Name: Mikroskopie-basierte Assays für die Hochdurchsatz-Screening von Host beteiligten Faktoren in Brucella Die Infektion von HeLa-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: Lernen Sie mikroskopiebasierte Hochdurchsatz-Screening-Assays zur Identifizierung von Wirtsfaktoren bei Brucella-Infektionen in HeLa-Zellen. Diese siRNA-basierte Methode ermöglicht effiziente Analysen.

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Diese Arbeit wurde durch die Fördermittel 51RT 0_126008 und 51RTP0_151029 für das Forschungs- und Technologieentwicklungsprojekt (FTE) InfectX bzw. TargetInfectX im Rahmen von SystemsX.ch, der Schweizerischen Initiative für Systembiologie, unterstützt. Wir nehmen die 310030B_149886 des Schweizerischen Nationalfonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung (SNF) zur Kenntnis. Die Arbeit von S.H.L und A.C. wurde durch das Internationale PhD-Programm "Fellowships for Excellence" des Biozentrums unterstützt. Simone Muntwiler ist für ihre technische Unterstützung bekannt. Wir danken Dirk Bumann für die Bereitstellung von pNF106 und Jean Celli für pJC43 und pJC44.

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</ol>

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Bakterielle Krankheitserreger haben zahlreiche Strategien entwickelt, um eukaryotische Wirtszellen zu ihrem Vorteil zu manipulieren. Erreger, die akute Infektionen verursachen, zeigen oft eine schnelle Vermehrung, die mit einer erheblichen Beunruhigung des Immunsystems und einem Verlust der Lebensfähigkeit infizierter Zellen einhergeht. Im Gegensatz dazu gelingt es Brucella und anderen Krankheitserregern, chronische Infektionen zu verursachen, langfristige Wechselwirkungen innerhalb der Wirtszellen aufzubauen. D...

