Name: In - vitro - Permeation von FITC-geladen Ferritine Über eine Ratte Blut-Hirn - Schranke: ein Modell für die Lieferung von Nanoformulated Moleküle zu studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Erfahren Sie die In-vitro-Permeation von FITC-geladenen Ferritin-Nanokäfigen über die Blut-Hirn-Schranke. Diese Methode demonstriert die Fähigkeit von Nanoformulierungen, die Permeation kapselter Moleküle zu verbessern.

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Die Autoren danken dem Assessorato alla Sanità, der Regione Lombardia und dem Sacco Hospital (NanoMeDia Project) für die Forschungsfinanzierung.

1. Festlegung der BBB-Modell Hinweis: Für die BHS-Modell schaffen wir schlagen vor, im Handel erhältliche primäre RBMECs und RCAs verwenden. Alle Schritte müssen mit sterilen Reagenzien und Disposables durchgeführt werden, in einer Laminarströmungsabzug behandelt. <ol><li> Zellkultur <ol><li> Coat Zellkulturflaschen mit Poly-L-lysin 100 ug / ml (1 h bei RT) oder Fibronektin 50 ug / ml (1 h bei 37 ° C) die Anlagerung von RCAs oder RBMECs zu fördern, respectively. Dann thaw 1 x 10 6 RCAs und 5 x 10 5 RBMECs in Endothelzell-Medium, ergänzt mit 5% fötalem Rinderserum, 1% endothelialen Zellwachstumsergänzungsmittel und 1% Penicillin / Streptomycin (SECM). Seed RCAs in einem T175-Kolben in 20 ml SECM und RBMECs in einem T75-Kolben in 10 ml SECM. Hinweis: Das Auftauen und Aussäen Passagen RCAs und RBMECs müssen angepasst werden, in Bezug auf die Zelldichte und der Zeit in Kultur, entsprechend der Anzahl der Versuchsbedingungen mit der BBB-Modell getestet werden. Mit dem Starting mit 1 Flasche mit 1 x 10 6 RCAs und 1 Flasche mit 5 x 10 5 RBMECs ist es möglich , bis 20 BBB-Lagerschalen erhalten werden. </li><li> Pflegen der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 in einer befeuchteten Atmosphäre für etwa 6 Tage, bis etwa 80% Konfluenz für RCAs und über 90% Konfluenz für RBMECs. Abzulösen Zellen unter Verwendung von Trypsin-EDTA-Lösung (Trypsin 1: 250) für 5 min (1 ml Trypsin für T75-Kolben und 2 ml für T175-Kolben). Stop Trypsin-Aktivität mit SECM (2: 1) Zentrifugenzellsuspensionen bei 750 × g für 5 Minuten und Resuspendieren der Pellets in 60 ml SECM. </li><li> Teilen Sie die RBMECs in 3 T175-Flaschen und Kultur in SECM für weitere 3 Tage, bevor sie auf Einsätze Aussaat. Zählen Sie die Gesamtzahl der RCAs leben, durch eine Zellsuspension beobachtet 1: 1 verdünnt mit Trypanblau unter einem optischen Mikroskop in einer Burker Kammer. </li></ol></li><li> Zellaussaat auf Einsätze <ol><li> Behandlung einer Seite der Polyethylen-Terephthalat (PET) -Membran von 6 Multi-Well transpaent Einsätze mit Poly-L-lysin 100 ug / ml und die andere Seite mit Fibronectin 50 ug / ml, Anhaftung von RCAs und BMECs zu ermöglichen. Behandeln Sie die Einsätze mit einer Pinzette, um den Kontakt mit der PET-Membran zu vermeiden. <ol><li> Legen Sie die Einsätze in einer 6-Well-Platte und fügen Fibronektin-Lösung (mindestens 500 &amp; mgr; l) in die obere Kammer. Nach 1 Stunde Inkubation bei 37 ° C, entfernen Sie die Fibronektin - Lösung, nehmen die Einsätze aus dem Multi-Well - Platte und legte sie den Kopf auf den Boden einer 150 cm 2 Petrischale, die hier als sterile Unterstützung für die verwendet wird , bereits Einsätze beschichtet. </li><li> Hinzufügen sanft 800 ul Poly-L-Lysin auf die Unterseite des Einsatzes (wie in 1A gezeigt, als RCAs seeding bezeichnet) und Halten der Lösung auf den Einsätzen für 1 h bei RT. </li><li> Absaugen die Lösung und lassen Sie die Einsätze für 15-30 min bei RT trocknen. Die Einsätze sind nun bereit für die Zellaussaat, kann aber auch für mehrere in der Multi-Well-Platte gespeichert werdenTage bei 4 ° C, bevor sie mit dem BBB Konstruktion fortfahren. Hinweis: Denken Sie daran, mindestens 3 beschichteten Einsätze frei von Zellen zu halten, als Kontrollen verwendet werden, um BBB-Einrichtung von FD40 Flussmessungen zu validieren. </li></ol></li><li> Seed RCAs (35.000 / cm 2) auf die Unterseite der