Mikroskopie-basierte Assays für die Hochdurchsatz-Screening von Host beteiligten Faktoren in

Das übergeordnete Ziel dieses hochdurchsatzfähigen, mikroskopiebasierten Assays besteht darin, Wirtsfaktoren zu identifizieren, die an der Brucella-Infektion von HeLa-Zellen beteiligt sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Wirt-Pathogen-Interaktion zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung von Wirtsproteinen, die die Kolonisierung durch den intrazellulären Erreger Brucella entweder fördern oder verhindern. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass der halbautomatisierte Workflow vom Probeneingang bis zur Bildanalyse die Nutzung von Robotern ermöglicht und somit effiziente Hochdurchsatz-Experimente erlaubt.

Daher kann diese Methode Einblicke in die Wechselwirkungen von Brucella mit dem Wirt mithilfe von siRNA-Screens liefern. Der größte Teil des Protokolls kann auf andere Screening-Strategien angewendet werden, zum Beispiel auf siRNA-Bibliotheken.

Nachdem HeLa-Zellen kultiviert und Screening-Platten mit siRNAs gemäß dem Textprotokoll vorbereitet wurden, eine schwarze 384-Well-Platte durch Zentrifugation bei 300 ×g und Raumtemperatur für 20 Minuten auftauen. Transfektionsmedium herstellen, indem DMEM ohne FCS bei Raumtemperatur verwendet wird. Den Transfektionsreagenz im Verhältnis 1 zu 200 verdünnen und vor der Verwendung vorsichtig mischen.

Mit einem Reagenzien-Dispenser 25 Mikroliter Transfektionsmedium in jede Vertiefung der 384er-Platte geben und die Lösungen durch Hin- und Herbewegen der Platte mischen. Die Platte eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, um die Bildung der siRNA-Transfektionsreagenz-Komplexe zu ermöglichen. In der Zwischenzeit HeLa-Zellen vorbereiten, indem das Kulturmedium abgesaugt und 2,5 Milliliter 0,05 %iger Trypsin-EDTA in PBS zum Waschen der subkonfluenten Zellen aus einem 75 Quadratzentimeter-Fläschchen verwendet werden.

Fügen Sie dann 1,5 Milliliter frisches Trypsin hinzu und stellen Sie den Kolben für zwei bis drei Minuten auf 37 Grad Celsius, bis sich die Zellen abgerundet haben. Verwenden Sie 10 Milliliter vorgewärmtes DMEM mit 60 % FCS, um die Zellen erneut in Suspension zu bringen. Anschließend zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzähler, bevor Sie eine Zellsuspension mit 10.000 Zellen pro Milliliter in DMEM mit 16 % FCS herstellen.

Fügen Sie 50 µL Zellsuspension zu jedem Loch des Transreagenz hinzu. Dies ergibt 500 Zellen pro Loch. Bewegen Sie die Platte vor und zurück, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.

Anschießend die Platte fünf bis zehn Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen, damit sich die Zellen absetzen können. Die Platte mit Parafilm verschließen und 72 Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator auf einer vorgewärmten Aluminiumplatte bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubieren.

Die Arbeit mit dem Pathogen der Risikoklasse drei B.abortus ist gefährlich, und es müssen die lokalen Biosicherheitsvorschriften eingehalten werden, die das Tragen eines Schutzanzugs, von Schutzhandschuhen, einer Maske und einer Schutzbrille umfassen. Einen Tag vor der Infektion wird die zuvor bestimmte Menge der B.abortus-Starterkultur in 50 Milliliter TSB-KM-Medium in einer 250-Milliliter-Schraubflasche angeimpft.

Verschließen Sie die Flasche mit Parafilm und kultivieren Sie die Bakterien über Nacht bei 37 Grad Celsius und 100 U/min in einem Schüttelinkubator, bis eine optische Dichte bei 600 nm im Bereich von 0,8 bis 1,1 erreicht ist. Messen Sie die optische Dichte bei 600 nm der Bakterienkultur. Bereiten Sie anschließend das Infektionsmedium vor, indem Sie die Bakterienkultur in DMEM mit 10 % FCS verdünnen, um die gewünschte Multiplizität der Infektion zu erreichen.

Oder MOI. Mit einem automatisierten Plattenwascher das Transfektionsmedium durch 50 Mikroliter Infektionsmedium ersetzen. Die Platte im Sicherheitswerkbank in den Zentrifugenkorb überführen und die 384-Loch-Platte bei 400 × g und 4 °C 20 Minuten lang zentrifugieren.

Verwenden Sie anschließend Parafilm, um die Platte abzudichten, und inkubieren Sie sie vier Stunden lang auf einer vorgewärmten Aluminiumplatte bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen mithilfe des automatisierten Plattenwäschers mit DMEM, das 10 % FCS und 100 Mikrogramm pro Milliliter Dentrimysen oder GM enthält, um extrazelluläre Bakterien zu inaktivieren. Dichten Sie die Platte danach erneut mit Parafilm ab und stellen Sie sie für weitere 40 Stunden auf die vorgewärmte Aluminiumplatte im Inkubator, um den Endpunkt-Assay durchzuführen.

