Isolierung von Perivaskuläre multipotenten Vorläuferzellpopulationen aus menschlichem Herzgewebe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zwei diskrete Populationen von multipotenten perivaskulären Vorläuferzellen aus menschlichem Herzzellgewebe zu isolieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Herzerneuerung zu beantworten, beispielsweise welchen Beitrag Teilpopulationen der perivaskulären Zellen zu diesem Prozess leisten. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik liegen darin, dass sie Populationen von Vorläuferzellen mit geringerer Heterogenität und einer verbesserten Lebensfähigkeit im Vergleich zu einer Auswahl gängiger Adhäsionsmethoden erzeugt.

Diese Technik könnte Auswirkungen auf die Therapie der ischämischen Herzkrankheit haben, da gezeigt wurde, dass perivaskuläre Stammzellsubtypen kardiomyogene Potenzial besitzen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Rolle perivaskulärer Zellen bei der kardialen Regeneration ermöglichen kann, ist sie auch auf die Untersuchung anderer Aspekte der Herzerkrankung anwendbar, wie beispielsweise der myokardialen Fibrose. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund der Verwendung lebensfähiger Zellen Schwierigkeiten haben, die sich aus der Frische des Gewebes ergeben.

Um dieses Verfahren zu beginnen, nachdem das Perikard, die großen Gefäße und die Vorhöfe entfernt wurden, wird die Probe in ein Waschmedium in eine Petrischale gegeben. Anschließend wird das ventrikuläre Myokard in kleine Stücke von etwa einem Kubikmillimeter Größe geschnitten und unverzüglich weiterverarbeitet, um die höchste Zellausbeute zu erzielen. Danach wird eine frische Verdauungslösung hergestellt und im Wasserbad auf 37 Grad Celsius erwärmt.

Anschließend die suspendierten Gewebestücke durch ein 100-Mikron-Sieb filtrieren und zweimal mit PBS waschen. Die Gewebestücke in einen sterilen 30-Milliliter-Behälter mit dicht schließendem Deckel überführen. Die Digestionslösung hinzufügen und den Behälter in einer verschlossenen Plastiktüte in ein schüttelndes Wasserbad bei 37 Grad Celsius mit einer Drehzahl von 120 U/min stellen.

Nach 15 Minuten den Behälter dreimal umstülpen. Anschließend für weitere 15 Minuten in das Wasserbad zurückstellen. Danach entfernen und die Kollagenasen mit fünf Millilitern DMEM, ergänzt mit 20 % FBS, abkühlen.

Im Anschluss das digestierte Gewebe durch vorsichtiges Pipettieren mit einer 10-Milliliter-Serologischen Pipette 10 bis 20 Mal auftragen, um Gewebeklumpen aufzulösen. Danach die Suspension nacheinander durch Zellfilter mit 100 Mikron, 70 Mikron und schließlich 40 Mikron filtern, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Anschließend die Zellsuspension 4 Minuten lang bei 200 × g zentrifugieren.

Den Überstand vorsichtig dekantieren und das Pellet in einem Milliliter Erythrozyten-Lysierpuffer für zwei Minuten bei Raumtemperatur resuspendieren, bevor es mit vier Millilitern Waschmedium verdünnt wird. Den Zentrifugationsschritt wiederholen und das Pellet in einem Milliliter Waschmedium resuspendieren. 10 Mikroliter Zellsuspension mit 90 Mikrolitern Waschmedium verdünnen, um eine 1:10-Verdünnung der Zellsuspension herzustellen.

Mischen Sie 10 Mikroliter der verdünnten Zellsuspension mit 10 Mikrolitern Trypanblau-Färbung und geben Sie 10 Mikroliter der Mischung auf ein Standard-Hämozytometer zur Zellzählung. Geben Sie in diesem Verfahren 50 Mikroliter Mauserum zur Zellsuspension hinzu und inkubieren Sie sie 20 Minuten bei vier Grad Celsius, um unspezifische Antikörperbindungen zu blockieren. Zentrifugieren Sie anschließend die Zellsuspension bei 200 × g für vier Minuten.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in Waschmedium. Verteilen Sie anschließend je 50 Mikroliter der Zellsuspension auf zwei Rundboden-Polystryrol-Röhrchen für Durchflusszytometrie, die als Isotyp- und Ungefärbt-Kontrollen dienen, und geben Sie das verbleibende Volumen in ein drittes Röhrchen für die Mehrfarben-Färbung. Geben Sie fünf Antikörper zur einzelnen Zellsuspension für die Mehrfarben-Färbung hinzu.

