entfernen NaOH aus Perlen, zweimal waschen Perlen, jedes Mal durch Resuspendieren Wulst Pellet mit 400 ul Puffer B (Tabelle 3), gefolgt von der Röhre 2 min bei Raumtemperatur in einem Rotator dreht. Überstand verwerfen. Halten Wulst Pellet. </li><li> Resuspendieren Wulst Pellet mit 300 ul 2x W &amp; B-Puffer, geteilt Perlen gleichmäßig und Transfer in drei 1,5-ml-Röhrchen (100 &amp; mgr; l Kügelchen pro Röhrchen). Versorgen Sie die Kügelchen enthaltende Röhrchen mit 100 &amp; mgr; l RNase-freiem Wasser, biotinyliert 100 ul FL RNA und 100 ul biotinyliertes AR 3&#39;UTR RNA sind. </li><li> Inkubieren jedes Wulstes Mischung für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Rotation. Die Röhrchen auf Magnet für 1 min. Entsorgen Sie alle Überstand. Halten Sie Perle Pellets. </li><li> Zweimal waschen Perlen, jeweils durch jedes Wulstes Pellet mit 400 ul 1x W &amp; B-Puffer erneut suspendiert, gefolgt von Röhrchen für 5 min bei Raumtemperatur in einem Rotator dreht. </li><li> Die Röhrchen auf Magnet für 1 min. Entsorgen Sie alle Überstand. Resuspendieren jede Wulst pellet mit 50 ul Kernisolationspuffer (Tabelle 3). </li></ol> 3. Preadipozyten Isolierung und Adipogenese Induction <ol><li> Wie in 5 in früheren Veröffentlichungen beschrieben, sezieren Preadipozyten aus dem interskapulären braunen Fettpolster (C57BL6 Wildtyp - Mäusen, 3 Wochen alt). </li><li> Wachsen und in vitro Differenzierung der Präadipozyten 5. Zellen sind bereit für nachgeschaltete Anwendung 4-5 Tage nach Beginn der Differenzierung. </li></ol> 4. Herstellung von Zellysat von Primary Adipozyten HINWEIS: Stellen Sie sicher, alle Verfahren von Zelllysat Zubereitung auf Eis, und alle Puffer auf Eis gekühlt. Pre-Chill-Dounce-Glas Homogenisator auf Eis. <ol><li> Wachsen und unterscheiden Preadipozyten in 15 cm - Schalen 5 (siehe Abschnitt 3.2). Jedes Gericht bietet ausreichend Zellen für eine RNA-Pull-Down-Assay. Am Tag 4 oder 5. Tag der Differenzierung, der Verwerfungszellkulturmedium, und waschen ceLLS einmal mit 1x PBS. </li><li> Zur Ernte Zellen, fügen Sie 10-15 ml 1x PBS zu den Zellen, kratzen Zellen in einem 50-ml-Röhrchen und Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 200 g für 5 min bei RT zu sammeln. Überstand verwerfen unter Verwendung von 1 ml Pipette. </li><li> Resuspendieren Zellpellet in 2 ml hypotonischen Puffer (Tabelle 3), und für 15 min Zellen auf Eis inkubieren. Transfer-Zellen zu einem 15 ml-Dounce-Glas-Homogenisator und Scherzellen mechanisch auf Eis mit 20 Schlägen. </li><li> Pellet Zellkerne durch Zentrifugation bei 3.300 xg für 15 min bei 4 ° C. Halten Sie Kerne Pellets auf Eis für die weitere Verwendung (siehe Abschnitt 4.6). Überstand in 1,5 ml-Röhrchen, fügen 3M KCl gegen den Überstand zu einer Endkonzentration von 150 mM zu erhalten, und Schleudern bei 20.000 xg für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Nach der Zentrifugation vorsichtig entfernen lipidlayeron oben unter Verwendung von 1 ml Pipette und sammeln Überstand als zytoplasmatische Zellysat. </li><li> Resuspendieren Kerne Pellet in 1 ml Kernisolationspuffer (siehe Abschnitt 4.4). Transfer Kerne in ein 15 ml-Dounce-Glas-Homogenisator unter Verwendung von 1 ml-Pipette und Scherkerne mechanisch auf Eis mit 100 Hüben. Kerntrümmer Pellet durch Zentrifugation bei 20.000 xg für 15 min bei 4 ° C und sammle Überstand als Kern zellulären Lysats. </li><li> Entweder verbinden die Kern- und Cytoplasma-Zellysaten oder jede Fraktion