Mikroskopie-basierte Assays für die Hochdurchsatz-Screening von Host beteiligten Faktoren in Brucella Die Infektion von HeLa-Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses auf Hochdurchsatzmikroskopie basierenden Assays ist es, Wirtsfaktoren zu identifizieren, die an der Brucella-Infektion von HeLa-Zellen beteiligt sind. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Wirtserreger-Interaktion zu beantworten, wie z.B. die Identifizierung von Wirtsproteinen, die die Besiedlung durch den intrazellulären Erreger Brucella entweder fördern oder verhindern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass der halbautomatische Arbeitsablauf vom Tierarztlabor bis zur Bildanalyse Roboter und effiziente Hochdurchsätze bei der Erstellung von Experimenten ermöglicht.

Diese Methode kann also mithilfe von siRNA-Screenings Einblicke in Brucella-Wirtsinteraktionen geben. Der größte Teil des Protokolls kann auf andere Screening-Strategien angewendet werden. Zum Beispiel oder siRNA-Bibliotheken.

Nach der Kultivierung von HeLa-Zellen und der Vorbereitung von Screening-Platten mit siRNAs gemäß dem Textprotokoll wird eine schwarze 384-Well-Platte durch Zentrifugation bei 300-facher G-Temperatur und Raumtemperatur für 20 Minuten aufgetaut. Bereiten Sie das Transfektionsmedium mit Raumtemperatur-DMEM ohne FCS vor. Um das Transfektionsreagenz eins bis 200 zu verdünnen, und vor Gebrauch vorsichtig mischen.

Geben Sie mit einem Reagenzienspender 25 Mikroliter Transfektionsmedium in jede Vertiefung der 384-Well-Platte und mischen Sie die Lösungen, indem Sie die Platte hin und her bewegen. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur, um die Bildung eines siRNA-Transfektionsreagenzkomplexes zu ermöglichen. In der Zwischenzeit bereiten Sie HeLa-Zellen vor, indem Sie das Kulturmedium aspirieren und 2,5 Milliliter 0,05%iges Trypsin-EDTA in PBS hinzufügen, um die subkonfluenten Zellen eines 75-Quadratzentimeter-Kolbens einmal zu waschen.

Fügen Sie dann 1,5 Milliliter frisches Trypsin hinzu und stellen Sie den Kolben für zwei bis drei Minuten auf 37 Grad Celsius, bis sich die Zellen aufrunden. Verwenden Sie 10 Milliliter vorgewärmtes dmem 60%FCS, um die Zellen zu resuspendieren. Verwenden Sie dann einen automatisierten Zellzähler, um die Zellen zu zählen, bevor Sie eine Zellsuspension von 10.000 Zellen pro Milliliter in dmem mit 16 % FCS herstellen.

Geben Sie 50 Mikroliter Zellsuspension in jede Vertiefung des Transfektionsreagenzes. Das Ergebnis sind 500 Zellen pro Well. Bewegen Sie die Platte hin und her, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.

Lassen Sie die Platte dann fünf bis 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit sich die Zellen absetzen können. Verwenden Sie Parafilm, um die Platte zu versiegeln. Und inkubieren Sie es in einem feuchten Inkubator auf einer vorgewärmten Aluminiumplatte bei 37 Grad Celsius mit 5% C02 für 72 Stunden.

Die Arbeit mit dem Erreger der Klasse 3, B. abortus, ist gefährlich und die lokalen Biosicherheitsvorschriften müssen befolgt werden, einschließlich des Tragens eines Schutzanzugs, von Schutzhandschuhen, einer Maske und einer Schutzbrille. Einen Tag vor der Infektion wird die zuvor ermittelte Menge an B.abortus-Starterkultur in 50 Milliliter TSB KM-Medium geimpft. In einer 250-Milliliter-Flasche mit Schraubverschluss.

Verwenden Sie Parafilm, um die Flasche zu versiegeln, und züchten Sie Bakterien über Nacht bei 37 Grad Celsius und 100 U/min auf einem Shaker auf eine optische Dichte von 600,8 bis 1,1. Messen Sie die optische Dichte 600 der Bakterienkultur. Und bereiten Sie das Infektionsmedium vor, indem Sie die Bakterienkultur in dmem 10%FCS verdünnen, um die gewünschte Infektionsvielfalt zu erreichen.

Oder, MOI. Tauschen Sie mit einer automatisierten Plattenwaschmaschine das Transfektionsmedium gegen 50 Mikroliter Infektionsmedium aus. Übertragen Sie die Platte in der Haube in den Zentrifugenkäfig und zentrifugieren Sie die 384-Well-Platte bei 400 Mal G und vier Grad Celsius für 20 Minuten.