Poly-L-Lysin-beschichtete Einsätze, durch Eintropfen 800 &amp; mgr; l der Zellsuspension auf den Kopf Einsatz (1A). Verlassen das RCA-Suspension auf die Einsätze 4 h bei RT, um eine effiziente Bindung der Zellen an die Membran zu ermöglichen. </li><li> Saugen Sie das restliche Lösung, legen Sie die Einsätze in Vertiefungen , die 2 ml SECM und halten die Multi-Well - Platte bei 37 ° C und 5% CO 2 in einer feuchten Atmosphäre, die SECM alle 2 Tage zu ändern. </li><li> Nach 3 Tagen, wenn die RCAs haben die untere Fläche des Einsatzes, Samen RBMECs auf die obere Seite des Einsatzes, diesen Schritten folgt beschichtet: <ol><li> Nehmen Sie RBMECs aus T175-Flaschen und zählen dieInsgesamt lebenden Zellen, wie 1.1.2 und 1.1.3 in den Schritten berichtet. </li><li> Seed RBMECs (60.000 / cm 2) auf die obere Oberfläche des Einsatzes in SECM (1000 &amp; mgr; l) (1B), so dass 3 - Einsätze mit den Astrozyten nur als TEER Hintergrund verwendet werden. Legen Sie die Multi-Well-Platte in Standardkulturbedingungen. Pflegen Sie das System zur Kultur für mindestens 3 Tage, alle 2 Tage, um die SECM in der inneren und der unteren Kammer zu verändern. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. BBB Validation <ol><li> TEER Mess <ol><li> Am 3. Tag der Co-Kultur, die TEER überprüfen , indem Sie die BBB-Lagerschalen in eine geeignete Kammer eingefügt (das hat eine Kappe und wo beide Kammer und Kappe enthalten ein Paar spannungs Erfassungs- und Stromelektroden), gefüllt mit 4 ml SECM. Eine Verbindung mit einem Epithelgewebe Volt / Ohmmeter. </li><li> Zusammen mit den TEER-Messungen der Zell BBB-Systeme, die TEER-Werte der drei Einsätze notieren Sie die RCAs Lager that wird von den Werten der BBBs erhaltenen abgezogen werden. Multiplizieren die resultierenden TEER - Werte durch die Oberfläche des Einsatzes (4.2 cm 2), um die Ergebnisse als 2 Ω x cm auszudrücken. </li><li> Vom 3. Tag der Co-Kultur, jeden Tag die TEER messen. Anmerkung: Nach einer anfänglichen Periode , wo der TEER zunimmt, sollten die aufgezeichneten Werte für mindestens zwei aufeinanderfolgende Tage ( in der Regel zwischen dem 5. und 7. Tag Kokultur) stabil bleiben. An diesem Punkt ist die BBB bereit für den zweiten Schritt der Validierung (Abschnitt 2.2) und / oder für die trans BBB Experimente. Hinweis: Die Vorgehensweise in Abschnitt 2.1 kann auf die folgenden Permeabilität Experimente (Abschnitt 3) gewidmet auf den gleichen BBB-Systeme durchgeführt werden. Betreiben Sie unter sterilen Bedingungen. </li></ol></li><li> Trans-BBB Flux von FITC-Dextran 40 (FD40) <ol><li> Messen Sie den FD40 Fluss von der oberen in die untere Kammer der BBB-Modelle im Vergleich zu über 3 leere Einsätze(Siehe Hinweis in Abschnitt 1.2.1) nach den folgenden Schritten: <ol><li> 1 mg / ml FD40 (verdünnt in SECM) in die obere Kammer des BBBs, und nach 1, 2 und 3 Stunden zurückziehen 200 ul SECM aus der unteren Kammer und messen die Fluoreszenzintensität durch Spektralfluorimeters (λ ex 488 nm, λ em 515 nm, Schlitz 5). </li><li> Besorgen Sie sich die Werte für die SECM Hintergrund fluorescenceby 500 ul virgin Medium Messung der gleichen analytischen Parametern. Ziehen Sie die SECM Hintergrundfluoreszenz von allen FD40 Fluoreszenzwerte. </li><li> Bestimmung der Menge des durch FD40 durch Vergleich der beobachteten Fluoreszenzwerte mit einer Eichkurve mit bekannten Konzentrationen hergestellt (d. 0,312, 0,625, 1,25, 2,5 ug / ml) des fluoreszierenden Tracers in 500 ul SECM gelöst. </li><li> Berechnen der scheinbaren Permeabilitätskoeffizienten (P app) aus den Mittelflusswerte gemäß: P app = J / AC <br/&gt; Wobei J der Fluss des Moleküls (mol / sec) ist, A die Permeationsfläche (cm 2) und C die Konzentration des Moleküls in der oberen Kammer (Mol / cm 3) ist. Hinweis: Drei oder mehr BBB-Systeme, die geeignete TEER-Werte erreicht haben, müssen gewidmet werden ausschließlich zu diesem Validierungsverfahren und sollten nicht für die folgenden Permeabilität Experimente (Abschnitt 3) eingesetzt werden. Sterility ist nicht zwingend. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Trans BBB Permeation von FITC-geladen Ferritine (FNN) Hinweis: Eine rekombinante Variante von humanem Ferritin (Fn), hergestellt in Escherichia coli und montiert in Nanokäfige (FNn) zur Verkapselung von verschiedenen fluoreszierenden Molekülen, aus dem NanoBioLab von Prof. Prosperi (Universität Mailand-Bicocca, Italien) erhältlich ist. Fnn mit FITC geladen, entsprechend einem zuvor beschriebenen Protokoll 13 und den Konzentrationen sowohl von Fn und die geladenen Moleküle genau determined. <ol><li> Trans-BBB Flux von FITC und FITC-FNN <ol><li> Messen Sie die FITC-fnn Fluss von der oberen zur unteren Kammer validierter BBB Modelle (üblicherweise am 5. - 7. Tag der Co-Kultur), im Vergleich zu dem des freien Farbstoffes nach 7 und 24 Stunden der Inkubation gemäß die folgenden Schritte: <ol><li> In FITC-FNN (50 ug / ml FNN, 1,1 uM FITC) oder eine gleiche Menge an freiem FITC in die obere Kammer von mindestens 6 BBB-Systeme für jede Formulierung, um 2 ml SECM Lösung aus der unteren Kammer zurückzuziehen von mindestens 3 Einsätze nach 7 h, und von der unteren Kammer von anderen 3 Einsätze nach 24 Stunden. </li><li> Messen der Fluoreszenzintensität von 500 &amp; mgr; l der gesammelten Proben durch Spektrofluorimeter (λ ex 488 nm, λ em 515 nm, Schlitz 5). </li><li> Beziehen Sie die SECM-Hintergrundfluoreszenz von 500 ul Medium Messung der gleichen analytischen Parametern. Ziehen Sie die SECM Hintergrundfluoreszenzvon allen FITC oder FITC-FNN Fluoreszenzwerte. </li><li> Bestimmung der Konzentration des permeierten FITC oder FITC-fnn durch die erhaltenen Fluoreszenzwerte mit zwei verschiedenen Kalibrierungskurven erzeugt mit bekannten Konzentrationen zu vergleichen (d. 6,87, 13,75, 27,5, 55 nM) des freien oder nanoformulated Farbstoff in 500 ul SECM gelöst. </li></ol></li></ol></li><li> FITC-FNN Lokalisierung in RBMECs <ol><li> Entfernen SECM aus der oberen Kammer der BBB-Systeme, waschen Sie die Einsätze mit PBS und fixieren die RBMECs auf mindestens zwei Einsätze für jede Versuchsgruppe durch Zugabe von 500 ul Paraformaldehyd (4% in Phosphatpuffer Saline-PBS) in der oberen Kammer 10 min bei RT. </li><li> Waschen Sie die Einsätze dreimal mit PBS Restparaformaldehyd zu entfernen. Anmerkung: Von diesem Punkt an die Sterilität nicht notwendig ist. </li><li> Schneiden Sie geeignete Stücke der PET-Membran, und fahren Sie mit der immunodecoration der Zellen gemäß den folgenden Schritten: <ol><li> Permeabilize RBMECs mit 0,1% Triton X-100 in PBS für 10 Minuten. Durchführen eines Blockierungsschritt für 1 h bei RT mit einer Lösung, die 2% Rinderserumalbumin (BSA), 2% Ziegenserum in PBS. Inkubieren der Proben mit einem anti-von Willebrand Faktor (VWF) bei einer Verdünnung von 1:20, für 2 h bei RT. </li><li> Nach dreimaligem Waschen mit PBS, setzen die Zellen für 2 h bei RT zu einer 2% BSA, 2% Ziegenserum-Lösung mit einer geeigneten sekundären Antikörper bei einer 1 enthält: 300 Verdünnung, um zu offenbaren, die anti-VWR und DAPI bei a 1: 1500 Verdünnung für Kerne Erkennung. </li></ol></li><li> Montieren Sie die Einsatzstücke auf Objektträger unter Verwendung einer verblassungshemmenden Montagelösung (ein Tropfen pro Insert-Fragment), dann schließen Sie die Probe mit einem Deckglas. Analysieren durch konfokale Mikroskopie eine Öltauchlinse bei 40-facher Vergrößerung unter Verwendung von 1,5-Zoom und 1.024 x 1.024 Pixel Auflösung. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die in vitro hier beschriebene Verfahren stellt einen nützlichen Ansatz validierten die trans-BBB Lieferung von fluoreszierenden Molekülen auf Nanoformulierung mit Nanopartikeln zu studieren. Hier verwenden wir FNN, die einen guten Kandidaten stellt die Verlagerung von Fracht-Moleküle über die BBB zu studieren. Fnn ist das Gold nanovector für trans-BBB Lieferung von Arzneimittel / Mittel angesehen, da sie spezifisch durch die TfR1 Rezeptor erkannt wird, die auf der luminalen Membran BMECs exprimiert und vermitt...