Brucella Spezies gram-negative, fakultativ intrazelluläre Pathogene zur Klasse der α-Proteo gehören. Sie verursachen Abtreibungen und Unfruchtbarkeit in ihren natürlichen Wirten wie Rinder, Ziegen oder Schafe was zu schweren wirtschaftlichen Verlusten in Endemiegebieten. Brucellose ist eine der wichtigsten Zoonosen weltweit verursacht mehr als eine halbe Million neue Infektionen beim Menschen jährlich 1. Die Übertragung auf menschliche wird am häufigsten durch direkten Kontakt mit infizierten Tieren verursacht oder durch die Einnahme von kontaminierten Lebensmitteln wie nicht pasteurisierte Milch. Symptome der fieberhafte Erkrankung sind unspezifisch, was Schwierigkeiten bei der Diagnose von Brucellose verursacht. Wenn unbehandelt, können Patienten eine chronische Infektion mit schwereren Symptomen entwickeln , wie Arthritis, Endocarditis und Neuropathie 2. Auf zellulärer Ebene ist Brucella können phagozytische und nicht-Phagozyten und repliziert innerhalb eines intrazellulären einzufallenFach wie die Vakuole -haltigen Brucella bekannt (BCV). Internalisierung von Bakterien erfordert von Rac, Rho Aktinzytoskelett Umlagerungen und direkte Aktivierung von Cdc42 3. Innerhalb der eukaryotischen Wirtszelle, verkehre die BCV entlang der endocytischen und trotz der Interaktion mit Lysosomen, zu verwalten Bakterien Abbau 4 zu vermeiden. Ansäuern des BCV von der vesikulären ATPase erforderlich , um die Expression des bakteriellen Typ IV - Sekretionssystem (T4SS) 5 zu induzieren. Es wird angenommen , dass bakterielle Effektoren sekretiert durch die T4SS wesentlich sind für Brucella ihrer replikativen Nische zu etablieren, da Deletion des T4SS 6 oder Hemmung der vesikulären ATPase führen zu Fehlern in der Einrichtung der intrazellularen Nische 7. Bakterien während der Phase des Handels nicht, bis sie replizieren erreichen 8 ein ER-derived vacuolar Fach. Sobald die intrazelluläre Vermehrung auftritt, wird die BCV in cl gefundenose Assoziation mit ER Marker wie Calnexin und Glucose-6-Phosphatase - 6. Die molekularen Mechanismen , durch die Brucella Zellen eintritt, vermeidet lysosomalen Abbau und repliziert schließlich in einem ER-ähnlichen Fach bleiben weitgehend unbekannt. Wirtsfaktoren in verschiedenen Schritten der Infektion beteiligt sind vor allem durch gezielte Ansätze oder kleinem Maßstab small interfering RNA (siRNA) Bildschirm ausgeführt in Drosophila - Zellen 9 identifiziert worden. Diese haben Aufschluss über den Beitrag der einzelnen Wirtsfaktoren bei Brucella - Infektion , aber wir sind noch weit von einem umfassenden Verständnis des gesamten Prozesses. Hier Protokolle, die die Identifizierung der menschlichen Wirtsfaktoren unter Verwendung von großen RNA-Interferenz (RNAi) Screening in Verbindung mit automatisierten Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie und automatisierte Bildanalyse ermöglichen vorgestellt. Reverse siRNA-Transfektion von HeLa-Zellen durchgeführt wird als described früher 10,11 mit geringfügigen Modifikationen. Der Endpunkt - Assay deckt einen großen Teil des Brucella intrazellulären Lebenszyklus außer dem Austritt und die Infektion von benachbarten Zellen. Um die Treffer charakterisieren in den Endpunkt-Assay identifiziert, ein modifiziertes Protokoll Faktoren identifizieren, in frühen Schritte der Infektion beteiligt ist, verwendet. Ein Brucella abortus Stamm, der konstitutiv GFP exprimiert wird für den Endpunkt - Assay verwendet , in denen Bakterien erlaubt werden Zellen für zwei Tage zu infizieren. Während dieser Zeit geben Bakterienzellen, Verkehr auf die ER-abgeleiteten replikativen Nische, und in der peri-Kernraum replizieren. Die hohen GFP-Signal kann dann verwendet werden, um zuverlässig einzelner Zellen nachzuweisen, die replizierende Bakterien enthalten. Brucella Eintrag in einem Hochdurchsatz - Assay zu untersuchen, ist es wichtig , zwischen intra- und extrazellulären Bakterien zu unterscheiden zu können. Die hier vorgestellte Methode circumvents Differential-Antikörper-Färbung von intra- und extrazellulären Bakterien. Es basiert auf einem Brucella - Stamm zugrunde , ein Tetracyclin-induzierbaren GFP in Kombination mit konstitutiver Expression von dsRed auszudrücken. Das Vorhandensein eines konstitutiven dsRed Marker ermöglicht die Identifizierung aller Bakterien, die in der Probe vorhanden sind. GFP-Expression wird durch die Zugabe des nicht-toxischen Tetracyclin analog Anhydrotetracyclin (ATC) gleichzeitig mit der Inaktivierung von extrazellulären Bakterien durch Gentamicin (Gm) induziert. Während die Zelle undurchlässige Antibiotikum Gm extrazelluläre Bakterien tötet, kann AtC die Wirtszelle eindringen und die GFP-Expression selektiv in intrazellulären Bakterien induzieren. Dieser duale Reporter ermöglicht die robuste Trennung einzelner intrazelluläre Bakterien (GFP und dsRed Signal) von extrazellulären Bakterien (nur dsRed Signal) mit Weitfeldmikroskopie. Um nachweisbare GFP - Expression durch intrazelluläre Brucella zu erreichen haben wir festgestellt , dass 4 h Induktion durch atc führt zu einer ReliLage Signal. Ähnliche Induktionsschemata selektiv GFP in intrazellulären Bakterien exprimieren verwendet wurde zuvor intrazelluläre Shigella 12 zu studieren.