Verwenden Sie dann Parafilm, um die Platte zu versiegeln, und inkubieren Sie sie vier Stunden lang auf einer vorgewärmten Aluminiumplatte bei 37 Grad Celsius und 5 % C02. Nach der Inkubation mit dem automatischen Plattenwascher verwenden Sie dmem mit 10 % FCS, das 100 Mikrogramm pro Milliliter Dentrimysen oder GM enthält, um die Zellen zu waschen und extrazelluläre Bakterien zu inaktivieren. Verwenden Sie dann Parafilm, um die Platte zu versiegeln, und legen Sie sie für weitere 40 Stunden für den Endpunkt-Assay wieder auf die vorgewärmte Aluminiumplatte im Inkubator.

Um die Zellen zu fixieren, verwenden Sie zuerst PBS, um die Vertiefungen zu waschen. Tauschen Sie dann das PBS gegen 50 Mikroliter 3,7 % PFA aus. In 2 bei pH 7,4.

Und inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation verwenden Sie 50 Mikroliter PBS, um das Fixierungsmedium auszutauschen. Um die Proben mit der automatischen Plattenwaschmaschine zu färben, verwenden Sie zunächst 10 Minuten lang 50 Mikroliter 1%Triton X-100 in PBS, um die Zellen zu permeabilisieren.

Nachdem Sie die Zellen dreimal mit PBS gewaschen haben, fügen Sie 50 Mikroliter PBS mit einem Mikrogramm pro Milliliter DAPI hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Verwenden Sie dann PBS, um die Zellen dreimal zu waschen, bevor Sie sie vor Licht schützen. Übertragen Sie die Platte in das automatisierte Mikroskop.

Richten Sie die Mikroskopparameter ein. Wählen Sie das subjektive 10-X aus. Wählen Sie dann das Plattenformat aus, das der 384-Well-Platte entspricht.

Erwerben Sie neun Standorte pro Bohrloch. Wählen Sie Laserbasierte Fokussierung aktivieren aus. Und konzentrieren Sie sich auf den Boden der Platte und des Bohrlochs.

Legen Sie dann die erste Vertiefung fest, die als anfängliche Vertiefung für die Suche nach der Stichprobe und alle Stellen für den Autofokus der Stelle erfasst wurde. Passen Sie als Nächstes für den DAPI-Kanal den Z-Offset für den Fokus manuell an. Drücken Sie dann auf Probe suchen, um den Fokus auf den Vertiefungsboden zu setzen.

Mit der AutoExposure-Funktion erhalten Sie eine gute Schätzung der Belichtungszeit. Korrigieren Sie die Belichtungszeit für den DAPI-Kanal manuell, um einen großen Dynamikbereich bei geringer Überbelichtung zu gewährleisten. Verwenden Sie diese Belichtungszeit, um mehrere Stellen auf der Platte abzubilden.

Und passen Sie die Belichtungszeit manuell an, bis die hellsten Pixel etwa 80 % der maximalen Helligkeit über den Standorten erreichen. Wiederholen Sie die Schritte, um den Fokus und die Belichtungszeit entsprechend für alle anderen Kanäle einzustellen. Beginnen Sie dann mit der Erfassung der vollen Platte.

Verwenden Sie für den Endpunkt-Assay die DAPI- und GFP-Kanäle, um die gesamte Platte abzubilden. Um eine Bildanalyse an gefärbten Zellen im Endpunkt-Assay durchzuführen, wählen Sie nach der Berechnung eines Schattierungsmodells gemäß dem Textprotokoll unter Ausgabeeinstellungen anzeigen den Eingabeordner mit den Bildern und einen Ausgabeordner mit den Ergebnissen aus. Definieren Sie dann den Text, den die Bilder gemeinsam haben, und laden Sie die Schattierungsmodelle.

Klicken Sie auf Testmodus starten, und stellen Sie sicher, dass die Einstellung Pause und Anzeigen für alle Module deaktiviert sind. Aktivieren Sie die Pausen- und Anzeigeeinstellung für Modul neun ImageMath. Das aktivierte Pause-Symbol wird gelb angezeigt.

Die aktivierte Anzeigefunktion wird als offenes Auge angezeigt. Klicken Sie anschließend auf Ausführen, um die Analyse bis Modul neun auszuführen. Im neunten Modul stellen Sie den Parameter ein, multiplizieren Sie das zweite Bild mit einem Wert, der das DAPI-Signal in Brucella unterdrückt, ohne die Kerne zu unterdrücken.

Um die Werte für das Modul zu testen, drücken Sie Step. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das neu geöffnete Bild und stellen Sie den Bildkontrast auf logarithmisch normalisiert. Kehren Sie wiederholt zu Modul neun zurück.

Stellen Sie den Parameter ein, multiplizieren Sie das zweite Bild mit und fahren Sie erneut über das Modul, bis das Brucella-Signal vollständig unterdrückt ist, während gleichzeitig schwarze Bereiche, die auf eine Übersubtraktion hinweisen, minimiert werden. Um gute Parameter für bestimmte Module zu finden, müssen die Parameter schrittweise optimiert werden. Es ist auf jeden Fall wichtig, immer wieder über die Module zu gehen, verschiedene Werte auszuprobieren und die Auswirkung auf das angezeigte Ergebnis zu beobachten.

