Name: RNA-Interferenz-basierte Untersuchung der Funktion von Heat Shock Protein 27 während Hornhautepithels Wundheilung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Lernen Sie die RNA-Interferenz-basierte Untersuchung der HSP27-Funktion bei der Hornhautepithel-Wundheilung. Diese Methode ermöglicht gezielte Genexpression-Knockdowns für Zellbiologie-Forschung.

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Diese Studie wurde von der Studenten Research Grant (13-14) der University of Ulsan College of Medicine, Seoul, Korea und einen Zuschuss (2014-464) aus dem Asan-Institut für Life Sciences, Seoul, Korea unterstützt.

1. Zelllinie <ol><li> Kultur 10 6 Telomerase-immortalisierten humanen Cornea - Epithelzellen (hCEC) in einer 6-Well - Platte (Dichte: 1039,9 Zellen / mm 2) in einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2 -Atmosphäre unter Verwendung bronchiale Epithel - Wachstumsmedium (BEGM) bis sie erreichen 95% Konfluenz. </li></ol> 2. Western-Blot-Analyse nach Epithelial Scratch Wunden Erstellen <ol><li> Streak eine sterile 200 ul Pipettenspitze über die Oberfläche eines gut konfluierender kultiviert hCEC viermal pro Schale in einem biologischen Sicherheitsschrank (Klasse II, Typ A2) und Inkubation hCEC separat in einem 37 ° C Inkubator mit einer 5% igen CO 2 -Atmosphäre für 1, 5, 10, 30, 60 und 120 min. </li><li> Verwenden einer 6-Well-Platte für sechs verschiedene Proben nach der Inkubationszeit nach Hornhautepithels Verwundung. </li><li> Waschen Sie verwundete HCEC Monolayern dreimal mit 1x PBS und fügen Sie dann 2,0 ml BEGM in jede Vertiefung. </li><li> Nehmen Sie hCEC mit 2ml 0,25% Trypsin-(EDTA) pro Vertiefung für 5 Minuten, Zentrifuge bei 900 xg für 5 min in einem 15-ml-Röhrchen und absaugen Trypsin-EDTA unter Verwendung einer 1 ml Pipette. </li><li> Suspend hCEC mit 1 ml 1x PBS und übertragen sie in ein 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Zentrifuge hCEC bei 10.000 × g für 15 Sekunden und absaugen 1x PBS unter Verwendung einer 1 ml Pipette. </li><li> Resuspendieren hCEC in 100 &amp; mgr; l eiskaltem Lysepuffer (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM EDTA, 25 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4, 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid [PMSF], Proteaseinhibitoren [1 uM Pepstatin A, 1 uM Leupeptin und 0,1 uM Aprotinin] und 0,5% Triton X-100 [pH 7]) und sie gut mischen. </li><li> Inkubiere Zellen für 30 min auf Eis Zelllyse zu induzieren. </li><li> Centrifuge Lysate bei 4 ° C bei 10.000 × g für 15 Minuten, und dann Stände übertragen an die frische 1,5-ml-Röhrchen (90 &amp; mgr; l-Aliquots) und lagern Sie sie bei -80 ° C. </li><li> Bestimmen Gesamtproteinkonzentrationen von Zelllysaten des Bradford pr mitotein Test. 9 </li><li> Last 30 ug Gesamtzellproteine ​​in einen 10% oder 12% Acrylamid-Gel für Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und dann elektrophoretisch Übertragung getrennt Proteinbanden auf Nitrocellulosefilter mit einem 200 mA Strom für 1 h bei 4 ° C in Western-Blot-Assays verwendet werden. </li><li> Block Nitrocellulose-Filtermembranen mit 5% Magermilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBST) für 1 h, hinzufügen primären polyklonalen Kaninchen-Antikörper gegen nicht-phosphorylierten HSP27 (1: 1000 Verdünnung) oder primärem polyklonalem Kaninchen-Antikörper gegen phosphoryliertes HSP27 (1 : 1000 Verdünnung) in 5% Rinderserumalbumin (BSA) und die Membranen bei 4 ° C auf einem Schüttler über Nacht inkubiert. </li><li> Erkennen immunoreaktive Banden unter Verwendung von Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper (1: 10.000 Verdünnung) in 5% BSA nach dem Waschen für 10 min 3 mal mit TBST. </li><li> Inkubieren Sie die Membran in den Western-Blot Luminol Reagenzien (6-7 ml pro 10 cm × 5 cm-Membran) für 1 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie die Membran aus Reagenzlösung, entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem saugfähigen Tuch, und in eine Plastikfolie Schutz. </li><li> Die Arbeit in einem dunklen Raum mit einem sicheren Licht, legen bedeckt Membran in einer Filmkassette mit Proteinseite nach oben zeigt. </li><li> Platzieren Röntgenfilm auf der Membran und freizulegen, für 1 min. </li></ol> 3. siRNA Transfection Assay 10 <ol><li> Kultur hCEC bei 5 × 10 5 Zellen / Vertiefung in einer 6-Well - Platte in einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2 -Atmosphäre unter Verwendung BEGM , bis sie 95% Konfluenz erreichen. </li><li> Man verdünnt das Transfektionsreagenz (2,5 oder 7,5 ul) mit 100 &amp; mgr; l reduziert Serum-Medium für die Transfektion (der Verdünnungsfaktor betrug 41 oder 14.3) und lösen die HSP27-spezifische und verschlüsselten Kontroll-siRNA in 100 &amp; mgr; l reduziert Serum-Medium zu erstellen 10 oder 50 nM HSP27-spezifische und verschlüsselten Kontroll-siRNA. </li><li> Mischungs 100 μ; L siRNA-Lösung mit 100 &amp; mgr; l verdünnt Transfektionsreagenz (1: 1-Verhältnis) und die Mischung 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. </li><li> Fügen Sie die siRNA-Lipid-Komplexe zu den Zellen. Dann nach 4 h Änderungsmedien BEGM abzuschließen und die Zellen für 2 Tage bei 37 ° C inkubieren. </li><li> Analysieren transfizierten Zellen mittels Western Blot, wie sich aus den Abschnitten 4.1 bis 4.7 beschrieben. </li></ol> 4. Western Blot - Assay für 11 siRNA-transfizierten Zellen <ol><li> Extrahieren Sie HSP27-spezifische und verschlüsselten Kontroll - siRNA-transfizierten hCEC in einem biologischen Sicherheitsschrank mit 100 ul eiskaltem Lysepuffer (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 25 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4, 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), Proteaseinhibitoren, und 0,5% Triton X-100, pH 7). </li><li> Inkubiere Zellen für 30 min auf Eis Zelllyse zu induzieren. </li><li> Pellet-Lysate bei 10.000 × g für 15 min und dann Überstand auf frische 1,5 ml Wanne übertragenes (90 &amp; mgr; l-Aliquots) und lagern Sie sie bei -80 ° C. </li><li> Bestimmen Proteinkonzentrationen der Zelllysate des Bradford - Protein - Assay. 9 </li><li> Belastungsproben mit gleichen Mengen an Gesamtzellproteine ​​auf einem 10% bzw. 12% Acrylamidgel unterziehen um das Gel SDS-PAGE und elektrophoretisch übertragen die abgetrennten Proteinbanden auf Nitrocellulosefilter mit einem 200 mA Strom für 1 h bei 4 ° C zu verwenden Sie in Western-Blot-Assays. </li><li> Block Nitrocellulose-Filtermembranen mit 5% Magermilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBST) für 1 h, hinzufügen primären Antikörper gegen phosphorylierte und nicht-phosphorylierte HSP27 (1: 1000 Verdünnung), phosphoryliertes Akt (1: 1000 Verdünnung), nicht-phosphoryliertem Akt (1: 1000 Verdünnung, als Zellüberlebensmarker verwendet), Bcl-2-assoziierten X-Protein (1: 1000 Verdünnung, als pro-apoptotische Protein verwendet) und Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH; 1 : 200-Verdünnung, als Ladekontrolle) in 5% Rinderserumalbumin (BSA) verwendet, undbrüten die Membranen über Nacht bei 4 ° C auf einem Schüttler. </li><li> Erkennen immunoreaktive Banden unter Verwendung von Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper (1: 10.000 Verdünnung) in 5% BSA nach 3-maligem Waschen mit TBST, 10 min jede Waschung. </li><li> Inkubieren der Membran in den Western-Blotting Luminol Reagenzien (6-7 ml pro 10 cm × 5 cm-Membran) für 1 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie die Membran aus Reagenzlösung, entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem saugfähigen Tuch, und in eine Plastikfolie Schutz. </li><li> Die Arbeit in einem dunklen Raum mit einem sicheren Licht, legen Sie die bedeckte Membran in einer