getrennt zu verwenden, für die nachfolgende Pull-Down-Anwendung. In diesem Beispiel Experiment wurden diese zwei Fraktionen von Zell-Lysat in einem Volumenverhältnis von 1: 1. </li><li> Hinzufügen RNase Inhibitor zu diesem Lysat unfraktioniertem Zelle zu einer Endkonzentration von 0,5 U / &amp; mgr; l zu erhalten. Beiseite 100 ul Zelllysat als Eingangskontrolle für Western - Blot - 15. </li></ol> 5. Bindung und Elution von RBP <ol><li> Split Zelllysat in drei gleiche Aliquots (1 ml Zelllysat in einem 1,5-ml-Röhrchen), und Inkubation mit leeren, FL RNA-konjugierten und AR 3&#39;UTR RNA-konjugierte Kügelchen (siehe Abschnitt 2.8), jeweils für 3 Stunden bei 4 ° Cmit Rotation. </li><li> Die Röhrchen auf Magnet für 1 min. Sammeln Überstand einer 1 ml Pipette, gefolgt von RNA-Isolierung aus dem Überstand RNA Ganzheitlichkeit zu bestätigen. Isolieren RNA durch eine Säure Guanidiniumthiocyanat-Phenol - Lösung nach den Anweisungen des Herstellers verwendet (Tabelle 2). Bewerten Sie die RNA Intakt durch die Analyse von 28S und 18S-Untereinheiten der ribosomalen RNA. Halten Wulst Pellets auf Eis. </li><li> Waschen Sie die magnetischen Kügelchen sechs Mal, jedes Mal durch Resuspendieren jedes Wulstes Pellet mit 1 ml Kernisolierungspuffer, enthaltend 40 U RNase-Inhibitor und 0,25% IGEPAL, gefolgt von Röhrchen für 2 min bei Raumtemperatur in einem Rotator dreht. Verwenden Sie einen Magnetfuß zur Trennung der magnetischen Kügelchen und Überstand. Entsorgen Sie alle Überstand. Halten Wulst Pellets auf Eis. </li><li> Verwenden Sie folgende Schritte, um RNA-Protein-Komplexe, die aus Perlen für Western-Blot-eluieren. Zunächst resuspendieren jeder Wulst Pellet in 75 ul Kernisolationspuffer; Dann fügen Sie 25 ul 4x Western-Blot-Laden buffer (enthaltend SDS) mit einem Gesamtvolumen von 100 ul zu erhalten. Schließlich sieden Perlen in 100 ul dieser Lösung bei 95 ° C für 5 min. HINWEIS: Verwenden Sie folgende Schritte RNA-Protein-Komplexe, die aus Perlen für MS zu eluieren. Schritt 1: resuspendieren jedes Wulstes Pellet in 100 &amp; mgr; l Elutionspuffer (Tabelle 3); Schritt 2: bead Proben für 2-3 h bei Raumtemperatur unter Rotation inkubieren; Schritt 3: Zentrifuge und sammeln proteinhaltige Überstand; Schritt 4: Proteinlösungen 20-30 ul vor der Vorlage für MS konzentrieren. </li><li> Zentrifuge jeweils 100 &amp; mgr; l Kügelchenprobe bei 12.000 xg für 30 sec bei 4 ° C und sammle den Überstand. Aliquot 15 ul Überstand für Western-Blot-Analyse (siehe Abschnitt 6.1 und 6.2). Sonde die resultierende Membran mit dem verdünnten HuR monoklonalen Maus-Antikörper (1: 1000 Verdünnung), über Nacht. </li></ol> 6. Western Blotting für die Überprüfung der RBP <ol><li> Separate RBPs durch SDS-PAGE unter Verwendung von Standardtechniken. </li><li> Führen wirVerwendung von Standardtechniken Heck-Blotting durch Sondieren für die RBPs mit der RNA von Interesse verbunden. Hinweis: In dieser Demo-Experiment, monoklonale HuR Maus-Antikörper für die Immunnachweis von HuR Protein verwendet wurde. </li><li> Inkubieren der resultierenden Membran mit dem verdünnten HuR Antikörper (1: 1000 Verdünnung) in 5% w / v fettfreie Trockenmilch, 1x TBS, 0,1% Tween - 20 bei 4 ° C unter leichtem Schütteln über Nacht. Waschen Sie die Membran dreimal mit 1x TBST. Inkubieren Membran mit dem sekundären Antikörper bei Raumtemperatur für 1 Stunde (anti-Maus-IgG-HRP der Ziege). Waschen Sie die Membran. Entwickeln und Aufzeichnungssignal. </li></ol>