<table><tbody><tr><td>Tryptische Soja-Agar (TSA)</td><td>BD</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>Tryptische Sojabrühe (TSB)</td><td>Fluka</td><td>22092</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycinsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Magermilch</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml Flasche mit Schraubverschluss</td><td>Corning</td><td>8396</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Kälberserum (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Hitzeinaktiviertes</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,5%)</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>10x Stammlösung, verdünnt 1:10 in PBS</td></tr><tr><td>Scepte 2.0 Zellzähler</td><td>Merck Milipore</td><td>PHCC20060</td><td>Alternative Zellzählgeräte können verwendet werden</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 384-Well-Platte</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2062</td><td></td></tr><tr><td>Schälbare Aluminiumfolie</td><td>Costar</td><td>6570</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzienspender: "Multidrop 384 Reagenzienspender"</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840150</td><td>Es kann ein alternativer Reagenzienspender verwendet werden.</td></tr><tr><td>Transfektionsreagenz: "Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>Automatisierter Plattenwascher: "Plattenwascher ELx50-16"</td><td>BioTek</td><td>ELX5016</td><td>Dieser Plattenwascher enthält einen 16-Kanal-Verteiler, der für 384-Well-Platten geeignet ist. Es passt in eine Biosicherheitswerkbank und hat einen Deckel, der die Platte während des Waschens abdeckt, wodurch das Risiko der Aerosolproduktion verringert wird. Alternative Unterlegscheiben mit ähnlichen Eigenschaften könnten verwendet werden.</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Anhydrotetracyclinhydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td>100 &#956; g/ml Lösung in 100% Ethanol wird bei -20 &° gehalten; C lichtgeschützt in Aluminium-Folie</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Lösen in 0,2 M HEPES Puffer, pH 7,4. Bei -20 Grad lagern; C und am Tag vor Gebrauch frisch auftauen. Achtung, PFA ist giftig beim Einatmen, bei Berührung mit der Haut und beim Verschlucken.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>Scrambled siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10</td><td></td></tr><tr><td>Kif11 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003317-00</td><td></td></tr><tr><td>ARPC3 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-005284-00</td><td></td></tr><tr><td>Brucella abortus 2308</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pJC43 (apHT::GFP)</td><td></td><td></td><td>Celli et al.12</td></tr><tr><td>pAC042.08 (apht::d sRed, tetO::tetR-GFP)</td><td></td><td></td><td>Aufbau: pJC44 4 wurde mit EcoRI verdaut, gefolgt von der Erzeugung stumpfer Enden mit dem Klenov-Enzym und dem anschließenden Verdau mit SalI. TetR-GFP wurde aus pNF106 mit den Primern prAC090 und prAC092 amplifiziert. Nach dem Aufschluss mit SalI wurde das TetR-GFP-Produkt an den verdauten pJC44-Vektor ligiert.</td></tr><tr><td>Primer prAC090</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC</td></tr><tr><td>Primer prAC092</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT TC</td></tr><tr><td>HeLa CCL-2</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro</td><td>Molecular Devices&nbsp;</td><td>IXM IMAGING MSCOPE</td><td>Automatisiertes zelluläres Bildgebungsmikroskop, ausgestattet mit einem präzisionsmotorisierten Z-Tisch. Alternative Systeme für die automatisierte Mikroskopie und alternative Komponenten für Hard- und Software, die unten aufgeführt sind, können eingesetzt werden.</td></tr><tr><td>Molekulare Hochgeschwindigkeits-Laser-Autofokus-Geräte</td><td>&nbsp;</td><td>1-2300-1037</td><td></td></tr><tr><td>CFI Super Fluor 10X Objektiv</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>MRF00100</td><td>N.A 0,50, B.D 1,20 mm, DIC Prisma: 10X, Federbelastet</td></tr><tr><td>Photometrie CoolSNAP HQ Monochrome CCD-Kamera</td><td>Molekulare Bauelemente&nbsp;</td><td>1-2300-1060</td><td>1.392 x 1.040 Bildpixel, 6,45 x 6,45 und Mikro; Mio. Pixel, 12 Bit Digitalisierung</td></tr><tr><td>MetaXpress Software</td><td>Molekulare Bauelemente&nbsp;</td><td>9500-0100</td><td></td></tr><tr><td>LUI-Spectra-X-7</td><td>Lumencor</td><td>SPECTRA X V-XXX-YZ</td><td>Light Engine. Folgende Lichtquellen kommen zum Einsatz: violett (DAPI), cyan (GFP), grün/gelb (RFP)</td></tr><tr><td>Single Band Exciter für DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF01-377/50-25</td><td></td></tr><tr><td>Single Band Emitter für DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF02-447/60-25</td><td></td></tr><tr><td>Single Band Dichroic für DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF409-DI03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Single Band Exciter für GFP</td><td>Semrock</td><td>FF02-472/30-25</td><td></td></tr><tr><td>Single Band Emitter für GFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-520/35-25</td><td></td></tr><tr><td>Single Band Dichroic für GFP</td><td>Semrock</td><td>FF495-DI03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Single Band Exciter für RFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-562/40-25</td><td></td></tr><tr><td>Single Band Emitter für RFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-624/40-25</td><td></td></tr><tr><td>Single Band Dichroic für RFP</td><td>Semrock</td><td>FF593-DI03-25x36</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroskopie-basierte assays für die hochdurchsatz-screening von host beteiligten faktoren in<em&gt; brucella</em&gt; die infektion von hela-zellen