Filmkassette mit der Proteinseite nach oben zeigt. </li><li> Platzieren Röntgenfilm auf der Oberseite der Membran und freizulegen, für 1 min. </li></ol> 5. Scratch-induzierte Directional Verwundung Assay Bewertung der Zellmigration 12 <ol><li> In einem biologischen Sicherheitsschrank, eine Wunde, indem sie mit einer sterilen Pipettenspitze über die Oberfläche eines gut konfluenter Kulturen ziehen vonHSP27-spezifische siRNA-transfizierten oder verschlüsselt Kontroll-siRNA-transfizierten hCEC. </li><li> Unmittelbar nach der Verwundung, wasche die Zellen zweimal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und halten sie in BEGM Kulturen in einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2 -Atmosphäre für 24 Stunden nach der Verwundung. </li><li> Fotografieren Sie HCEC Bilder einen aufrechten Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung 24 Stunden nach der Verwundung und führen mit Hintergrund Abflachen der Filter verwenden Befehl in die Bildanalyse-Software. </li><li> Mit dem Befehl Auswählen Messungen definieren Sie die Area of ​​Interest (AOI) mit der gleichen Größe polygonale Form, die sich von Ende senkrecht abdecken kann der anfänglichen Wunde zu beenden, und zu bestimmen, drei verschiedene AOI im verletzten Bereich jeder Probe. </li><li> zählen automatisch die Zellzahl in jedem Feld die Count / Größe Measure Menü-Optionen. </li></ol> 6. Durchflusszytometrie Analyse von Apoptosis <ol><li> Kultur HSP27-spezifische siRNA-transfizierten und Kontroll siRNA-transfizierten hCEC jeweils 10 nM siRNA in einer Konzentration von 5 × 10 5 Zellen enthält / Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen bis die Zellen 95% Konfluenz in einer 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2 -Atmosphäre in BEGM erreichen. </li><li> Nehmen Sie hCEC mit 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA pro Vertiefung für 5 Minuten, Zentrifuge bei 900 xg für 5 min in einem 15-ml-Röhrchen und absaugen Trypsin-EDTA eine 1 ml Pipette. </li><li> Wasche die Zellen zweimal mit kaltem PBS und dann Resuspendieren der Zellen in 1x Bindungspuffer (0,1 M HEPES / NaOH [pH 7,4], 1,4 M NaCl, und 25 mM CaCl 2) bei einer Konzentration von 10 6 Zellen / ml. </li><li> Transfer von 100 &amp; mgr; l Zellsuspension (1 x 10 5 Zellen) in einen 5 ml - Kulturröhrchen. </li><li> In 5 ul Fluoresceinisothiocyanat-konjugierten Annexin V und 5 ul Propidiumiodid. </li><li> Die Zellen vorsichtig vortexen und für 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. </li><li> Mit 200 &amp; mgr; l 1x Bindungspuffer in jedes Röhrchen und zu analysieren, um die Zellen durch einen Strömungs cytometer innerhalb 1 Stunde. </li></ol>

<ol><li>Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Corneal epithelial wound healing.</a> Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).</li>
<li>Estil, S., Primo, E. J., Wilson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+shed+human+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in shed human corneal cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (11), 3360-3364 (2000).</li>
<li>Guay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+actin+filament+dynamics+by+p38+map+kinase-mediated+phosphorylation+of+heat+shock+protein+27%5BTitle%5D)+AND+%22J.+cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27.</a> J. cell. Sci. 110, Pt 3 357-368 (1997).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+heat+shock+protein+mRNAs+under+in+vivo+glutathione+depletion+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Differential expression of heat shock protein mRNAs under in vivo glutathione depletion in the mouse retina.</a> Neurosci. Lett. 413 (3), 260-264 (2007).</li>
<li>Rane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+controls+apoptosis+by+regulating+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 controls apoptosis by regulating Akt activation.</a> J. Biol. Chem. 278 (30), 27828-27835 (2003).</li>
