Isolierung von Perivaskuläre multipotenten Vorläuferzellpopulationen aus menschlichem Herzgewebe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zwei diskrete Populationen multipotenter perivaskulärer Vorläuferzellen aus menschlichem Herzgewebe zu isolieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der kardialen Regeneration zu beantworten, wie z.B. den Beitrag, den Untergruppen der perivaskulären Zellpopulation zu diesem Prozess leisten. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie zu Populationen von Vorläuferzellen mit reduzierter Heterogenität und verbesserter Lebensfähigkeit einer Auswahl der wichtigsten Ex-Adhäsionstechniken führt.

Diese Technik kann Auswirkungen auf die Therapie der ischämischen Herzkrankheit haben, da sich gezeigt hat, dass perivaskuläre Stammzellsubtypen ein kardiomyogenes Potenzial haben. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Rolle perivaskulärer Zellen bei der kardialen Regeneration geben kann, kann sie auch auf die Untersuchung anderer Aspekte von Herzerkrankungen, wie z.B. der Myokardfibrose, angewendet werden. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da sie aufgrund der Gewebefrische lebensfähige Zellen verwenden können.

Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie die Probe nach dem Entfernen des Perikards, der großen Gefäße und der Vorhöfe in ein Waschmedium in einer Petrischale. Schneiden Sie anschließend das ventrikuläre Myokard in kleine Stücke von etwa einem Kubikmillimeter und verarbeiten Sie diese sofort, um die höchste Zellausbeute zu erzielen. Stellen Sie dann eine frische Aufschlusslösung her und erwärmen Sie sie in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius.

Danach filtrieren Sie die suspendierten Gewebestücke durch ein 100-Mikron-Sieb und waschen sie zweimal mit PBS. Füllen Sie die Gewebestücke in ein steriles 30-Milliliter-Gefäß mit dicht verschlossenem Deckel. Geben Sie die Aufschlusslösung hinzu und stellen Sie den Behälter in eine versiegelte Plastiktüte in ein 37 Grad Celsius heißes Schüttelwasserbad, das auf 120 U/min eingestellt ist.

Nach 15 Minuten drehen Sie den Behälter dreimal um. Legen Sie es dann für weitere 15 Minuten wieder in das Wasserbad. Entfernen und löschen Sie anschließend die Kollagenasen mit fünf Millilitern DMEM, ergänzt mit 20 % FBS.

Zertrierieren Sie anschließend das verdaute Gewebe, indem Sie 10 bis 20 Mal vorsichtig mit einer 10-Milliliter-Serologiepipette pipettieren, um eventuelle Gewebeklumpen aufzubrechen. Als nächstes filtrieren Sie die Suspension nacheinander durch 100 Mikron, 70 Mikron und schließlich 40 Mikron Zellsiebe, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 x g für vier Minuten.

Den Überstand vorsichtig dekantieren und das Pellet zwei Minuten lang bei Raumtemperatur in einem Milliliter Erythrozyten-Lysierungspuffer resuspendieren, bevor es mit vier Millilitern Waschmedium verdünnt wird. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt und suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Waschmedium. Verdünnen Sie 10 Mikroliter Zellsuspension mit 90 Mikrolitern Waschmedium, um eine Verdünnung von eins zu 10 zu erhalten.

Mischen Sie 10 Mikroliter der verdünnten Zellsuspension mit 10 Mikrolitern Trypanblau-Färbung und geben Sie 10 Mikroliter der Mischung zur Zellzählung auf ein Standard-Hämozytometer. Bei diesem Verfahren fügen Sie der Zellsuspension 50 Mikroliter Mausserum hinzu und inkubieren sie 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius, um die unspezifische Antikörperbindung zu blockieren. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 x g für vier Minuten.

Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie ihn wieder in Waschmedium. Als nächstes aliquotieren Sie 50 Mikroliter der Zellsuspension in jedes der beiden Polystyrol-Durchflusszytometrieröhrchen mit rundem Boden für den Isotyp und die ungefärbten Kontrollen und geben das verbleibende Volumen in ein drittes Röhrchen für die Mehrfarbenfärbung. Fügen Sie der Einzelzellsuspension fünf Antikörper hinzu, um eine mehrfarbige Färbung zu erhalten.