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</ol>

Keine Interessenkonflikte erklärt.

lncRNAs und RBPs haben eine lebenswichtige Rolle in Gesundheit und Krankheit, aber die molekularen Mechanismen dieser Moleküle schlecht verstanden werden. Identifizierung von Proteinen, die mit lncRNA Molekülen interagieren ist ein wichtiger Schritt in Richtung auf die Regulationsmechanismen aufzuklären. Anreicherung von RBPs durch die RNA-Pull-Down-Assay-System wird in-Lösung auf Basis von Erfassung von komplexen interagieren, so dass Proteine, die aus einem Zelllysat selektiv extrahiert werden können biotinylierte RNA...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/54207/detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte">Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture</a>.
The author list has been updated from:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical &#38; Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RBPs sind Proteine, die bei der Bildung von RNA-Protein-Komplexe in Zellen zur Doppel- oder Einzelstrang-RNA binden und zu beteiligen. RBPs kann eine Vielzahl von RNA-Spezies binden, einschließlich mRNA und lange nichtkodierende RNAs (lncRNAs) und deren Einfluss auf posttranskriptionales Ebenen ausüben. Beide RBPs und lncRNAs sind , sich als neue Aufsichtsbehörden bei adipösen Entwicklung und Funktion 1,2,3. Um zu verstehen, den Mechanismus der RBP- und lncRNA vermittelte Regulation der zellulären Wege, ist es oft notwendig ist, die Wechselwirkung zwischen einem spezifischen RNA-Moleküls und eines oder mehrere RBPs zu erfassen, und manchmal das gesamte Spektrum von Proteinpartner einer RNA zu identifizieren, Transkript. Jedoch kann der Versuch aufgrund des hohen Gehaltes an Lipiden in Adipozyten schwierig sein. Die RNA - Pull-Down - Protokoll hier beschrieben werden eingesetzt 4,5 die Proteinpartner eines spezifischen RNA aus den Adipozyten Lysaten von Primärkulturen zu erhalten. Rationale für dieses Protocol wird wie folgt zusammengefasst. Ein RNA - Köder in vitro aus einem DNA - Template transkribiert ist, Biotin-markierte und konjugiert an Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen 4. Die RNA Köder wird mit Zelllysaten inkubiert für die Bildung von RNA-Protein-Komplexen zu ermöglichen, die anschließend gezogen werden, auf einem Magnettreten. Mehr die RNA - Pull-Down - Protokoll unten beschrieben speziell, verwenden Sie ein RNA - Fragment von AR 3&#39;UTR als Köder HuR Protein, ein universell ausgedrückt RBP gebunden 3&#39;UTR von mRNAs 6,7, von theadipocytelysate der Primärkultur zu erhalten. Um die Bindungsspezifität dieses Assays testen, wurde eine nicht-relevanten RNAas auch blank Streptavidin-Kügelchen als Kontrolle eingeschlossen. Dieses Protokoll ist kompatibel mit Western - Blot oder Massenspektrometrie (MS) die Erfassung eines bestimmten RBP zu bestätigen oder das gesamte Repertoire der erfassten RBPs bzw. 8 zu identifizieren. Verschiedene Techniken sind verfügbar RNA-Protein-Wechselwirkung zu untersuchens. Offenbaren RNAs gebunden durch eine gegebene RBP, RIP (RNA Immunpräzipitation) und CLIP (UV-Vernetzung und Immunpräzipitation) angewendet werden kann. Im Gegensatz dazu kann zu identifizieren angewendet werden Proteinpartner eines bestimmten RNA, RNA Pull-Down-Chirp (Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung), CHART (Capture-Hybridisierungsanalyse von RNA-Targets) und RAP (RNA-Antisense-Reinigung). Im Vergleich zu den späteren, RNA-Pull-down-Technik dauert weniger Aufwand einzurichten. Es kann zu erfassen Proteine ​​in vitro verwendet werden , und in vivo. Die in - vivo - Ansatz von RNA - Pull-down, die technisch anspruchsvoller als seine in - vitro - Gegenstück ist, RNA-Protein - Interaktionen bewahrt durch in Zellen Vernetzung erfasst Aptamer-markierte RNAs von Interesse von Zellen und erkennt anschließend gebunden RBPs. RNA - Pull-down kann zu bereichern niedrig reichlich RBPs verwendet werden, und die RNA-Protein - Komplexe zu isolieren und zu identifizieren , die bei der Kontrolle der zellulären Regulation 9,10 diversen funktionalen Rollen haben </sup&gt;.