<li>Shin, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+tumor+cell+migration+and+invasion+with+biphenyl+isoxazole+derivative+KRIBB3%2C+a+synthetic+molecule+that+inhibits+Hsp27+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Blocking tumor cell migration and invasion with biphenyl isoxazole derivative KRIBB3, a synthetic molecule that inhibits Hsp27 phosphorylation.</a> J. Biol. Chem. 280 (50), 41439-41448 (2005).</li>
<li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+phosphorylated+heat+shock+protein+27+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Expression of phosphorylated heat shock protein 27 during corneal epithelial wound healing.</a> Cornea. 31 (7), 820-827 (2012).</li>
<li>Alekseev, O. M., Richardson, R. T., Alekseev, O., O'Rand, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+profiles+in+HeLa+cells+in+response+to+overexpression+or+siRNA-mediated+depletion+of+NASP%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 45(2009).</li>
<li>Park, H. Y., Kim, J. H., Lee, K. M., Park, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+prostaglandin+analogues+on+tear+proteomics+and+expression+of+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+in+the+conjunctiva+and+corea%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of prostaglandin analogues on tear proteomics and expression of cytokines and matrix metalloproteinases in the conjunctiva and corea.</a> Exp. Eye. Res. 94 (1), 13-21 (2012).</li>
<li>Voegeli, T. S., Currie, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+knocks+down+Hsp27+and+increases+angiotensin+II-induced+phosphorylated+NF-kappaB+p65+levels+in+aortic+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Res%22%5BJournal%5D)">siRNA knocks down Hsp27 and increases angiotensin II-induced phosphorylated NF-kappaB p65 levels in aortic smooth muscle cells.</a> Inflamm. Res. 58 (6), 336-343 (2009).</li>
<li>Shi, B., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenite+pre-conditioning+reduces+UVB-induced+apoptosis+in+corneal+epithelial+cells+through+the+anti-apoptotic+activity+of+27+kDa+heat+shock+protein+%28HSP27%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arsenite pre-conditioning reduces UVB-induced apoptosis in corneal epithelial cells through the anti-apoptotic activity of 27 kDa heat shock protein (HSP27).</a> J. Cell. Physiol. 206 (2), 301-308 (2006).</li>
<li>Shen, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+corneal+epitheliotrophic+capacity+among+different+human+blood-derived+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Comparison of corneal epitheliotrophic capacity among different human blood-derived preparations.</a> Cornea. 30 (2), 208-214 (2011).</li>
<li>Song, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+phosphorylation+is+involved+in+epithelial+cell+apoptosis+as+well+as+epithelial+migration+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 phosphorylation is involved in epithelial cell apoptosis as well as epithelial migration during corneal epithelial wound healing.</a> Exp Eye Res. 118 (1), 36-41 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine finanziellen oder urheberrechtlich geschützten Interessen in Materialien oder in dieser Studie genannten Methoden.

In der vorliegenden Studie haben wir die potenzielle Rolle von HSP27 bei Hornhautepithelwunden mit Hilfe von in vitro Ansätzen untersucht. Die kritischen Schritte umfassten die siRNA-Transfektion für den HSP27-Knock-down, um die Funktion von HSP27 in Zellen zu beobachten, die Stress ausgesetzt waren. Insbesondere wurde durch diese Experimente eine Rolle von HSP27 bei der Migration von Epithelzellen und der Apoptose während der Wundheilung des Hornhautepithels aufgedeckt. Im Gegensatz zu früheren Studien10</...

