Räumliche Messungen der Perfusion, interstitielle Fluiddruck und Liposome Anreicherung in soliden Tumoren

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die intratumorale Anreicherung von Nanotherapeutika mit den Eigenschaften des Tumormikromilieus in Beziehung zu setzen, einschließlich der Tumormikrozirkulation und des erhöhten interstitiellen Flüssigkeitsdrucks, oder IFP. Diese Methode ermöglicht es uns, wichtige Fragen zu Nanomedikamenten zu beantworten. Fragen wie: Was treibt die heterogene Aufnahme von Nanopartikeln innerhalb eines Tumors an?

Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine ko-lokalisierte räumliche Abbildung der Eigenschaften des Tumormikromilieus und der intratumoralen Verteilung von Nanopartikeln ermöglicht. Nachdem die angemessene Anästhesietiefe durch Topen geprüft wurde, Augensalbe auf die Augen der Maus auftragen und die Gliedmaßen des Tieres in Bauchlage mit Klebeband auf einem dünnen Kunststoffbrett fixieren. Anschließend einen individuell angefertigten Katheter mit 27 Gauge, der mit einem 20 cm langen Stück PE10-Schlauch verbunden ist, in die seitliche Schwanzvene einführen und den Schlauch mit mehreren Streifen Klebeband fixieren.

Füllen Sie nun eine Ein-Milliliter-Spritze mit mindestens 200 Mikrolitern Computertomographie- oder CT-Liposomen und eine weitere Ein-Milliliter-Spritze mit mindestens 150 Mikrolitern eines 9:1-Volumenverhältnisses von freiem Iohexol, gemischt mit Kochsalzlösung. Platzieren Sie die CT-Liposomen-Spritze in einer Spritzenpumpe und verbinden Sie den Katheter mit der Spritze, wobei eine Pumpgeschwindigkeit von 600 Mikrolitern pro Minute, entsprechend 10 Mikrolitern pro Sekunde, eingestellt wird. Danach platzieren Sie die Maus auf der Mikro-CT-Scanneraufnahme und verwenden Sie das Laser-Positioniersystem, um den Tumor so auszurichten, dass er bei jeder Aufnahme annähernd dieselbe Orientierung aufweist.

Wählen Sie in der CT-Scanner-Konsolensoftware für jedes gewünschte Bildgebungsprotokoll „hell dunkel“ aus dem Dropdown-Menü aus, und klicken Sie auf die Scan-Taste, um die Kalibrierung zu starten und das System zu initialisieren. Um vor der Injektion eines Kontrastmittels eine volumetrische anatomische Mikro-CT-Aufnahme des Tumors zu erhalten, überprüfen Sie zunächst die Anzeige der CT-Scanner-Konsolensoftware, um sicherzustellen, dass die Sicherheitsverriegelungen des CT-Scanners freigegeben wurden. Wählen Sie anschließend den Scan aus, der eine Röntgenenergie von 80 Kilovolt, einen Röhrenstrom von 70 Milliampere verwendet und 1.000 Bildprojektionen aufnimmt.

Danach den Scan starten. Sobald der Scan abgeschlossen ist, die Pumpe so einstellen, dass etwa 150 Mikroliter der Liposomenlösung injiziert werden, und die Starttaste drücken, um den Bolus der CT-Liposomen mit einer Konzentration von 55 Milligramm Jod pro Milliliter Lösung zu verabreichen. Den Katheter manuell mit 50 Mikrolitern Kochsalzlösung spülen, um sicherzustellen, dass die gesamte Menge des Liposomenwirkstoffs injiziert wurde und der Katheter gereinigt ist.

Nach 10 Minuten führen Sie eine zweite anatomische Aufnahme des Tumors durch, wie gerade gezeigt. Um eine DCE-CT durchzuführen, setzen Sie eine Spritze mit freier Iohexol-Lösung in die Spritzenpumpe ein und stellen Sie die Pumpe so ein, dass 100 Mikroliter Iohexol mit derselben Injektionsgeschwindigkeit injiziert werden. Diese Injektionsvolumina liegen über dem Standard von 200 Mikrolitern, jedoch werden die Tiere während der Erholungsphase überwacht, und es wurden keine unerwünschten Ereignisse beobachtet.

Danach am CT-Scannerkonsol einen fünfminütigen dynamischen Scan mit einer Röntgenenergie von 80 Kilovolt und einer Röhrenstromstärke von 90 Milliampere auswählen, wie gerade gezeigt, der 416 Bildprojektionen alle eine Sekunde während der ersten 30 Sekunden und anschließend 416 Bildprojektionen alle 10 Sekunden aufnimmt. Fünf Sekunden DCE-CT-Daten erfassen, dann die Injektionspumpe starten. Am Ende des Scans einen dritten volumetrischen anatomischen Mikro-CT-Scan durchführen.