<table><tbody><tr><td>Wichtige Materialien, die in dieser Studie verwendet wurden.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript kit</td><td>&nbsp; Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin-14-CTP&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucAway Spin-Säulen&nbsp;</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HuR (3A2) monoklonaler Maus-Antikörper (sc-5261)</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG-HRP (sc-2005) &nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypure Wasser in molekularbiologischer Qualität (nukleasefrei)&nbsp;</td><td>HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphat Puffer Kochsalzlösung (1&fach; PBS)</td><td>&nbsp; HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase-Hemmer&nbsp;</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteasehemmer</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pfu Turbo DNA-Polymerase&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIsure</td><td>&nbsp; Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>Wichtige Geräte, die in dieser Studie verwendet wurden.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R Zentrifuge&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R Zentrifuge&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad T100 Thermocycler&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BOECO Rotator Multi Bio RS-24&nbsp;</td><td>BOECO, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein-Gel-Elektrophorese- und Blotting-Geräte&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Lebenstechnologien</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nachweis von rna-bindenden proteinen durch<em&gt; in vitro</em&gt; rna pull-down in adipocyte kultur

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-bindende Proteine ​​(RBPs) entstehen als regulatorischer Ebene in der Entwicklung und Funktion von Fettgewebe. RBPs spielen eine wichtige Rolle bei der Genregulation bei posttranskritionelle Ebenen durch die Stabilität und Translationseffizienz von Ziel-mRNAs beeinflussen. RNA pull-down-Technik weit verbreitet RNA-Protein-Wechselwirkung zu untersuchen ist, die notwendig ist, den Mechanismus zugrunde liegende RBPs &#39;sowie lange nicht-kodierenden RNAs&#39; (lncRNAs) Funktion aufzuklären. Jedoch stellt die hohe Lipid Fülle in Adipozyten eine technische Herausforderung, dieses Experiment in der Durchführung. Hier ist eine detaillierte RNA Pull-Down-Protokoll wird für die primäre Adipozyten Kultur optimiert. Ein RNA-Fragment von Androgen-Rezeptors (AR) 3 &#39;untranslatierten Region (3&#39;-UTR), die eine Adenylat-uridylat reichen elementwas verwendet als ein Beispiel enthält, zu zeigen, wie ihre RBP Partner HuR Protein von Adipozyten lystate abzurufen. Das hier beschriebene Verfahren kann um die Wechselwirkungen zu detektieren angewendet werden zwischenRBPs und nicht-kodierenden RNAs sowie zwischen RBPs und kodierenden RNAs.