Hornhautepithelzellen (LME) werden kontinuierlich in Tränenfilm vergossen, während sie von Zellen aus dem Limbus und Hornhautepithels basalen Schichten gleichzeitig ersetzt werden. 1 Verschiedene extrinsische Stressoren können die Apoptose und Schuppung der LME induzieren. 2 Die Hitzeschockproteine (HSP) hoch konserviert und können in zwei Familien nach Molekülgrße unterteilen. 3 die größte Familie HSP umfasst HSP90, HSP70 und HSP60, und die kleinere Familie umfasst HSP27. 4 ist die Phosphorylierung von HSP27 ist bekannt , eine wichtige Rolle in Zellüberleben zu spielen und ist für die Zellmigration erforderlich wegen der Rolle dieses Proteins in die Aktin - Umbildung. 5-7 Daher wir die mögliche Rolle von HSP27 - Phosphorylierung in CEC Migration und Apoptose in einem in vitro - Modell von epithelialen Wundheilung zu testen versucht. RNA-Interferenz (RNAi) entweder kleiner oder short interfering RNAs (siRNA) mit GEnerated Interesse sowohl in der Grundlagen- und angewandten Biologie, da sie möglicherweise die Expression jedes Gens von Interesse erlaubt zerlegten werden. 8 Hier haben wir HSP27-spezifische siRNA , den Beitrag von HSP27 CEC Wundheilung und Apoptose zu bewerten. Traditionelle RNAi Methoden für die Gen-knock-down in Zellen verwenden synthetische RNA-Duplexe, darunter zwei unmodifizierten 21-mer Oligonukleotide, die zusammengesetzt werden können siRNAs zu erstellen. Die RNAi siRNA, die wir in dieser vorliegenden Untersuchung verwendet wird, ist eine einfache und hocheffiziente Methode, um Zellen zu transfizieren, und dieses Reagens arbeitet mit verschiedenen immortalisierten Zelllinien. In der vorliegenden Studie zeigen wir die Methoden für diese Analyse verwendet, einschließlich eines Kratzers induzierten Richtungs Wunden-Assay, Western Blot, siRNA-Transfektion Assay, Immunfluoreszenztest und Durchflusszytometrie.

<table><tbody><tr><td>Biologische Sicherheitswerkbank</td><td>CHC LAB Co., Ltd,&nbsp; Daejeon, Republik Korea&nbsp;</td><td>CHC-777A2-06</td><td>Klasse II, Typ A2&nbsp;</td></tr><tr><td>Stealth RNA</td> Thermo <td>Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td></td><td>RNAi siRNA; verschlüsselte Kontroll-siRNA und HSP27-spezifische siRNA</td></tr><tr><td>BEGMTM</td><td>Lonza, Inc., Walkersville, MD</td><td>CC-3171, CC4175</td><td>Wachstumsmedium für Bronchialepithel&nbsp;</td></tr><tr><td>Protease-Hemmer&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO</td><td>P8340, P7626</td><td>1 &#956; M Pepstatin A, 1 &#956; M Leupeptin, 0,1 &#956; M Aprotinin</td></tr><tr><td>Bradford-Protein-Assay&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>#500-0001</td><td>Bradford-Protein-Assay&nbsp;</td></tr><tr><td>Nitrozellulose-Filter&nbsp;</td><td>Amersham, Little Chalfont, Großbritannien</td><td>RPN3032D</td><td>Western-Blotting-Membran</td></tr><tr><td>Nicht phosphoryliertes HSP27&nbsp;</td><td>Abcam Inc., Cambridge, MA</td><td>ab12351</td><td>1:1.000 Verdünnung (Gesamt-HSP27)</td></tr><tr><td>Phosphoryliertes HSP27 (Ser85)</td><td>Abcam Inc., Cambridge, MA</td><td>ab5594</td><td>1:1.000 Verdünnung HSP27 wurde an Ser85 phosphoryliert</td></tr><tr><td>. Lipofectamine&reg; RNAiMAX-Reagenz&nbsp;</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>13-778-075</td><td>Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>Phosphoryliertes Akt (Ser473)</td><td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td><td>Nr. 4060</td><td>1:1.000 Verdünnung Akt wurde an Ser473 (Zellüberlebensmarker) phosphoryliert.Nicht</td></tr> <tr><td>phosphoryliertes Akt&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td><td>Nr. 4061</td><td>1:1.000 Verdünnung (Total Akt)</td></tr><tr><td>Bcl-2-assoziiertes X-Protein&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td><td>Nr. 4062</td><td>1:1.000 (anti-apoptotischer Proteinmarker)</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td><td>Nr. 4063</td><td>1:1.000 Marker für die Beladungskontrolle (Haushaltsgen)</td></tr><tr><td>Meerrettichperoxidase-konjugierte Anti-Kaninchen-Antikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>NCI1460KR</td><td>1:10.