Protokoll für die direkte Umwandlung von murinen embryonalen Fibroblasten in Trophoblast Stammzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, bonafide induzierte Trophoblasten-Stammzellen oder iTSCs aus murinen Fibroblasten zu erzeugen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Stammzellen zu beantworten, die sich auf die Art der Barriere beziehen, die die embryonale von der extraembryonalen Linie trennt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die transgene Expression nur vorübergehend aktiviert wird, was die Selektion stabil umgewandelter Zellen erleichtert.

Decken Sie in einem Labor der Biosicherheitsstufe zwei mit der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung fünf 100-Milliliter-Schalen mit fünf Millilitern Poly-L-Lysin-Lösung ab und schütteln Sie die Platten vorsichtig, um die Beschichtungslösung gleichmäßig zu verteilen. Stellen Sie das Geschirr für 30 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, aspirieren Sie dann das Poly-L-Lysin und spülen Sie das Geschirr einmal mit PBS aus. Als nächstes sieben mal 10 bis sechste 293 T-Zellen pro Schale in 10 Milliliter 293 T-Zellmedium geben, die Schalen schwenken, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, und die Schalen wieder in den Inkubator stellen.

Ersetzen Sie am nächsten Morgen das Wachstumsmedium durch fünf Milliliter Transfektionsmedium. Behandeln Sie dann die Kulturen mit sechs Mikrolitern einer 1000-fachen Brühe Chloroquinlösung und legen Sie die Platten wieder bei 37 Grad Celsius in den Inkubator. Um die Transfektionsmischung herzustellen, geben Sie für jeden lentiviralen Vektor 600 Mikroliter Lentivector DNA-Lösung tropfenweise in 600 Mikroliter 2X HEPES-gepufferte Kochsalzlösung während des Vortexens und inkubieren Sie die Transfektionsmischung bei Raumtemperatur.

Nach 15 Minuten die Mischung vorsichtig tropfenweise in die vorbereiteten 293 T-Zellen geben und die Schalen wieder in den Inkubator geben. Ersetzen Sie nach fünf bis sechs Stunden das Medium durch 10 Milliliter Virusproduktionsmedium und stellen Sie die Platten wieder in den Inkubator. Ersetzen Sie das Medium am nächsten Morgen vorsichtig durch sieben Milliliter frisches Virusproduktionsmedium für eine weitere Inkubation über Nacht.

Übertragen Sie dann das Medium von jeder Platte in einzelne konische 15-Milliliter-Röhrchen und geben Sie sieben Milliliter frisches Virusproduktionsmedium auf die Platten für eine weitere Inkubation über Nacht. Am nächsten Morgen wird die zweite Charge des virushaltigen Mediums geerntet, der Überstand mit der ersten Charge des Virus gepoolt und das virushaltige Medium durch einen 0,45-Mikron-tensidfreien Celluloseacetat-Membranfilter zur Lagerung in 500 Mikrolitern Aliquots bei minus 800 abgeseiht. Um die Fibroblasten in induzierte Trophoblasten-Stammzellen umzuwandeln, waschen Sie die transduzierten embryonalen Massenfibroblasten oder MEFs zweimal mit zwei Millilitern PBS.

Dann lösen Sie die Zellen mit 0,5 Millilitern Trypsin-EDTA-Lösung bei 37 Grad Celsius. Bestätigen Sie nach drei bis vier Minuten unter einem inversen Mikroskop, dass sich die Zellen von der Platte abgehoben haben, und aktivieren Sie dann das Trypsin mit einem Milliliter TS-Medium. Die Zellsuspensionen werden in einzelne konische 15-Milliliter-Röhrchen überführt und die Zellen zentrifugiert.

Suspendieren Sie dann die Pellets erneut in zwei Millilitern TS-Medium und plädieren Sie zweimal 10 auf den fünften Vier-Faktor-mCherry oder kontrollieren Sie nicht transduzierte MEFs pro 100-Milliliter-Schale in 10 Millilitern TS-Medium, das den Fibroblasten-Wachstumsfaktor vier und Heparin enthält, ergänzt mit Doxycyclin für die Übernachtkultur. Am nächsten Tag wird unter einem Epifluoreszenzmikroskop die mCherry-Proteinexpression verwendet, um die Transduktionseffizienz abzuschätzen. Wenn die Transduktionseffizienz etwa 100 % beträgt, geben Sie die Kulturen wieder in den Inkubator zurück und wechseln Sie das Medium in allen Schalen jeden zweiten Tag bis zum 10. Tag.