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella - Arten sind fakultativ intrazelluläre Erreger, die Tiere als ihre natürlichen Wirte infizieren. Übertragung auf den Menschen wird am häufigsten durch direkten Kontakt mit infizierten Tieren verursacht oder durch die Einnahme von kontaminierten Lebensmitteln und kann zu schweren chronischen Infektionen führen. Brucella können professionelle und nicht-professionelle Phagozyten eindringen und repliziert innerhalb endoplasmatischen Retikulum (ER) abgeleitetes Vakuolen. Die Wirtsfaktoren für Brucella Eintritt in Wirtszellen, die Vermeidung von lysosomalen Abbau erforderlich ist , und die Replikation in der ER-ähnlichen Fach bleiben weitgehend unbekannt. Hier beschreiben wir zwei Assays Wirtsfaktoren beteiligt in Brucella Eintrag und Replikation in HeLa - Zellen zu identifizieren. Die Protokolle beschreiben die Verwendung von RNA-Interferenz, während alternative Screening-Verfahren angewendet werden könnten. Die Assays basieren auf der Detektion von fluoreszenzmarkierten Bakterien in fluoreszenzmarkierte Wirtszellen unter Verwendung automatisierterWeitfeldmikroskopie. Die Fluoreszenzbilder werden analysiert, um eine standardisierte Bildanalyse-Pipeline in CellProfiler verwendet, die einzelnen zellbasierten Infektion Scoring ermöglicht. Im Endpunkt-Assay wird die intrazelluläre Replikation zwei Tage nach der Infektion gemessen. Auf diese Weise können Bakterien Besucher auf ihre replikativen Nische , wo die Proliferation um 12 Stunden nach der bakteriellen Eintritt initiiert wird. Brucella , die erfolgreich eine intrazelluläre Nische etabliert haben so stark innerhalb von Wirtszellen vermehrt haben wird. Da intrazelluläre Bakterien stark einzelne extrazelluläre oder intrazelluläre nicht-replikativen Bakterien überwiegen werden, die konstitutiv ein Stamm GFP exprimieren, können verwendet werden. Das starke GFP-Signal wird dann verwendet, infizierte Zellen zu identifizieren. Im Gegensatz dazu ist für den Eintrag Test ist es wichtig, zwischen intra- und extrazellulären Bakterien zu unterscheiden. Hier wird ein Stamm, kodierend für ein Tetracyclin-induzierbarer GFP verwendet. Induktionvon Gentamicin von GFP bei gleichzeitiger Inaktivierung von extrazellulären Bakterien ermöglicht die Unterscheidung zwischen intra- und extrazellulären auf dem GFP-Signal basierend Bakterien, mit nur intrazelluläre Bakterien in der Lage zu sein GFP zu exprimieren. Dies ermöglicht die robuste Detektion einzelner intrazellulären Bakterien, bevor die intrazelluläre Vermehrung initiiert wird.

1A zeigt ein Beispiel für die Bildanalyse verwendet , um automatisch infizierten Zellen in dem Endpunkt - Assay zu identifizieren. Kerne von HeLa-Zellen mit DAPI gefärbt wurden identifiziert, eine peri-Kern von 8 Pixeln Breite den Kern umgibt, und ein Voronoi Zellkörper durch Erweiterung des Kerns von 25 Pixeln berechnet. Da vor allem in der peri-Kernraum proliferieren Bakterien, ist die GFP Intensität in diesem Bereich der Zelle die stabilste Messung zwischen infizierte...

Zwei Assays für mikroskopiebasiertes Hochdurchsatz-Screening von Wirtsfaktoren, die an der Brucella-Infektion beteiligt sind, werden beschrieben. Der Entry-Assay weist Wirtsfaktoren nach, die für den Brucella-Eintritt erforderlich sind, und der Endpunkt-Assay diejenigen, die für die intrazelluläre Replikation erforderlich sind. Das siRNA-Screening in HeLa-Zellen ist zwar für alternative Ansätze anwendbar, wird aber zur Veranschaulichung der Protokolle verwendet.

Mikroskopie-basierte Assays für die Hochdurchsatz-Screening von Host beteiligten Faktoren in<em&gt; Brucella</em&gt; Die Infektion von HeLa-Zellen