Pipettieren Sie vorsichtig, um die Antikörper mit den Zellen zu mischen, und inkubieren Sie alle Röhrchen 20 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Bereiten Sie die Kompensationskontrollperlen vor, indem Sie einen Tropfen positiver Perlen zu 100 Mikrolitern Waschmedium in fünf Durchflusszytometrieröhrchen hinzufügen. Geben Sie die Antikörper einzeln zu jedem der fünf Röhrchen hinzu.

Danach alle Röhrchen 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln inkubieren. In der Zwischenzeit Sammelröhrchen für die Zellen vorbereiten, jedes mit 500 Mikrolitern EGM-2-Kulturmedium, und diese bei vier Grad Celsius platzieren. Nach der Antikörperinkubation fünf Milliliter Waschpuffer hinzufügen, um die Zellen und Perlen zu waschen und nicht gebundene Antikörper zu entfernen.

Zentrifugieren Sie alle Röhrchen bei 200 x g für vier Minuten. Wiederholen Sie die Wasch- und Zentrifugationsschritte und dekantieren Sie vorsichtig den Überstand. Anschließend resuspendieren Sie die Zellen in Waschmedium bei einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro 250 µL.

Anschließend die Perlen in 100 Mikroliter Waschmedium resuspendieren. Die Zell- und Perlensuspensionen im Dunkeln auf Eis zum Zellsortierer überführen. Einen Tropfen negative Perlen zu den positiven Perlen-Kompensationskontrollgefäßen hinzufügen und diese zur Einstellung der Fluoreszenzkompensation verwenden.

Führen Sie anschließend die unbehandelten Kontrollzellen aus, um die Hintergrundfluoreszenz zu bestimmen und die Spannungen einzustellen. Danach analysieren Sie die Kontroll-Isotypen, um die Schwellenwerte der Hintergrundfluoreszenz aufgrund unspezifischer Bindung festzulegen. Führen Sie die mehrfarbig markierte Probe aus und sammeln Sie die Populationen der Perizyten und adventitiellen Zellen in den Sammelröhrchen.

Fügen Sie bei diesem Verfahren 100 Mikroliter sterile 0,2 %ige Gelatinelösung pro Quadratzentimeter Wachstumsfläche hinzu und schwenken Sie manuell, um die gesamten Vertiefungen zu beschichten. Anschließend inkubieren Sie die Platten 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Danach entfernen Sie die Gelatinelösung vollständig.

Halten Sie die gesammelten Zellen während der Vorbereitung der Kulturplatten auf Eis. Zentrifugieren Sie anschließend die frisch gesammelten Zellen bei 200 x g für vier Minuten und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in einer geeigneten Menge EGM-2. Danach säen Sie die Zellen auf die mit Gelatine beschichteten Platten aus.

In dieser Abbildung wurden lebende Zellen zunächst so selektiert, dass CD45-positive Zellen ausgeschlossen wurden, gefolgt vom Ausschluss der CD56-positiven Zellen. Anschließend wurden CD144-positive endotheliale Zellen aus dem CD56-negativen Anteil entfernt. Aus dieser endgültigen Population wurden CD146-positive, CD34-negative Perizyten und CD146-negative, CD34-positive adventitielle Zellen ausgewählt und anschließend gesammelt.

Sowohl Kulturen von FACS-gereinigten myokardialen Perizyten als auch von adventitiellen Zellen weisen eine spindel- bis sternförmige Zellmorphologie auf. Wenn man diese Technik einmal beherrscht, dauert sie, bei ordnungsgemäßer Durchführung, etwa fünf Stunden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die frischsten Proben die höchste Ausbeute an vitalen Zellen liefern.

Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die zelluläre Kardiomyoplastie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise die Eignung dieser Zellen zur Behandlung der ischämischen Herzkrankheit.