Aktivieren Sie Pause und Anzeige für Modul 10. Identifizieren Sie primäre Objekte. Legen Sie den Parameter Untergrenze für den Schwellenwert fest, hoch genug, damit die Kerne segmentiert werden und der Hintergrund ignoriert wird.

Um einen guten Wert zu identifizieren, überspringen Sie das Modul, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Eingabebild und zeigen Sie das Histogramm an, wo der Peak normalerweise den Hintergrund anzeigt. Ausgehend von der Hintergrundintensität erhöhen Sie den Parameter, bis die gute Segmentierung der Kerne erreicht ist, wie sie im Ausgabebild dargestellt wird. Das Ziel der Bildanalyse-Pipeline ist es, Zellen zu identifizieren, die replizierende Bakterien enthalten.

Dies wird erreicht, indem unterschiedliche Schwellenwerte für das Erregersignal im Zellkern, im Perikern und im Voronoi-Zellkörper festgelegt werden. Aktivieren Sie Pause und Anzeige für Modul 15. Filtern Sie Objekte, wie zuvor gezeigt, und drücken Sie Ausführen.

Stellen Sie den Parameter-Minimalwert so hoch ein, dass nur Zellen mit deutlich sichtbaren Brucella im Zellkern erhalten bleiben und alle anderen weggefiltert werden. Um einen guten Wert zu identifizieren, gehen Sie über das Modul und zeigen Sie das Ausgabebild an. Erhöhen Sie den Wert schrittweise, bis nur noch Zellen mit deutlich sichtbaren Brucella am Zellkern erhalten bleiben.

Nachdem Sie in den Modulen 16 und 17 gemäß dem Textprotokoll nach Zellen mit Bakterien im perinukleären und Voronoi-Zellkörper gefiltert haben, verlassen Sie den Testmodus und deaktivieren Sie alle Augensymbole neben den Modulen, um sicherzustellen, dass keines der Module seine Anzeige anzeigt, bevor die vollständige Analyse ausgeführt wird. Drücken Sie abschließend auf Bilder analysieren, um die Analyse zu starten. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, überprüfen Sie die resultierenden PNG-Bilder sowie die CSV-Tabelle, um sicherzustellen, dass die Analyse auf der gesamten Platte zuverlässig funktioniert.

Führen Sie den Eintrittstest und das Infektionsscoring gemäß dem Textprotokoll durch. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel für eine Bildanalyse, die zur automatischen Identifizierung infizierter Zellen im Endpunkt-Assay verwendet wird. Es wurden Kerne von HeLa-Zellen identifiziert, die mit DAPI gefärbt wurden.

Ein Perikern von acht Pixeln Breite, der den Kern umgibt. Und es wurde ein Voronoi-Zellkörper durch Ausdehnung des Zellkerns um 25 Pixel berechnet. Eine Zelle galt als infiziert, wenn das Erregersignal in mindestens einem Kompartiment den entsprechenden Schwellenwert überschritt.

Brucella erfordert handelnde Umlagerungen, um die Wirtszellen erfolgreich zu aktivieren. Daher ist die Depletion von ARP23 eine geeignete Positivkontrolle für das siRNA-Screening. Die Depletion von ARPC3 reduzierte die Anzahl der Zellen mit proliferierenden Bakterien zwei Tage nach der Infektion.

Im Vergleich zu mit Rührei behandelten kontrollierten Zellen. Die automatisierte Bildanalyse führte quantifizierbar zu einer Abnahme der Infektion von ARPC3-depletierten HeLa-Zellen im Vergleich zu kontrollierten Zellen in dieser Grafik. Die Depletion von ARPC3 zeigte auch eine Verringerung der Brucella-Infektion im Entry-Assay im Vergleich zu kontrollierten Zellen.

Zu sehen an der reduzierten Anzahl intrazellulärer Brucella, die gelb dargestellt ist. Schließlich bestätigte die Quantifizierung der Infektion durch automatisierte Bildanalyse, dass die Anzahl der infizierten Zellen sowie die Anzahl der intrazellulären Bakterien in infizierten Zellen durch die Depletion von ARPC3 reduziert wurde. Sobald dieses Protokoll beherrscht ist, kann es innerhalb von eineinhalb Wochen nach Beginn des Experiments Bildanalyseergebnisse liefern.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Ergebnisse der Bildanalyse sorgfältig zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die ausgewählten Parameter auf der gesamten Platte gut funktionieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Bildgebung lebender Zellen, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten. Wie beim Handel interagiert ein bestimmter Wirtsfaktor mit Brucella.

Oder wie sich die Depletion eines Gens auf die intrazelluläre Dynamik der Infektion auswirkt. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Infektionsbiologie, um Wirtsfaktoren, die für eine Brucella-Infektion erforderlich sind, in einem HeLa-Zell-Assay zu erforschen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Wirtsfaktoren identifizieren können, die die erfolgreiche Besiedlung von HeLa-Zellen durch den intrazellulären Erreger Brucella abortus fördern oder verhindern.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Brucella abortus extrem gefährlich sein kann und die lokalen Biosicherheitsvorschriften strikt befolgt werden müssen.