Der Widerstand des Zentralnervensystems (ZNS) Erkrankungen (dh. Krebs, Epilepsie, Depression, Schizophrenie und HIV-assoziierte neurologische Störung) auf pharmakologische Therapien aufgrund der verschiedenen Mechanismen, einschließlich beschwerliche Arzneimittelpermeation über die Blut-Hirn - Schranke (BBB) . Die BBB ist die Grenze, die Gehirngewebe von den Substanzen isoliert im Blut zirkulieren. Innerhalb dieser Barriere eine Schicht aus Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen (BMECs), von Perizyten und Astrozyten Endfüßen unterstützt wird , ist verantwortlich für die hohe Selektivität der BBB zu diesen wasserlöslichen Arzneimittel mit einem Molekulargewicht von mehr als 400 Da 1. Eine andere drogenbedingten Widerstandsmechanismus ist mit dem Vorhandensein auf BMECs von Arzneimitteltransportern Efflux (P-Glykoprotein und multidrug resistance Proteine) verbunden, die zusammenwirken , um Arzneimittelpenetration in das ZNS zu reduzieren und erleichtern deren Extrusion aus dem Gehirn 2. Im letzten JahrzehntEine Vielzahl von nanotechnologische Ansätze entwickelt wurden , um die klinische und biologische Herausforderung der Bereitstellung von Arzneimitteln über die BBB 3-6 zu erfüllen. In diesem Zusammenhang stellen Ferritin-Nanokugeln (FNN) eine völlig innovative und vielversprechende Lösung. Fnn sind 12 nm Sphären 24 selbstorganisierende Ferritin (Fn) Monomeren, die in einer Hohlkugelstruktur von 8 nm Innendurchmesser angeordnet sind. Ferritin-Untereinheiten können, indem der pH-Wert auf Neutralität, so dass verschiedene organische Moleküle zu verkapselnden bei saurem pH und wieder zusammengebaut in einem Formgedächtnis-Mode demontiert werden. Daher stellen fnn ein interessantes Modell für die Entwicklung von multifunktionalen Wirkstoffabgabesysteme 7,8. Außerdem kann fnn mit BMECs dank der spezifischen Erkennung von Transferrin - Rezeptor (TfR) 1, zu interagieren , die auf der luminalen Membran dieser Zellen 9 exprimiert wird. Bisher verschiedenen in vitro - Modelle der BBB wurden in orde entwickeltr trans-BBB Permeabilität für verschiedene Arzneimittel, die Toxizität gegen die BBB, oder die Wechselwirkung von Molekülen mit Efflux-Transporter zu erläutern. Tatsächlich werden diese Modelle als in vitro gültigen Ansätze für ein schnelles Screening von aktiven Molekülen , bevor sie mit in - vivo - Studien fortfahren. Diese Modelle bestehen aus einer einzigen Endothelschicht BMECs oder co-kultiviert BMECs und Astrozyten (seltener pericytes), erhalten von Tier (Ratte, Maus, Schwein und Rind) oder menschlichen Zelllinien 10,11,12. Die transendotheliale Elektrischer Widerstand (TEER) und die scheinbare Permeabilität (P app) von Tracern mit definiertem Molekulargewicht sind zwei kritische Parameter, die die Qualität der in - vitro - Modell werden verwendet , zu bestimmen. Hier beschreiben wir die Verwendung eines BBB in - vitro - Modell, basierend auf einer Co-Kultur von Ratten - BMECs (RBMECs) und Ratten - kortikalen Astrozyten (RCAs) zur Untersuchung der trans-BBB Permeation von Ferritin - Nanokäfige Einkapseln Fluorescein isothiocyanate (FITC).