Füttern Sie die Zellen danach mit frischem TS-Medium, das den Fibroblasten-Wachstumsfaktor vier und Heparin ohne Doxycyclin enthält, unter Verwendung des inversen Mikroskops, um das Erscheinungsbild der transdifferenzierten Bereiche auf der Vier-Faktoren-Schale bis zu drei Wochen lang zu überwachen. Die Identifizierung der transdifferenzierten Bereiche ist von entscheidender Bedeutung, da MEFs zu diesem Zeitpunkt morphologisch nicht den Trophoblasten-Stammzellen ähneln. Halten Sie Ausschau nach dicht gestapelten Kolonien in der Nähe der Trophoblast-Riesenzellen, die an ihrer Zellgröße und ihrem großen Zellkern erkennbar sind.

Um einzelne iTSC-Linien zu isolieren, wischen Sie zuerst das inverse Mikroskop mit 70 % Ethanol ab, um die Wahrscheinlichkeit einer bakteriellen Kontamination zu minimieren. Geben Sie als Nächstes 40 Mikroliter 05%Trypsin EDTA in 12 Vertiefungen einer 96 U Bodenplatte und legen Sie die Platte auf Eis. Aspirieren Sie nun das Medium aus der MEF-Transdifferenzierungsschale der vier Faktoren und waschen Sie die Zellen einmal mit 10 Millilitern PBS.

Geben Sie nach dem Waschen 10 Milliliter frisches PBS zu den Zellen und stellen Sie die Platte auf den inversen Mikroskoptisch. Mit einer 100-Mikroliter-Pipette auf 40 Mikroliter wird jede einzelne Kolonie mit der Pipettenspitze umkreist und die entstandene schwimmende Kolonie abgesaugt. Übertragen Sie jedes Volk in einzelne Vertiefungen der 96-Well-Platte, bis 12 Völker entnommen wurden.

Dann inkubieren Sie die Bienenvölker fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation dissoziieren Sie die Zellen durch Pipettieren und überführen Sie die Zellsuspensionen in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte, die 500 Mikroliter vollständiges TS plus Fibroblasten-Wachstumsfaktor und Heparinmedium für die Übernachtkultur enthält. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium durch frisches vollständiges TS plus Fibroblasten-Wachstumsfaktor und Heparinmedium, um die abgestorbenen Zellen zu entfernen und die Platte wieder in den Inkubator zu stellen.

Tägliche Überwachung der Kulturen auf das Auftreten von Epithelkolonien mit hellen Grenzen. Wenn die Kolonien beobachtet werden, kultivieren Sie die Zellen bis zu einer Woche lang oder bis sie zu 70 % zusammenfließen. In Kulturen, in denen die Transgenexpression der vier Faktoren aktiviert ist, verändern die Zellen schnell ihre Morphologie.

Um die Tage 14 bis 21 entstehen deutliche transdifferenzierte Bereiche. Diesen Primärkolonien fehlt die typische Morphologie der Trophoblastenstammzellen, aber sobald sie subkultiviert werden, wird eine charakteristische Epithelmorphologie mit engen Rändern und hellen Rändern beobachtet, die stark an echte Trophoblastenstammzellen erinnert. Wenn die durch die vier Faktoren induzierten Trophoblasten-Stammzellen positiv für den Trophoblast-Transkriptionsfaktor, Cdx2 und Tfap2c bleiben, kann die Idee dieser Linien für nachfolgende In-vitro- oder In-Vivo-Analysen verwendet werden.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in sechs Wochen abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die blast-assistierte Injektion durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zum Chimärisierungspotenzial der erzeugten iTSCs zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet oder in der frühen Linientrennung, um die Umwandlung des embryonalen und des extraembryonalen Zellschicksals bei Mäusen zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man neue embryonale Fibroblasten direkt in induzierte Trophoblasten-Stammzellen umwandelt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit lentiviralen Vektoren äußerst gefährlich sein kann und dass Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung geeigneter Arbeitsverfahren der Biosicherheitsstufe zwei immer befolgt werden sollten.