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>31985</td><td>reduziertes Serummedium für die Transfektion</td></tr><tr><td>Bildanalysesoftware</td><td>Olympus, Inc., Tokio, Japan</td><td>Image-Pro Plus 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Magermilchpulver&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Deutschland</td><td>T145.2</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Amresco LCC, Inc. Solon, OH</td><td>Nr. 0497</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid&nbsp;</td><td>Amresco LCC, Inc. Solon, OH</td><td>No-0241</td><td></td></tr><tr><td>Sechs-Well-Kulturplatte</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>140675</td><td>35,00 mm Durchmesser / Well</td></tr><tr><td>24-Well-Kulturschale</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Orbitalschüttler</td><td>N-Bioteck, Inc., Seoul, Südkorea</td><td>NB1015</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Santa Cruz Biotechnologie, Santa Cruz, Kalifornien</td><td>sc-2323&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BDFACSCantoTM II</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td><td></td><td>Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Röntgenfilm</td><td>Kodak, Rochester, NY</td><td></td><td>Medizinische Röntgenkassette mit grünem 400 Bildschirm&nbsp;</td></tr><tr><td>Western Blotting Luminol Reagenz</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td><td>sc-2048&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V Apoptose-Detektionskit I</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td><td>556547</td><td></td></tr></tbody></table>

rna-interferenz-basierte untersuchung der funktion von heat shock protein 27 während hornhautepithels wundheilung

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Small interfering RNA (siRNA) gehört zu den am weitesten verbreiteten RNA-Interferenzmethoden für das kurzfristige Silencing von proteinkodierenden Genen. siRNA ist ein synthetischer RNA-Duplex, der entwickelt wurde, um spezifisch auf ein mRNA-Transkript abzuzielen, um dessen Abbau zu induzieren, und es wurde verwendet, um neue Wege in verschiedenen zellulären Prozessen zu identifizieren. Es gibt nur wenige Berichte über die Rolle des phosphorylierten Hitzeschockproteins 27 (HSP27) bei der Wundheilung im Hornhautepithel. Hierbei wurden kultivierte humane Hornhautepithelzellen in eine verschlüsselte Kontroll-siRNA-transfizierte Gruppe und eine HSP27-spezifische siRNA-transfizierte Gruppe unterteilt. Anschließend wurden Scratch-induzierte gerichtete Wundassays, Western Blot und Durchflusszytometrie durchgeführt. Wir schließen daraus, dass HSP27 eine Rolle bei der Heilung von Hornhautepithelwunden spielt, die die Apoptose und Migration von Epithelzellen beinhalten könnte. Hier werden Schritt-für-Schritt-Beschreibungen der Probenvorbereitung und des Studienprotokolls zur Verfügung gestellt.

Die Expression von phosphoryliertem HSP27 signifikant bei 5, 10 erhöht, und 30 min nach der Verwundung scratch Vergleich zu unverwundeten hCEC 13. Western - Blot - Analyse zeigte , dass die Expression von HSP27 phosphorylierten und phosphorylierten Akt waren beide signifikant reduziert, wohingegen die Expression von Bax signifikant in HSP27-spezifische siRNA-transfizierten hCEC (1A-E) erhöht wurde. Das phosphorylierte HSP27 - Expression wurde durch 30% und 40%...