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Das übergeordnete Ziel dieses hochdurchsatzfähigen, mikroskopiebasierten Assays besteht darin, Wirtsfaktoren zu identifizieren, die an der Brucella-Infektion von HeLa-Zellen beteiligt sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Wirt-Pathogen-Interaktion zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung von Wirtsproteinen, die die Kolonisierung durch den intrazellulären Erreger Brucella entweder fördern oder verhindern. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass der halbautomatisierte Workflow vom Probeneingang bis zur Bildanalyse die Nutzung von Robotern ermöglicht und somit effiziente Hochdurchsatz-Experimente erlaubt.Daher kann diese Methode Einblicke in die Wechselwirkungen von Brucella mit dem Wirt mithilfe von siRNA-Screens liefern. Der größte Teil des Protokolls kann auf andere Screening-Strategien angewendet werden, zum Beispiel auf siRNA-Bibliotheken.Nachdem HeLa-Zellen kultiviert und Screening-Platten mit siRNAs gemäß dem Textprotokoll vorbereitet wurden, eine schwarze 384-Well-Platte durch Zentrifugation bei 300 ×g und Raumtemperatur für 20 Minuten auftauen. Transfektionsmedium herstellen, indem DMEM ohne FCS bei Raumtemperatur verwendet wird. Den Transfektionsreagenz im Verhältnis 1 zu 200 verdünnen und vor der Verwendung vorsichtig mischen.Mit einem Reagenzien-Dispenser 25 Mikroliter Transfektionsmedium in jede Vertiefung der 384er-Platte geben und die Lösungen durch Hin- und Herbewegen der Platte mischen. Die Platte eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, um die Bildung der siRNA-Transfektionsreagenz-Komplexe zu ermöglichen. In der Zwischenzeit HeLa-Zellen vorbereiten, indem das Kulturmedium abgesaugt und 2,5 Milliliter 0,05 %iger Trypsin-EDTA in PBS zum Waschen der subkonfluenten Zellen aus einem 75 Quadratzentimeter-Fläschchen verwendet werden.Fügen Sie dann 1,5 Milliliter frisches Trypsin hinzu und stellen Sie den Kolben für zwei bis drei Minuten auf 37 Grad Celsius, bis sich die Zellen abgerundet haben. Verwenden Sie 10 Milliliter vorgewärmtes DMEM mit 60 % FCS, um die Zellen erneut in Suspension zu bringen. Anschließend zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzähler, bevor Sie eine Zellsuspension mit 10.000 Zellen pro Milliliter in DMEM mit 16 % FCS herstellen.Fügen Sie 50 µL Zellsuspension zu jedem Loch des Transreagenz hinzu. Dies ergibt 500 Zellen pro Loch. Bewegen Sie die Platte vor und zurück, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.Anschießend die Platte fünf bis zehn Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen, damit sich die Zellen absetzen können. Die Platte mit Parafilm verschließen und 72 Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator auf einer vorgewärmten Aluminiumplatte bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubieren.Die Arbeit mit dem Pathogen der Risikoklasse drei B.abortus ist gefährlich, und es müssen die lokalen Biosicherheitsvorschriften eingehalten werden, die das Tragen eines Schutzanzugs, von Schutzhandschuhen, einer Maske und einer Schutzbrille umfassen. Einen Tag vor der Infektion wird die zuvor bestimmte Menge der B.abortus-Starterkultur in 50 Milliliter TSB-KM-Medium in einer 250-Milliliter-Schraubflasche angeimpft.Verschließen Sie die Flasche mit Parafilm und kultivieren Sie die Bakterien über Nacht bei 37 Grad Celsius und 100 U/min in einem Schüttelinkubator, bis eine optische Dichte bei 600 nm im Bereich von 0,8 bis 1,1 erreicht ist. Messen Sie die optische Dichte bei 600 nm der Bakterienkultur. Bereiten Sie anschließend das Infektionsmedium vor, indem Sie die Bakterienkultur in DMEM mit 10 % FCS verdünnen, um die gewünschte Multiplizität der Infektion zu erreichen.Oder MOI. Mit einem automatisierten Plattenwascher das Transfektionsmedium durch 50&nbsp;Mikroliter Infektionsmedium ersetzen. Die Platte im Sicherheitswerkbank in den Zentrifugenkorb überführen und die 384-Loch-Platte bei 400&nbsp;×&nbsp;g und 4&nbsp;°C 20&nbsp;Minuten lang zentrifugieren.Verwenden Sie anschließend Parafilm, um die Platte abzudichten, und inkubieren Sie sie vier Stunden lang auf einer vorgewärmten Aluminiumplatte bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen mithilfe des automatisierten Plattenwäschers mit DMEM, das 10 % FCS und 100 Mikrogramm pro Milliliter Dentrimysen oder GM enthält, um extrazelluläre Bakterien zu inaktivieren. Dichten Sie die Platte danach erneut mit Parafilm ab und stellen Sie sie für weitere 40 Stunden auf die vorgewärmte Aluminiumplatte im Inkubator, um den Endpunkt-Assay durchzuführen.Um die Zellen zu fixieren, waschen