Um die Zellen zu fixieren, waschen Sie zunächst die Vertiefungen mit PBS. Anschließend ersetzen Sie das PBS durch 50 Mikroliter 3,7 % PFA in 2 bei pH 7,4.

Die Zellen anschließend 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation das Fixiermedium durch 50 Mikroliter PBS ersetzen. Um die Proben mit dem automatisierten Plattenwascher zu färben, zunächst 50 Mikroliter 1 % Triton X-100 in PBS für 10 Minuten verwenden, um die Zellen zu permeabilisieren.

Nachdem die Zellen dreimal mit PBS gewaschen wurden, 50 Mikroliter PBS mit einem Mikrogramm pro Milliliter DAPI hinzufügen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend die Zellen dreimal mit PBS waschen und vor Licht schützen. Die Platte auf das automatisierte Mikroskop übertragen.

Stellen Sie die Mikroskop-Parameter ein. Wählen Sie das 10-fache Objektiv. Wählen Sie dann das Plattenformat, das der 384-Loch-Platte entspricht.

Neun Stellen pro Vertiefung aufnehmen. Aktivieren Sie die laserbasierte Fokussierung. Und fokussieren Sie auf den Boden der Platte und der Vertiefung.

Danach als erstes erfasstes Feld als Ausgangsfeld für die Probenfindung und alle Positionen für die Positions-Autofokusfunktion festlegen. Anschließend für den DAPI-Kanal den Z-Offset manuell zur Fokussierung einstellen. Danach Proben finden drücken, um den Fokus auf den Boden des Wells einzustellen.

Verwenden Sie die Automatische Belichtungssteuerung (AutoExposure-Funktion), um eine gute Schätzung für die Belichtungszeit zu erhalten. Korrigieren Sie die Belichtungszeit für den DAPI-Kanal manuell, um einen großen Dynamikbereich mit geringer Überbelichtung sicherzustellen. Verwenden Sie diese Belichtungszeit, um mehrere Stellen über die gesamte Platte hinweg abzubilden.

Und passen Sie die Belichtungszeit manuell an, bis die hellsten Pixel etwa 80 % der maximalen Helligkeit über den Positionen erreichen. Wiederholen Sie die Schritte zur Einstellung von Fokus und Belichtungszeit entsprechend für alle anderen Kanäle. Starten Sie anschließend die Aufnahme der gesamten Platte.

Verwenden Sie für den Endpunkt-Assay die DAPI- und GFP-Kanäle, um die gesamte Platte abzubilden. Um eine Bildanalyse an gefärbten Zellen im Endpunkt-Assay durchzuführen, wählen Sie nach Erstellung eines Schattierungsmodells gemäß der Textanleitung unter „View output settings“ den Eingabeordner mit den Bildern und einen Ausgabeordner für die Ergebnisse aus. Definieren Sie anschließend den Text, den die Bilder gemeinsam haben, und laden Sie die Schattierungsmodelle.

Klicken Sie auf „Testmodus starten“ und stellen Sie sicher, dass die Pausen- und Anzeigeeinstellungen für alle Module deaktiviert sind. Aktivieren Sie die Pausen- und Anzeigeeinstellung für Modul neun ImageMath. Das aktivierte Pausensymbol erscheint gelb.

Die aktivierte Anzeigefunktion erscheint als offenes Auge. Klicken Sie anschließend auf „Ausführen“, um die Analyse bis zum Modul neun durchzuführen. Passen Sie im Modul neun den Parameter „zweites Bild multiplizieren mit“ auf einen Wert an, der das DAPI-Signal in Brucella unterdrückt, ohne die Kerne zu beeinträchtigen.

Um die Werte für das Modul zu testen, klicken Sie auf „Schritt“. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das neu geöffnete Bild und stellen Sie den Bildkontrast auf logarithmisch normalisiert ein. Gehen Sie wiederholt zurück zum Modul neun.

Passt den Parameter an, mit dem das zweite Bild multipliziert wird, und durchläuft das Modul erneut, bis das Brucella-Signal vollständig unterdrückt ist, während gleichzeitig schwarze Bereiche, die eine Überkompensation anzeigen, minimiert werden. Die Suche nach geeigneten Parametern für bestimmte Module erfordert eine schrittweise Optimierung der Parameter. Es ist auf jeden Fall wichtig, die Module mehrfach zu durchlaufen, verschiedene Werte auszuprobieren und die Auswirkungen auf das angezeigte Ergebnis zu beobachten.

Aktivieren Sie Pause und Anzeige für Modul 10. Identifizieren Sie die primären Objekte. Stellen Sie die untere Grenze des Schwellenwerts so hoch ein, dass Kerne segmentiert werden und der Hintergrund ignoriert wird.