Hierin präsentieren wir ein Protokoll zur Verwendung von Hitzeschockprotein 27 (HSP27)-spezifischer kleiner interferierender RNA, um die Funktion von HSP27 während der Wundheilung im Hornhautepithel zu beurteilen. RNA-Interferenz ist die beste Methode, um die Genexpression effektiv auszuschalten, um die Proteinfunktion in verschiedenen Zelltypen zu untersuchen.

RNA-Interferenz-basierte Untersuchung der Funktion von Heat Shock Protein 27 während Hornhautepithels Wundheilung

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

Das übergeordnete Ziel dieses RNA-Transfektionsassays besteht darin, mithilfe von HSP27-spezifischer small interfering RNA die mögliche Rolle von HSP27 bei der Wundheilung des Hornhautepithels zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen bezüglich der Funktion des Heat Shock Proteins 27 während des epithelialen Wundheilungsprozesses zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die small interfering RNA eine empfindliche RNA-Sukrose ist, die gezielt einen Boten-RNA-Transkript ansteuert, um dessen Abbau zu induzieren.Es wurde verwendet, um neuartige Schädlinge bei verschiedenen zellulären Prozessen zu identifizieren. Obwohl diese Technik Einblicke in die Wundheilung des kornealen Epithels ermöglichen kann, ist sie möglicherweise auch auf andere Systeme wie Haut und Schleimhaut anwendbar. Die Durchführung des Verfahrens wird Soon-Suk Kang, eine Technikerin aus meinem Labor, demonstrieren.Um dieses Verfahren zu beginnen, kultivieren Sie humane Hornhautepithelzellen in einer sechswelligen Platte mit Bronchialepithel-Wachstumsmedium bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid, bis sie eine Konfluenz von 95 Prozent erreichen. Verdünnen Sie anschließend 2,5 Mikroliter oder 7,5 Mikroliter des Transfektionsreagenzes mit 100 Mikrolitern serumarmem Medium für die Transfektion. Lösen Sie dann HSP27-spezifisches siRNA und scrambled Kontroll-siRNA jeweils in 100 Mikrolitern serumarmem Medium auf, um 10 Nanomolar HSP27-spezifisches siRNA bzw. 15 Nanomolar scrambled Kontroll-siRNA herzustellen.Danach 100 Mikroliter der siRNA-Lösung mit 100 Mikrolitern verdünntem Transfektionsreagenz mischen und das Gemisch 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend die siRNA-Lipid-Komplexe den Zellen hinzufügen. Nach einer vierstündigen Inkubation das Medium durch das vollständige Wachstumsmedium für Bronchialepithel ersetzen und die Zellen zwei Tage bei 37 Grad Celsius inkubieren, bevor die Western-Blot-Analyse durchgeführt wird.In diesem Schritt extrahieren Sie HSP27-spezifische und mit scrambled-Kontroll-siRNA transfizierte HCECs in einem biologischen Sicherheitswerkbank unter Verwendung von 100 µL eiskaltem Lysepuffer. Inkubieren Sie die Zellen anschließend 30 Minuten auf Eis, um die Zelllyse zu induzieren. Zentrifugieren Sie danach die Lysate bei 10.000 ×g für 15 Minuten.Anschließend überführen Sie die Überstände in frische 1,5-Milliliter-Röhrchen und lagern sie bei minus 80 Grad Celsius. Danach bestimmen Sie die Protein-Konzentrationen der Zelllysate mithilfe des Bradford-Protein-Assays. Anschließend laden Sie die Proben mit gleichen Mengen an Gesamtzellproteinen auf ein 10-prozentiges oder 12-prozentiges Acrylamid-Gel auf.Dem Gel eine SDS-Gelelektrophorese unterziehen und die getrennten Proteinbanden elektrophoretisch eine Stunde lang mit 200 Milliampere Stromstärke bei vier Grad Celsius auf Nitrocellulosefilter übertragen. Danach blockieren Sie die Nitrocellulosefiltermembranen eine Stunde lang mit fünf Prozent Magermilch in TBST. Anschließend fügen Sie die primären Antikörper hinzu und inkubieren die Membranen über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Schüttler.Am nächsten Tag die Membranen dreimal mit TBST waschen, wobei jede Waschung zehn