Sie zunächst die Vertiefungen mit PBS. Anschließend ersetzen Sie das PBS durch 50 Mikroliter 3,7 % PFA in 2 bei pH 7,4.Die Zellen anschließend 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation das Fixiermedium durch 50 Mikroliter PBS ersetzen. Um die Proben mit dem automatisierten Plattenwascher zu färben, zunächst 50 Mikroliter 1 % Triton X-100 in PBS für 10 Minuten verwenden, um die Zellen zu permeabilisieren.Nachdem die Zellen dreimal mit PBS gewaschen wurden, 50 Mikroliter PBS mit einem Mikrogramm pro Milliliter DAPI hinzufügen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend die Zellen dreimal mit PBS waschen und vor Licht schützen. Die Platte auf das automatisierte Mikroskop übertragen.Stellen Sie die Mikroskop-Parameter ein. Wählen Sie das 10-fache Objektiv. Wählen Sie dann das Plattenformat, das der 384-Loch-Platte entspricht.Neun Stellen pro Vertiefung aufnehmen. Aktivieren Sie die laserbasierte Fokussierung. Und fokussieren Sie auf den Boden der Platte und der Vertiefung.Danach als erstes erfasstes Feld als Ausgangsfeld für die Probenfindung und alle Positionen für die Positions-Autofokusfunktion festlegen. Anschließend für den DAPI-Kanal den Z-Offset manuell zur Fokussierung einstellen. Danach Proben finden drücken, um den Fokus auf den Boden des Wells einzustellen.Verwenden Sie die Automatische Belichtungssteuerung (AutoExposure-Funktion), um eine gute Schätzung für die Belichtungszeit zu erhalten. Korrigieren Sie die Belichtungszeit für den DAPI-Kanal manuell, um einen großen Dynamikbereich mit geringer Überbelichtung sicherzustellen. Verwenden Sie diese Belichtungszeit, um mehrere Stellen über die gesamte Platte hinweg abzubilden.Und passen Sie die Belichtungszeit manuell an, bis die hellsten Pixel etwa 80 % der maximalen Helligkeit über den Positionen erreichen. Wiederholen Sie die Schritte zur Einstellung von Fokus und Belichtungszeit entsprechend für alle anderen Kanäle. Starten Sie anschließend die Aufnahme der gesamten Platte.Verwenden Sie für den Endpunkt-Assay die DAPI- und GFP-Kanäle, um die gesamte Platte abzubilden. Um eine Bildanalyse an gefärbten Zellen im Endpunkt-Assay durchzuführen, wählen Sie nach Erstellung eines Schattierungsmodells gemäß der Textanleitung unter „View output settings“ den Eingabeordner mit den Bildern und einen Ausgabeordner für die Ergebnisse aus. Definieren Sie anschließend den Text, den die Bilder gemeinsam haben, und laden Sie die Schattierungsmodelle.Klicken Sie auf „Testmodus starten“ und stellen Sie sicher, dass die Pausen- und Anzeigeeinstellungen für alle Module deaktiviert sind. Aktivieren Sie die Pausen- und Anzeigeeinstellung für Modul neun ImageMath. Das aktivierte Pausensymbol erscheint gelb.Die aktivierte Anzeigefunktion erscheint als offenes Auge. Klicken Sie anschließend auf „Ausführen“, um die Analyse bis zum Modul neun durchzuführen. Passen Sie im Modul neun den Parameter „zweites Bild multiplizieren mit“ auf einen Wert an, der das DAPI-Signal in Brucella unterdrückt, ohne die Kerne zu beeinträchtigen.Um die Werte für das Modul zu testen, klicken Sie auf „Schritt“. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das neu geöffnete Bild und stellen Sie den Bildkontrast auf logarithmisch normalisiert ein. Gehen Sie wiederholt zurück zum Modul neun.Passt den Parameter an, mit dem das zweite Bild multipliziert wird, und durchläuft das Modul erneut, bis das Brucella-Signal vollständig unterdrückt ist, während gleichzeitig schwarze Bereiche, die eine Überkompensation anzeigen, minimiert werden. Die Suche nach geeigneten Parametern für bestimmte Module erfordert eine schrittweise Optimierung der Parameter. Es ist auf jeden Fall wichtig, die Module mehrfach zu durchlaufen, verschiedene Werte auszuprobieren und die Auswirkungen auf das angezeigte Ergebnis zu beobachten.Aktivieren Sie Pause und Anzeige für Modul 10. Identifizieren Sie die primären Objekte. Stellen Sie die untere Grenze des Schwellenwerts so hoch ein, dass Kerne segmentiert werden und der Hintergrund ignoriert wird.Um einen geeigneten Schwellenwert zu finden, bewegen Sie den Mauszeiger über das Modul und klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf das Eingabebild, um das Histogramm anzuzeigen, dessen Peak typischerweise den Hintergrund anzeigt. Erhöhen Sie ausgehend von der Hintergrundintensität den Parameter, bis eine gute Segmentierung der Zellkerne erreicht ist, wie im Ausgabebild dargestellt. Das Ziel der Bildanalyse-Pipeline besteht darin, Zellen zu identifizieren, die replizierende Bakterien enthalten.Dies wird durch die Festlegung unterschiedlicher Schwellenwerte