<table><tbody><tr><td>Mikrovaskuläre Endothelzellen des Rattengehirns</td><td>Innoprot</td><td>P10308</td><td>isoliert aus Hirngewebe der Sprague-Dawley-Ratte, kryokonserviert bei der ersten Passage und gelieferte</td></tr><tr><td>gefrorene kortikale Astrozyten&nbsp;</td><td>Innoprot</td><td>P10202</td><td>wurde aus 2 Tagen Hirngewebe von Ratten isoliert, bei der ersten Passage kryokonserviert und gefroren geliefert.</td></tr><tr><td>Endothelzellmedium Kit</td><td>Innoprot</td><td>P60104</td><td>ECM (500 ml) und fötales Bovin-Serum (25 ml), Nahrungsergänzungsmittel für das Wachstum von Endothelzellen (5 ml) und Penicillin/Streptomycin (5 ml). Warm bei 37 Grad; C Wasserbad vor Gebrauch und Schutz vor Licht</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA ohne Phenolrot</td><td>EuroClone</td><td>ECM0920D</td><td>Warm in 37 & Grad; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanat-dextran 40.000</td><td>Sigma</td><td>FD40S</td><td>schützen vor leichtem</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>Diluition in der chemischen Haube</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatpuffer Kochsalzlösung ohne Ca und Mg</td><td>EuroClone</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Serum für Ziegen&nbsp;</td><td>EuroClone</td><td>ECS0200D</td><td></td></tr><tr><td>monoklonaler Maus-Anti-Von-Willebrand-Faktor</td><td>Dako</td><td>M0616</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 546-konjugierter Antikörper gegen Maus-IgGs</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A-11003</td><td>schützt vor Licht</td></tr><tr><td>DAPI (4' ,6-Diamidino-2-phenylindole)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>D1306</td><td>schützt vor Licht</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Eindeckmittel</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin Hydrobromid</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td>die gleiche Lösung kann mehrmals verwendet werden</td></tr><tr><td>Fibronektin aus Rinderplasma&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td>die gleiche Lösung kann mehrmals verwendet werden</td></tr><tr><td>Polyethylenterephthalat (PET) setzt</td><td>Falcon</td><td>F3090</td><td>Transparente Membranen aus Polyethylenterephthalat (PET) ein; Oberfläche: 4,2 cm2; Porengröße 0,4 & Mikro; m/Oberfläche</td></tr><tr><td>T75 Primo TC Kolben</td><td>EuroClone</td><td>ET7076</td><td></td></tr><tr><td>T175 Primo TC Kolben</td><td>EuroClone</td><td>ET7181</td><td></td></tr><tr><td>EVOM2 Epithel Tissue Volt/Ohmmeter&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>World Precision Instruments Germany</td><td>EVOM2</td><td></td></tr><tr><td>Endohm- 24SNAP cup</td><td>World Precision Instruments Germany</td><td>ENDOHM-24SNAP</td><td></td></tr><tr><td>Licht-/Fluoreszenzmikroskop mit Kamera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM IL LED Fluo/ ICC50 W Kameramodul</td><td>&nbsp; Inverses Mikroskop für lebende Zellen mit Kamera&nbsp;</td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SPE</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofluorimeter</td><td>Jasco</td><td>FP-8000</td><td></td></tr></tbody></table>