Minuten dauert. Anschließend die immunreaktiven Banden mit mit Meerrettich-Peroxidase-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörpern in fünf Prozent BSA nachweisen. Danach die Membranen für eine Minute bei Raumtemperatur in den Luminol-Reagenzien für die Western-Blot-Detektion inkubieren.Entfernen Sie die Membran aus der Reagenzlösung. Danach entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem absorbierenden Tuch und legen sie in eine Plastikhülle. Anschließend platzieren Sie die abgedeckte Membran in einer Filmkassette mit der Proteinsseite nach oben.Legen Sie einen Röntgenfilm auf die Membranen und belichten Sie ihn eine Minute lang. Erzeugen Sie in einer biologischen Sicherheitswerkbank eine Wunde, indem Sie eine sterile Pipettenspitze über die konfluenten Kulturen von HSP27-spezifischem oder scrambeltem Kontroll-siRNA-transfizierten HCECs ziehen. Spülen Sie die Zellen unmittelbar nach der Verletzung zweimal mit 1×PBS und kultivieren Sie sie 24 Stunden lang in Bronchialepithel-Wachstumsmedium bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid.24 Stunden nach der Verletzung nehmen Sie das Bild der HCECs mit einem aufrechten Mikroskop bei 100x auf und führen eine Hintergrundglättung mithilfe des Filterbefehls in der Bildanalyse-Software durch. Definieren Sie mit dem Befehl „Messungen auswählen“ den interessierenden Bereich mittels einer polygonalen Form gleicher Größe, die senkrecht zur ursprünglichen Wunde von einem Ende zum anderen reicht. Bestimmen Sie anschließend drei verschiedene Bereiche des Interesses im verletzten Bereich jeder Probe.Zählen Sie automatisch die Zellanzahl in jedem Feld mithilfe der Option „Größenmessung zählen“ im Menü. Die hier gezeigte Western-Blot-Analyse zeigte, dass die Expression von phosphoryliertem HSP27 und phosphoryliertem Akt signifikant verringert war. Hingegen war die Expression von Bax in HSP27-spezifisch mit siRNA transfizierten HCECs signifikant erhöht.Die Expression des phosphorylierten HSP27 wurde in Zellen, die mit 10 Nanomolar bzw. 15 Nanomolar HSP27-spezifischem siRNA transfiziert wurden, um 30 Prozent bzw. 40 Prozent im Vergleich zu Kontroll-siRNA-transfizierten Zellen reduziert. Darüber hinaus wurde die Expression des nichtphosphorylierten HSP27 in Zellen, die mit zehn Nanomolar bzw. 15 Nanomolar HSP27-spezifischem siRNA transfiziert wurden, um 20 Prozent bzw. 30 Prozent reduziert. Der durch Kratzer induzierte gerichtete Wundheilungsassay zeigte, dass die mit HSP27-spezifischem siRNA transfizierten Zellen bei 10 und 15 Nanomolar 24 Stunden nach Verletzung eine verminderte Migration aufwiesen.Zusätzlich zeigten HSP27-spezifisch mit siRNA transfizierte HCECs stärkeren apoptotischen und nekrotischen Zelltod im Vergleich zu Zellen, die mit kontrollsiRNA (scrambled) transfiziert wurden, wie durch Durchflusszytometrie gezeigt wurde. Sobald die RNA-Transfektionstechnik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 24 Stunden durchgeführt werden. Mithilfe dieser Verfahren kann ein Zustand wie „lock mouth“ erzeugt werden, um zusätzliche Fragen hinsichtlich der ursprünglichen Funktion des Heat Shock Proteins 27 in der epitelialen Wundheilung der Hornhaut zu beantworten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine auf Heat Shock Protein 27 spezifische kleine interferierende RNA verwendet, um die mögliche Rolle von Heat Shock Protein 27 bei der Wundheilung des Hornhautepithels zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit kleinen interferierenden RNAs und Reagenzien gefährlich sein kann und dass stets Schutzvorrichtungen wie ein Sicherheitswerkbank für biologische Arbeitsstoffe und eine Schutzmaske verwendet werden sollten, während diese Verfahren durchgeführt werden.

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