für das Pathogen-Signal im Kern, im perinukleären Bereich und im Voronoi-Zellkörper erreicht. Pausieren und Anzeigen für Modul 15 aktivieren. Objekte filtern, wie zuvor gezeigt, und Ausführen drücken.Stellen Sie den Parameter-Mindestwert ausreichend hoch ein, sodass nur Zellen mit deutlich sichtbaren Brucella im Kern beibehalten werden und alle anderen herausgefiltert werden. Um einen geeigneten Wert zu finden, schalten Sie das Modul durch und zeigen Sie das Ausgabebild an. Erhöhen Sie den Wert schrittweise, bis nur noch Zellen mit deutlich sichtbaren Brucella am Kern übrig bleiben.Nach der Filterung von Zellen mit Bakterien im perinukleären Bereich und dem Voronoi-Zellkörper in den Modulen 16 und 17 gemäß dem Textprotokoll verlassen Sie den Testmodus und deaktivieren Sie alle Augensymbole neben den Modulen, um sicherzustellen, dass vor dem Start der vollständigen Analyse keines der Module seine Anzeige zeigt. Drücken Sie abschließend auf „Analyse starten“, um die Analyse zu beginnen. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, überprüfen Sie die resultierenden PNG-Bilder sowie die CSV-Tabelle, um sicherzustellen, dass die Analyse zuverlässig über die gesamte Platte hinweg funktioniert hat.Führen Sie den Eintritts-Assay und die Infektionsbewertung gemäß dem Textprotokoll durch. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel einer Bildanalyse, die verwendet wurde, um infizierte Zellen im Endpunkt-Assay automatisch zu identifizieren. Die Kerne von HeLa-Zellen, die mit DAPI gefärbt wurden, wurden identifiziert.Ein perinukleärer Bereich von acht Pixeln Breite, der den Zellkern umgibt, sowie ein durch 25 Pixel erweiteter Voronoi-Zellkörper wurden berechnet. Eine Zelle galt als infiziert, wenn das Pathogen-Signal in mindestens einem Kompartiment den entsprechenden Schwellenwert überschritt.Brucella benötigt Aktin-Neuanordnungen für eine erfolgreiche Bindung an Wirtszellen. Daher ist die Depletion von ARP23 eine geeignete positive Kontrolle für die siRNA-Screening. Die Depletion von ARPC3 verringerte die Anzahl der Zellen mit proliferierenden Bakterien zwei Tage nach der Infektion.Im Vergleich zu kontrollierten, mit Scrambled-Behandlung behandelten Zellen. Die automatisierte Bildanalyse zeigte in diesem Diagramm eine quantifizierbare Abnahme der Infektion in ARPC3-depletierten HeLa-Zellen im Vergleich zu kontrollierten Zellen. Die Ausschöpfung von ARPC3 zeigte ebenfalls eine Verringerung der Brucella-Infektion im Eintritts-Assay im Vergleich zu kontrollierten Zellen.Wie an der verringerten Anzahl intrazellulärer Brucella, dargestellt in Gelb, zu erkennen ist. Schließlich bestätigte die Quantifizierung der Infektion mittels automatisierter Bildanalyse, dass sowohl die Anzahl infizierter Zellen als auch die Anzahl intrazellulärer Bakterien in infizierten Zellen durch den Verlust von ARPC3 reduziert war. Wenn man den Protokollablauf einmal beherrscht, können innerhalb von eineinhalb Wochen nach Versuchsbeginn Ergebnisse der Bildanalyse vorliegen.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Ergebnisse der Bildanalyse sorgfältig zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die gewählten Parameter über die gesamte Platte hinweg gut funktionieren. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Live-Cell-Bildgebung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise, wann ein bestimmter Wirtsfaktor mit Brucella interagiert.Oder wie die Abschaltung eines Gens die intrazellulären Dynamiken einer Infektion beeinflusst. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern im Bereich der Infektionsbiologie den Weg, Wirtsfaktoren zu untersuchen, die für die Brucella-Infektion in einem HeLa-Zell-Assay erforderlich sind. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Wirtsfaktoren identifiziert, die die erfolgreiche Besiedlung von HeLa-Zellen durch den intrazellulären Erreger Brucella abortus fördern oder verhindern.Beachten Sie, dass die Arbeit mit Brucella abortus äußerst gefährlich sein kann und die lokalen Biosicherheitsvorschriften strikt eingehalten werden müssen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Casanova, A., et al. Mikroskopiebasierte Assays für Hochdurchsatz-Screening von Wirtsfaktoren, die an der Brucella-Infektion von Hela-Zellen beteiligt sind. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video demonstriert Hochdurchsatzbildgebung einer Brucella-Abortus-Infektion in Epithelzellen mit siRNA-vermittelter STING-Knockdown, um die Rolle der zytosolischen DNA-Erkennung bei der intrazellulären bakteriellen Replikation und der angeborenen Immunantwort des Wirts zu untersuchen.