Um einen geeigneten Schwellenwert zu finden, bewegen Sie den Mauszeiger über das Modul und klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf das Eingabebild, um das Histogramm anzuzeigen, dessen Peak typischerweise den Hintergrund anzeigt. Erhöhen Sie ausgehend von der Hintergrundintensität den Parameter, bis eine gute Segmentierung der Zellkerne erreicht ist, wie im Ausgabebild dargestellt. Das Ziel der Bildanalyse-Pipeline besteht darin, Zellen zu identifizieren, die replizierende Bakterien enthalten.

Dies wird durch die Festlegung unterschiedlicher Schwellenwerte für das Pathogen-Signal im Kern, im perinukleären Bereich und im Voronoi-Zellkörper erreicht. Pausieren und Anzeigen für Modul 15 aktivieren. Objekte filtern, wie zuvor gezeigt, und Ausführen drücken.

Stellen Sie den Parameter-Mindestwert ausreichend hoch ein, sodass nur Zellen mit deutlich sichtbaren Brucella im Kern beibehalten werden und alle anderen herausgefiltert werden. Um einen geeigneten Wert zu finden, schalten Sie das Modul durch und zeigen Sie das Ausgabebild an. Erhöhen Sie den Wert schrittweise, bis nur noch Zellen mit deutlich sichtbaren Brucella am Kern übrig bleiben.

Nach der Filterung von Zellen mit Bakterien im perinukleären Bereich und dem Voronoi-Zellkörper in den Modulen 16 und 17 gemäß dem Textprotokoll verlassen Sie den Testmodus und deaktivieren Sie alle Augensymbole neben den Modulen, um sicherzustellen, dass vor dem Start der vollständigen Analyse keines der Module seine Anzeige zeigt. Drücken Sie abschließend auf „Analyse starten“, um die Analyse zu beginnen. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, überprüfen Sie die resultierenden PNG-Bilder sowie die CSV-Tabelle, um sicherzustellen, dass die Analyse zuverlässig über die gesamte Platte hinweg funktioniert hat.

Führen Sie den Eintritts-Assay und die Infektionsbewertung gemäß dem Textprotokoll durch. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel einer Bildanalyse, die verwendet wurde, um infizierte Zellen im Endpunkt-Assay automatisch zu identifizieren. Die Kerne von HeLa-Zellen, die mit DAPI gefärbt wurden, wurden identifiziert.

Ein perinukleärer Bereich von acht Pixeln Breite, der den Zellkern umgibt, sowie ein durch 25 Pixel erweiteter Voronoi-Zellkörper wurden berechnet. Eine Zelle galt als infiziert, wenn das Pathogen-Signal in mindestens einem Kompartiment den entsprechenden Schwellenwert überschritt.

Brucella benötigt Aktin-Neuanordnungen für eine erfolgreiche Bindung an Wirtszellen. Daher ist die Depletion von ARP23 eine geeignete positive Kontrolle für die siRNA-Screening. Die Depletion von ARPC3 verringerte die Anzahl der Zellen mit proliferierenden Bakterien zwei Tage nach der Infektion.

Im Vergleich zu kontrollierten, mit Scrambled-Behandlung behandelten Zellen. Die automatisierte Bildanalyse zeigte in diesem Diagramm eine quantifizierbare Abnahme der Infektion in ARPC3-depletierten HeLa-Zellen im Vergleich zu kontrollierten Zellen. Die Ausschöpfung von ARPC3 zeigte ebenfalls eine Verringerung der Brucella-Infektion im Eintritts-Assay im Vergleich zu kontrollierten Zellen.

Wie an der verringerten Anzahl intrazellulärer Brucella, dargestellt in Gelb, zu erkennen ist. Schließlich bestätigte die Quantifizierung der Infektion mittels automatisierter Bildanalyse, dass sowohl die Anzahl infizierter Zellen als auch die Anzahl intrazellulärer Bakterien in infizierten Zellen durch den Verlust von ARPC3 reduziert war. Wenn man den Protokollablauf einmal beherrscht, können innerhalb von eineinhalb Wochen nach Versuchsbeginn Ergebnisse der Bildanalyse vorliegen.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Ergebnisse der Bildanalyse sorgfältig zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die gewählten Parameter über die gesamte Platte hinweg gut funktionieren. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Live-Cell-Bildgebung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise, wann ein bestimmter Wirtsfaktor mit Brucella interagiert.

Oder wie die Abschaltung eines Gens die intrazellulären Dynamiken einer Infektion beeinflusst. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern im Bereich der Infektionsbiologie den Weg, Wirtsfaktoren zu untersuchen, die für die Brucella-Infektion in einem HeLa-Zell-Assay erforderlich sind. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Wirtsfaktoren identifiziert, die die erfolgreiche Besiedlung von HeLa-Zellen durch den intrazellulären Erreger Brucella abortus fördern oder verhindern.

Beachten Sie, dass die Arbeit mit Brucella abortus äußerst gefährlich sein kann und die lokalen Biosicherheitsvorschriften strikt eingehalten werden müssen.