In dieser Demo-Experiment wurde ein AR-RNA-Fragment als Köder verwendet, um seine bindende Protein HuR zu erfassen. Sowohl ein FL RNA Köder, die HuR Protein und ein Aliquot von unkonjugiertem blank Streptavidinbeads dienten als negative Kontrollen nicht relevant ist. RNA-Protein-Wechselwirkungen können entweder im Kern oder Cytoplasma auftreten, und das Pull-Down-Protokoll kann entweder insgesamt oder fraktionierte (Kern- oder cytoplasmatische) Zelllysate angewendet werden. Analyse von P...

Ein RNA-Pull-down-Protokoll wird für den Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteine ​​(RBPs) und nicht-codierende sowie kodierenden RNAs hier optimiert. Ein RNA-Fragment von Androgen-Rezeptor (AR) wurde als Beispiel verwendet, zu zeigen, wie ihre RBP aus lystate primärer braunen Fettzellen zu erhalten.

Nachweis von RNA-bindenden Proteinen durch<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down in Adipocyte Kultur

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, RNA-bindende Proteine eines RNA-Transkripts aus braunem Fettgewebe zu isolieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in diesem Forschungsbereich zu beantworten, beispielsweise welche regulatorischen Mechanismen bei langlebigen kodierenden RNAs und assoziierten RNA-Proteinen eine Rolle spielen. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes liegt darin, dass er einfach durchzuführen ist.Die für diese Methode verwendete RNA ist ein Fragment der Antigenrezeptor-3-Prime-nichtübersetzten Region, im Folgenden als AR 3-Prime UTR bezeichnet. Beginnen Sie mit der Amplifikation des T7-AR-Oligos und der Teili-Sequenz der Firefly-Luciferase-DNA aus dem psiCHECK-2-Plasmid. Die verwendeten Primer und Parameter sind im beigefügten Dokument aufgeführt.Nach der Amplifikation verwenden Sie die PCR-Produkte als Vorlagen, um mithilfe eines In-vitro-Transkriptionskits biotinylierte RNAs gemäß den Herstelleranweisungen zu synthetisieren. Inkubieren Sie danach das Gemisch vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie nach der In-vitro-Transkription ein Mikroliter DNase zur Reaktion hinzu und inkubieren Sie diese 15 Minuten bei 37 Grad Celsius, um die V

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine Schritt für Schritt-Protokoll zur Isolierung und Identifizierung von RNA assoziiert Komplexe durch RIP-Chip.

Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von mRNAs, microRNAs und Protein-Komponenten des Ribonucleoprotein Komplexe aus Zellextrakten mit RIP-Chip

Dieses Video zeigt einen in vitro RNA-Pulldown-Assay zur Identifizierung von RNA-bindenden Proteinen (RBPs), die mit den Adenylat-Uridylat-Rich Element (ARE)-Sequenzen in mRNA interagieren. Die Ziel-RBPs aus einem Zelllysat werden mit einer RNA-Sonde gemischt, um RNA-Protein-Komplexe zu bilden. Die Komplexe werden mittels Affinitätsreinigung isoliert, wobei die Affinität der Desthiobiotin-Markierung der RNA-Sonde zu einem Streptavidin-markierten magnetischen Kügelchen genutzt wird.