in - vitro - permeation von fitc-geladen ferritine Über eine ratte blut-hirn - schranke: ein modell für die lieferung von nanoformulated moleküle zu studieren

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Mikrovaskuläre Endothelzellen des Gehirns, die von Perizyten und Astrozyten-Endfüßen unterstützt werden, sind verantwortlich für die geringe Permeation großer hydrolöslicher Medikamente durch die Blut-Hirn-Schranke (BHS), was zu Schwierigkeiten bei wirksamen pharmakologischen Therapien führt. In den letzten Jahren haben verschiedene Strategien zur Förderung des Gehirn-Targetings darauf abgezielt, die Wirkstoffabgabe und -aktivität an diesem Ort zu verbessern, einschließlich innovativer Nanosysteme für die Wirkstoffabgabe über die BHS. In diesem Zusammenhang bietet ein in vitro Ansatz, der auf einem vereinfachten zellulären Modell der BHS basiert, ein nützliches Werkzeug, um die Wirkung von Nanoformulierungen auf die trans-BHS-Permeation von Molekülen zu untersuchen. Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung einer Doppelschicht-BHS, bestehend aus co-kultivierten, kommerziell erhältlichen primären mikrovaskulären Endothelzellen des Rattenhirns, mikrovaskulären Endothelzellen und Astrozyten. Ein multiparametrischer Ansatz zur Validierung des Modells, der auf der Messung des transendothelialen elektrischen Widerstands und der scheinbaren Permeabilität eines hochmolekularen Dextrans basiert, wird ebenfalls beschrieben. Als Proof of Concept für den Einsatz dieses BHS-Modells zur Untersuchung der Wirkung verschiedener Nanoformulierungen auf die Translokation fluoreszierender Moleküle durch die Barriere beschreiben wir die Verwendung von Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), das in Ferritin-Nanopartikel geladen ist. Die Fähigkeit von Ferritinen, die trans-BHS-Permeation von FITC zu verbessern, wurde durch Flussmessungen und konfokale Mikroskopieanalysen nachgewiesen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass dies ein nützliches System zur Validierung von Nanosystemen für die Verabreichung von Medikamenten über die BHS ist.