Mischen Sie die Antikörper vorsichtig mit den Zellen und inkubieren Sie alle Röhrchen 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Bereiten Sie die Kompensationskontrollkügelchen vor, indem Sie einen Tropfen positive Kügelchen auf 100 Mikroliter Waschmedium in fünf Durchflusszytometrieröhrchen geben. Geben Sie die Antikörper einzeln in jedes der fünf Röhrchen.

Inkubieren Sie dann alle Röhrchen 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Bereiten Sie in der Zwischenzeit Zellentnahmeröhrchen mit je 500 Mikrolitern EGM-2-Kulturmedium vor und stellen Sie sie auf vier Grad Celsius. Nach der Antikörperinkubation fügen Sie fünf Milliliter Waschmedium hinzu, um die Zellen und Kügelchen zu waschen und alle ungebundenen Antikörper zu entfernen.

Zentrifugieren Sie alle Röhrchen bei 200 x g für vier Minuten. Wiederholen Sie die Wasch- und Zentrifugationsschritte und dekantieren Sie den Überstand vorsichtig. Dann resuspendieren Sie die Zellen in Waschmedium in einer Konzentration von eins mal 10 bis zur 6. Zelle pro 250 Mikroliter.

Anschließend die Kügelchen in 100 Mikrolitern Waschmedium resuspendieren. Übergeben Sie die Zell- und Beadsuspensionen im Dunkeln auf Eis in den Zellsorter. Geben Sie einen Tropfen negative Kügelchen in die Steuerröhren für die positive Perlchenkompensation und stellen Sie mit diesen die Fluoreszenzkompensation ein.

Lassen Sie dann die ungefärbten Kontrollzellen laufen, um die Hintergrundfluoreszenz zu ermitteln und die Spannungen einzustellen. Führen Sie anschließend die Kontrollisotypen aus, um die Hintergrundfluoreszenzschwellenwerte in Bezug auf unspezifische Bindung festzulegen. Führen Sie die mehrfarbig gefärbte Probe durch und sammeln Sie die Perizyten- und Adventitialzellpopulationen in den Entnahmeröhrchen.

Fügen Sie bei diesem Verfahren 100 Mikroliter sterile 0,2%ige Gelatinelösung pro Quadratzentimeter Wachstumsfläche hinzu und rühren Sie manuell um, um die Gesamtheit der Vertiefungen zu beschichten. Danach die Platten 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubieren. Entfernen Sie dann die Gelatinelösung vollständig.

Halten Sie die gesammelten Zellen auf Eis, während Sie die Kulturplatten vorbereiten. Anschließend zentrifugieren Sie die frisch gesammelten Zellen bei 200 x g für vier Minuten und resuspendieren das Zellpellet vorsichtig in einer angemessenen Menge EGM-2. Anschließend säen Sie die Zellen auf die mit Gelatine beschichteten Platten.

In dieser Abbildung wurden lebende Zellen so gegated, dass zuerst CD45-positive Zellen gefolgt von CD56-positiven Zellen ausgeschlossen wurden. CD144-positive Endothelzellen wurden dann aus der CD56-negativen Fraktion entfernt. Aus dieser endgültigen Population wurden CD146-positive, CD34-negative Perizyten und CD146-negative, CD34-positive Adventitialzellen ausgewählt und anschließend gesammelt.

Sowohl Kulturen von FACS-gereinigten Myokardperizyten als auch von Adventitialzellen weisen eine Spindel- bis Sternzellmorphologie auf. Sobald diese Technik gemeistert ist, dauert es etwa fünf Stunden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die frischesten Proben die beste Ausbeute an lebensfähigen Zellen liefern.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z. B. die zelluläre Kardiomyoplastik, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. die Eignung dieser Zellen bei der Behandlung von ischämischen Herzkrankheiten.