48–70 Stunden später anatomische CT-Bilder der Liposomen aufnehmen, wobei dieselben volumetrischen Einstellungen wie zuvor gezeigt verwendet werden. Um den IFP zu messen, das Tier auf der CT-IFP-Roboterplattform fixieren, sodass der Tumor immobilisiert und für das CT-IFP-Robotersystem zugänglich ist. Einen anatomischen Mikro-CT-Scan wie zuvor gezeigt durchführen.

Laden Sie dann die Daten vor der Nadeleinführung in die CT-IFP-Roboter-Ausrichtungssoftware und passen Sie Fenster und Pegel an, um den Tumor sichtbar zu machen. Klicken Sie auf den Rand des Tumors in einem beliebigen Bild und anschließend auf eine zweite Randposition auf der benachbarten Seite des Tumors. Die Software berechnet eine Reihe von Positionen entlang einer geraden Linie zwischen den beiden Punkten.

Danach die X-, Y- und Z-Koordinaten für eine Reihe von fünf bis acht gleichmäßig verteilten Positionen aus der Liste auswählen. Anschließend die Nadel des IFP-Systems mit einer Salin-Heparin-Lösung spülen und die ersten vorbestimmten Nadelpositionen in die X-, Y-, Z-Koordinatenfenster der CT-IFP-Roboter-Steuerungssoftware eingeben. Den „Go“-Knopf drücken, um den Roboter an die gewünschte Position zu bewegen.

Danach für jede Nadelposition nacheinander den „Nadel einführen“-Knopf anklicken, um die Nadel in das Gewebe einzuführen. Das PE20-Schlauchsystem zusammendrücken und wieder loslassen, um eine gute Flüssigkeitsverbindung zwischen der IFP-Nadel und dem Gewebe zu bestätigen, und beobachten, dass die IFP-Messung ansteigt und nach dem Zusammendrücken wieder auf den Ausgangswert in der IFP-Aufnahmesoftware zurückkehrt. Abschließend einen anatomischen CT-Scan mit eingeführter Nadel aufnehmen und am Ende des Scans den „Nadel zurückziehen“-Knopf anklicken, um die Nadel aus dem Gewebe zu entfernen.

Die Auswahl eines interessierenden Bereichs innerhalb des Tumors ergibt eine Zeit/Intensitäts-Kurve, die zur Ableitung quantitativer Schätzungen ausgewählter hämodynamischer Parameter im Tumor verwendet werden kann. Durch die Segmentierung des Tumorvolumens in gleich große, mehrere Regionen von Interesse lässt sich die räumliche Verteilung dieser Parameter innerhalb des Tumorvolumens quantifizieren. Die Biodistribution der CT-Liposomen 48 Stunden nach der Injektion kann ebenfalls beobachtet werden.

Wie angegeben, zirkuliert das Mittel noch im vaskulären System, wobei eine beträchtliche Aufnahme in Milz und Leber beobachtet wird. Die intratumorale Anreicherung dieser CT-Liposomen ist heterogen, mit einer vorwiegend peripheren Anreicherung im Vergleich zum Tumorgewebezentrum. Die Nadel kann mittels hochauflösender Mikro-CT klar identifiziert werden, was die räumliche Lokalisation der IFP-Messungen innerhalb des Tumorvolumens ermöglicht.

Die räumlich ko-lokalisierte Messung der Perfusionsrate und des Plasmaanteils zeigt eine signifikante Korrelation mit der intratumoralen Anreicherung von CT-Liposomen in subkutanen Tumoren auf. Außerdem korreliert die radiale Verteilung des interstitiellen Fluiddrucks (IFP) mit den anderen hämodynamischen Messungen, was auf eine komplexe räumliche bzw. zeitliche Beziehung zwischen der Tumormikrozirkulation, dem IFP und der intratumoralen Anreicherung der Liposome hindeutet. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, das Tier auf der Scannerliege zu fixieren, um eine minimale Tumorbewegung zwischen den IFP-Messungen sicherzustellen.

Die Auswirkungen dieser Arbeit erstrecken sich auf die Entwicklung neuer Therapien. Der Transport von Nanopartikeln ist ein entscheidender erster Schritt beim Aufbau wirksamer Therapeutika auf der Grundlage der Nanomedizin. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man den interstitiellen Tumordruck, die Tumormikrozirkulation und die Verteilung von Nanopartikeln räumlich abbilden kann.