Während der Einrichtung der BBB-Modell, die Zellanheftung und Wachstum auf der Einsätze können mit einem Lichtmikroskop durch die transparente Natur der PET-Membranen werden überwacht. RCAs, bei einer Dichte von 35.000 Zellen / cm 2, befestigen effizient an der Unterseite des Einsatzes nach 4 h Inkubation bei RT (2A) und wachsen , um die Membranoberfläche in 3 Tagen zu bedecken, eine spindelförmige Morphologie wobei (2B). RBMECs, bei einer Dic...

Eine Methode zur Etablierung eines in vitro Modells der Blut-Hirn-Schranke, die auf einer Co-Kultur von mikrovaskulären Endothelzellen und Astrozyten des Rattenhirns basiert, wird beschrieben und validiert. Dieses System erwies sich als ein valides Werkzeug, um die Wirkung der Nanoformulierung auf die Transbarriere-Permeation von fluoreszierenden Molekülen zu untersuchen.

In - vitro - Permeation von FITC-geladen Ferritine Über eine Ratte Blut-Hirn - Schranke: ein Modell für die Lieferung von Nanoformulated Moleküle zu studieren

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen validierten Ansatz zur Untersuchung der transzellulären Blut-Hirn-Schranke-Übertragung von nanoformulierten fluoreszierenden Molekülen mithilfe von Ferritin-Nanokäfigen, die mit FITC beladen sind, als Machbarkeitsnachweis zu beschreiben. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Resistenz zentralnervöser Erkrankungen gegenüber pharmakologischen Therapien aufgrund der geringen Durchgängigkeit von Arzneistoffen über die Blut-Hirn-Schranke zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der Möglichkeit, die Fähigkeit einer Nanoformulierung nachzuweisen, die transmembrane Permeation eingeschlossener Moleküle über die Blut-Hirn-Schranke in einem einzelnen BBB-Modell zu verbessern.Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie von Erkrankungen mit neurologischen Auswirkungen, da sie dazu neigt, die hohe Selektivität der Blut-Hirn-Schranke gegenüber den meisten Arzneimitteln zu überwinden. Diese Methode kann Einblicke in die Effizienz von Ferritin-Nanokäfigen als Drug-Delivery-System über die BBB hinaus liefern. Sie wurde bereits mit FITC angewandt, kann aber auch mit anderen Carrageenan-Mole

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Dieses Video beschreibt einen Permeabilitätsassay zur Bewertung der Permeabilität der in vitro Blut-Hirn-Schranke mit Natriumfluoresceinmolekülen.

Assay zur Nachahmbarkeit der Blut-Hirn-Schranke: Ein In-vitro-Assay zur Beurteilung der Durchlässigkeit von BHS-Nachahmung gegenüber Tracermolekülen

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Untersuchung der Permeation durch ein in vitro Blut-Hirn-Schranken-Modell (BHS) unter Verwendung von Astrozyten und Endothelzellen auf einem Membraneinsatz, mit freiem FITC und FITC-beladenem Ferritin. FITC-Ferritin band an Rezeptoren auf Endothelzellen und überquerte die Membranbarriere zur unteren Kammer, während freies FITC eine eingeschränkte Permeation zeigte und in der oberen Kammer verblieb.

Untersuchung der Permeation von FITC und FITC-Ferritin durch ein in vitro Blut-Hirn-Schrankenmodell

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Reproduzierbarkeit der einem in vitro-Modell mit BBB eine Ratte syngenen Co-Kultur von Endothelzellen und Astrozyten zu validieren. Die Endothel-Zellschicht vorgestellt hohen und niedrigen TEER LY Durchlässigkeit. Expression spezifischer TJ Proteinen wurden funktionellen Antworten zu Entzündungen und Funktionalität von Transportern und Rezeptoren untersucht.

Einrichten einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Ratte Blut-Hirn-Schranke (BBB): Ein Fokus auf BBB-Undurchlässigkeit und Rezeptor-vermittelten Transport

Ziel des Protokolls ist eine optimierte Verfahren für die Einrichtung eines in-vitro- Blut - Hirn-Schranke (BBB) Modells basierend auf primäre porcinen Gehirn endothelial Zellen (pBECs) zu präsentieren. Das Modell zeigt hohe Reproduzierbarkeit, hohe Dichtigkeit und eignet sich für Studien der Transport- und intrazellulären Menschenhandel in der Wirkstoffforschung.

Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

In dieser Studie stellen wir eine einfache und effiziente Verfahren zur Bewertung der Störung der Blut - Hirn-Schranke unter neurodegenerativen Erkrankungen. Um unser Ziel zu erreichen, wir infundiert hochmolekularen Fluorescein Herstellung gekennzeichnet (FITC)-Albumin in Maus Jugular Ader und die Leckage in der Anwesenheit von Fluoreszenz-Mikroskopie bewertet.

Beurteilung der Durchlässigkeit der Blut - Hirn-Schranke durch intravenöse Infusion von FITC-markierte Albumin in einem Mausmodell der Neurodegenerative Erkrankung

Hier präsentieren wir einen Maus Gehirn vaskulären Permeabilität Assay mit intraperitonealer Injektion von Fluoreszenz Tracer gefolgt von Perfusion, die auf Tiermodelle der Blut - Hirn-Schranke Dysfunktion anwendbar ist. Ein Hemi-Gehirn dient zur Durchlässigkeit quantitativ bewerten und die andere für die Tracer Visualisierung/Immunostaining. Der Eingriff dauert ca. 5-6 h für 10 Mäuse.

Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer

Drug targeting zu Tumoren des zentralen Nervensystems ist eine große Herausforderung. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um eine in-vitro-Mimik der Blut-Hirn-Tumor-Schranke mit murinen und/oder menschlichen Zellen zu produzieren und ihre Relevanz für die Vorhersagbarkeit des zentralen Nervensystems Tumor targeting in vivo zu diskutieren.

Vorhersage In Vivo Nutzlasten Lieferung mit einem Blut-Hirnschranke Tumor in einer Petrischale

Dieses Protokoll veranschaulicht einen In-vitro-Endothelzell-Transzytose-Assay als Modell zur Bewertung der Permeabilität der inneren blutretinalen Barriere durch Messung der Fähigkeit menschlicher retinaler mikrovaskulärer Endothelzellen, Meerrettichperoxidase über Zellen in caveolae-vermittelten transzellulären Transportprozessen zu transportieren.

Endothelzell-Transzytose-Assay als In-vitro-Modell zur Beurteilung der Permeabilität der inneren Blut-Retina-Barriere

In der vorliegenden Studie wird Fluorescein-Isothiocyanat-markiertes (FITC) Dextran Mäusen über eine orale Sonde verabreicht, um die Darmpermeabilität sowohl in vivo als auch in Plasma- und Kotproben zu bewerten. Da die Barrierefunktion des Darms bei vielen Krankheitsprozessen beeinträchtigt ist, kann dieser direkte und quantitative Assay in verschiedenen Forschungsbereichen eingesetzt werden.

Beurteilung der Integrität der Darmbarriere bei Mäusen unter Verwendung von Fluorescein-Isothiocyanat-markiertem Dextran

"E-DNA"-Sensoren, Reagenzienfreier haben elektrochemische Biosensoren, die gute Leistungen, auch wenn direkt in Blut und anderen komplexen Matrices in Frage gestellt, um den Nachweis einer Vielzahl von Nukleinsäure-, Protein-und Small Molecule Analyten angepasst. Hier präsentieren wir ein allgemeines Verfahren für die Herstellung und Verwendung solcher Sensoren.

Herstellung von elektrochemischen DNA Biosensoren für die Reagenzienfreier Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen

Erfahren Sie die In-vitro-Permeation von FITC-geladenen Ferritin-Nanokäfigen über die Blut-Hirn-Schranke. Diese Methode demonstriert die Fähigkeit von Nanoformulierungen, die Permeation kapselter Moleküle zu verbessern.

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In - vitro - Permeation von FITC-geladen Ferritine Über eine Ratte Blut-Hirn - Schranke: ein Modell für die Lieferung von Nanoformulated Moleküle zu studieren

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