Hochdurchsatzbildgebung der intrazellulären Brucella-Abortus-Infektion in den Epithelzellen des Wirts

Wir beschreiben ein Verfahren zum Verfolgen der endomembrane Bruch hervorgerufen durch die intrazelluläre...

Single Cell Messungen Vacuolar Rupture durch intrazelluläre Erreger verursacht

Diese Technik stellt ein Verfahren zu ernten, normalisieren und zu quantifizieren intrazellulären Wachstum bakterieller Pathogene, die in natürlichen Protozoon-Wirtszellen vorkultiviert vor Infektionen von Säugerzellen. Dieses Verfahren kann modifiziert werden, um eine große Vielzahl von Wirtszellen für das Priming Bühne sowie Zielzelltypen unterzubringen.

Gefügig Mammalian Cell Infektionen mit Protozoen-grundiert Bakterien

Wir beschreiben eine korrelative Mikroskopie-Methode, die High-Speed-3D-Live-cell Fluoreszenzlichtmikroskopie und hochauflösenden Kryo-Elektronen-Tomographie vereint. Wir demonstrieren die Fähigkeit des korrelativen Verfahren durch Abbilden dynamisch kleine HIV-1-Partikeln Interaktion mit dem Host-HeLa-Zellen.

Korrelative Mikroskopie für 3D-Strukturanalyse von dynamischen Wechselwirkungen

Hier beschreiben wir einen phänotypischen Assay, der auf die High-Throughput/High-Content-Screens von klein-interferierender synthetischer RNA (siRNA), chemischer Verbindung und Mycobacterium tuberculosis mutierte Bibliotheken anwendbar ist. Diese Methode beruht auf dem Nachweis von fluoreszierend gekennzeichneter Mycobacterium tuberculosis in fluoreszierend markierten Wirtszellen mittels automatisierter konfokaler Mikroskopie.

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Coxiella burnetii ist ein obligat intrazelluläre Gram-negative Bakterium für die Zoonose Q-Fieber verantwortlich. Hier beschreiben wir Verfahren zur Erzeugung von Coxiella Fluoreszenz Transposon-Mutanten als auch die automatisierte Identifizierung und Analyse der resultierenden Internalisierung, Replikation und zytotoxische Phänotypen.

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

Es wurde ein Echtzeit-Assay mit hohem Durchsatz entwickelt, um gleichzeitig (1) eukaryotische zellpenetrierende antimikrobielle Wirkstoffe zu identifizieren, die auf einen intrazellulären bakteriellen Krankheitserreger abzielen, und (2) die Zytotoxizität eukaryotischer Zellen zu bewerten. Eine Variation der gleichen Technologie wurde anschließend mit digitaler Dosiertechnologie kombiniert, um einfache, hochauflösende Dosis-Wirkungs-Studien sowie zwei- und dreidimensionale Synergiestudien zu...

Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität

Wir präsentieren in der aktuellen Studie eine neuartige fluoreszenzbasierten Assays von einer transgenen Maus abgeleiteten Lymphozyten. Dieser Assay ist für Hochdurchsatz-Screening (HTS) von kleinen Molekülen dotiert mit einer Kapazität von entweder Hemmung oder Förderung der Lymphozytenaktivierung geeignet.

Ein Fluoreszenz-basierte Lymphocyte Assay geeignet für Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen

Wir haben eine Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zum Sondieren der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf bakterielle Infektion von adhärenten Zellen entwickelt. Dieser Assay ist kompatibel mit Durchflusszytometrie, Immunostaining und Traktion Rasterkraftmikroskopie, zulassend quantitative Messungen der biomechanischen Wechselwirkungen zwischen Zellen, extrazelluläre Matrix und Pathogene Bakterien.

Ein Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zur Untersuchung der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf die bakterielle Infektion von adhärenten Zellen

In dieser Studie wurde ein Assay für das Hochdurchsatz-Screening gegen Mycobacterium abscessus mit einem kürzlich entwickelten Doppelreporterstamm entwickelt, der Fluoreszenz und Lumineszenz verwendet, um die Lebensfähigkeit von Bakterien schnell zu beurteilen. Dieses Protokoll wird für Forscher relevant sein, die neue Medikamente gegen diese arzneimittelresistenten Bakterien untersuchen wollen.

Assay-Entwicklung für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening gegen Mykobakterien

Lernen Sie mikroskopiebasierte Hochdurchsatz-Screening-Assays zur Identifizierung von Wirtsfaktoren bei Brucella-Infektionen in HeLa-Zellen. Diese siRNA-basierte Methode ermöglicht effiziente Analysen.

Mikroskopie-basierte Assays für die Hochdurchsatz-Screening von Host beteiligten Faktoren in Brucella Die Infektion von HeLa-Zellen (Video) | JoVE Journal

Mikroskopie-basierte Assays für die Hochdurchsatz-Screening von Host beteiligten Faktoren in

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