RNA-Protein-Pull-Down-Assay zur Isolierung von RNA-bindenden Proteinen mittels Affinitätsextraktion

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur RNA / Protein-Interaktionen zu untersuchen. Elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) auf der differentielle Migration RNA / Protein-Komplexe und freie RNA während nativer Gelelektrophorese. Durch Verwendung eines radioaktiv markierten RNA-Sonde kann RNA / Protein-Komplexe durch Autoradiographie visualisiert werden.

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) für das Studium von RNA-Protein-Wechselwirkungen: Die IRE / IRP Beispiel

RNA-Protein-Wechselwirkungen sind das Herzstück vieler zellulärer Prozesse. Hier beschreiben wir eine in vivo Methode, um spezifische RNA zu isolieren und neue Proteine zu identifizieren, die mit ihr assoziiert sind. Dies könnte ein neues Licht darauf werfen, wie RNAs in der Zelle reguliert werden.

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

Wir beschreiben ein Protokoll zur RNA-bindende Proteine und RNA-bindende Regionen in lebenden Zellen mit UV-vermittelten Photocrosslinking und Massenspektrometrie.

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Hier präsentieren wir ein Interaktom-Capture-Protokoll, das auf Arabidopsis thaliana Blatt-Mesophyll-Protoplasten angewendet wird. Diese Methode beruht kritisch auf in vivo UV-Vernetzung und ermöglicht die Isolierung und Identifizierung von p-mRNA-bindenden Proteinen aus einer physiologischen Umgebung.

MRNA Interactome Capture aus Pflanzenprotoplasten

Desthiobiotin Kennzeichnung von einer synthetischen 25-Nukleotid RNA Oligo, enthält ein Motiv Adenin-HTML-Elements (sind), kann spezifische Bindung der cytosolischen sind-bindendes Protein.

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinität vermittelt Reinigung von RNA-wechselwirkenden Proteinen in Mesotheliomzellen

Dieser Bericht beschreibt eine schnelle und zuverlässige Methode zur Validierung von mRNA Ziele der zellulären MiRNAs. Die Methode verwendet, die synthetische biotinylierte gesperrt Nukleinsäure LNA-basierte MiRNA imitiert erfassen gezielt mRNA. Anschließend Streptavidin beschichteten magnetische Beads werden eingesetzt, um Pulldown das Ziel mRNA zur Quantifizierung von qPCR-Polymerase-Kettenreaktion.

Biotin-basierte Pulldown Assay, Validate mRNA Ziele der zellulären miRNAs

Bei dieser Methode quantifizieren wir die Bindungsaffinität von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) zu kognazierenden und nicht-kogatierten Bindungsstellen mit einem einfachen, live, Reporter-Assay in Bakterienzellen. Der Test basiert auf der Unterdrückung eines Reportergens.

Ein Assay zur Quantifizierung der Protein-RNA-Bindung in Bakterien

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um Oligonukleotide wie small-interfering RNA (siRNA), micro-RNA mimics (miRs) oder anti-micro-RNA (anti-miR) in reife Adipozyten zu liefern, um die Protein- und micro-RNA-Expression zu modulieren.

Ein Adipozyten-Zellkulturmodell zur Untersuchung des Einflusses der Protein- und Mikro-RNA-Modulation auf die Adipozytenfunktion

In dieser Arbeit stellen wir eine optimierte in vitro Methode vor, um Proteininteraktoren spezifischer RNA-Sequenzen aufzudecken, zu quantifizieren und zu validieren, wobei Gesamtproteinextrakt aus menschlichen Zellen, Streptavidin-Kügelchen, die mit biotinylierter RNA beschichtet sind, und Massenspektrometrie-Analysen verwendet werden.

Eine optimierte quantitative Pull-Down-Analyse von RNA-bindenden Proteinen unter Verwendung kurzer biotinylierter RNA

Lernen Sie ein optimiertes RNA Pull-down-Protokoll zur Detektion von RNA-bindenden Proteinen in braunen Adipozyten. Diese Methode ermöglicht die Analyse spezifischer RNA-Protein-Interaktionen in vitro.

Nachweis von RNA-bindenden Proteinen durch

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