RNA-Interferenz-basierte Untersuchung der Funktion von Heat Shock Protein 27 während Hornhautepithels Wundheilung

Das übergeordnete Ziel dieses RNA-Transfektionsassays ist es, HSP27-spezifische kleine interferierende RNA zu verwenden, um die potenzielle Rolle von HSP27 bei der Wundheilung im Hornhautepithel zu bewerten. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur Funktion des Hitzeschockproteins 27 während des epithelialen Wundheilungsprozesses zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich bei der kleinen interferierenden RNA um empfindliche RNA-Saccharose handelt, die spezifisch auf ein Boten-RNA-Transkript abzielt, um dessen Abbau zu induzieren.

Es wurde verwendet, um neue Schädlingsräume verschiedener zellulärer Prozesse zu identifizieren. Obwohl diese Technik einen Einblick in die Heilung der Hornhautepithelwunde geben kann, kann sie auch auf ein anderes System wie Haut und Schleimhaut angewendet werden. Das Verfahren wird von Soon-Suk Kang, einer Technikerin aus meinem Labor, vorgeführt.

Um dieses Verfahren zu beginnen, kultivieren Sie menschliche Hornhautepithelzellen in einer Sechs-Well-Platte mit Bronchialepithel-Wachstumsmedium bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid, bis sie zu 95 Prozent zusammenfließen. Als nächstes verdünnen Sie 2,5 Mikroliter oder 7,5 Mikroliter des Transfektionsreagenzes mit 100 Mikrolitern reduziertem Serummedium für die Transfektion. Löse dann HSP27-spezifische siRNA und verschlüsselte kontrollierte siRNA in 100 Mikrolitern oder reduziertem Serummedium auf, um 10 Nanomolare HSP27-spezifische siRNA bzw. 15 Nanomolare verschlüsselte Kontroll-siRNA zu erzeugen.

Mischen Sie anschließend 100 Mikroliter siRNA-Lösung mit 100 Mikrolitern verdünntem Transfektionsreagenz und inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Fügen Sie anschließend den Zellen siRNA-Lipidkomplexe hinzu. Nach einer vierstündigen Inkubation wechseln Sie das Medium zum vollständigen Wachstumsmedium des Bronchialepithels und inkubieren die Zellen zwei Tage bei 37 Grad Celsius vor der Western-Blot-Analyse.

In diesem Schritt werden HSP27-spezifische und verschlüsselte siRNA-transfizierte HCECs in einer biologischen Sicherheitswerkbank unter Verwendung von 100 Mikrolitern eiskaltem Lysepuffer extrahiert. Dann inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang auf Eis, um die Zelllyse zu induzieren. Als nächstes zentrifugieren Sie die Lysate 15 Minuten lang bei 10.000 mal G.

Anschließend werden die Überstände in frische 1,5-Milliliter-Röhrchen umgefüllt und bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Bestimmen Sie danach die Proteinkonzentrationen der Zelllytate mit dem Bradford-Protein-Assay. Laden Sie dann die Proben mit gleichen Mengen an Gesamtzellproteinen auf ein 10- oder 12-prozentiges Acrylamidgel.

Setzen Sie das Gel einer SDS-Seite aus und übertragen Sie die getrennten Proteinbanden elektrophoretisch für eine Stunde und vier Grad Celsius mit 200 Milliampere Strom auf die Nitrozellulosefilter. Blockieren Sie anschließend die Nitrozellulose-Filtermembranen eine Stunde lang mit fünf Prozent Magermilch in TBST. Fügen Sie dann primäre Antikörper hinzu und inkubieren Sie die Membranen über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Shaker.

Waschen Sie die Membranen am nächsten Tag dreimal mit TBST, wobei Sie für jede Wäsche zehn Minuten einplanen. Weisen Sie dann die immunreaktiven Banden mit Meerrettichperoxidase-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörpern in fünf Prozent BSA nach. Anschließend werden die Membranen in den Western Blotting Luminol-Reagenzien eine Minute lang bei Raumtemperatur inkubiert.

Entfernen Sie die Membran aus der Reagenzlösung. Entfernen Sie dann überschüssige Flüssigkeit mit einem saugfähigen Handtuch und legen Sie sie in eine Plastikfolie. Legen Sie anschließend die abgedeckte Membran mit der Proteinseite nach oben in eine Filmkassette.

Legen Sie einen Röntgenfilm auf die Membranen und belichten Sie ihn eine Minute lang. Machen Sie in einer biologischen Sicherheitswerkbank eine Wunde, indem Sie eine sterile Pipettenspitze über die konfluenten Kulturen von HSP27-spezifischen oder verschlüsselten Kontroll-siRNA-transfizierten HCECs ziehen. Waschen Sie die Zellen unmittelbar nach der Verwundung zweimal mit 1XPBS und halten Sie sie 24 Stunden lang in einem Wachstumsmedium des Bronchialepithels bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid.

24 Stunden nach der Verwundung nehmen Sie das HCECs-Bild mit einem aufrechten Mikroskop bei 100x auf und führen Sie die Hintergrundreduzierung mit dem Filterbefehl in der Bildanalysesoftware durch. Definieren Sie mit dem Befehl Messungen auswählen den interessierenden Bereich mit der gleichen polygonalen Größe, die die anfängliche Wunde senkrecht von Ende zu Ende abdecken kann. Bestimmen Sie dann drei verschiedene Interessenbereiche im verwundeten Bereich jeder Probe.

Zählen Sie automatisch die Zellennummer in jedem Feld mit der Menüoption "Zählgrößenmessung". Die hier gezeigte Western-Blot-Analyse zeigte, dass die Expression von phosphoryliertem HSP27 und phosphoryliertem Akt signifikant reduziert war. Während die Expression des Rückens in HSP27-spezifischen siRNA-transfizierten HCECs signifikant erhöht war.

Die phosphorylierte HSP27-Expression war in 10 nanomolaren bzw. 15 nanomolaren Zellen von HSP27-spezifischen siRNA-transfizierten Zellen um 30 Prozent bzw. 40 Prozent reduziert, verglichen mit Kontroll-siRNA-transfizierten Zellen. Darüber hinaus war die nicht-phosphorylierte HSP27-Expression um 20 Prozent bzw. 30 Prozent in zehn nanomolaren bzw. 15 nanomolaren HSP27-spezifischen siRNA-transfizierten Zellen reduziert. Der Scratch-induzierte gerichtete Wundassay zeigte, dass 24 Stunden nach der Verwundung HSP27-spezifische siRNA-transfizierte Zellen bei 10 und 15 Nanomolaren eine reduzierte Migration zeigten.

Darüber hinaus erlitten HSP27-spezifische siRNA-transfizierte HCECs im Vergleich zu den durchflusszytometrisch gezeigten siRNA-transfizierten Zellen im Vergleich zu den durchflusszytometrisch gezeigten siRNA-transfizierten Zellen einen stärkeren apoptotischen und nekrotischen Zelltod. Sobald die RNA-Transfektionstechnik gemeistert ist, kann sie in 24 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nach diesen Verfahren kann eine Episode wie Lock Mouth erzeugt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die initiale Funktion des Heat Shock Protein 27 bei der Heilung von epithelialen Wunden der Hornhaut.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Heat Shock Protein 27-spezifische kleine interferierende RNA verwenden können, um die potenzielle Rolle des Heat Shock Protein 27 bei der Heilung von epithelialen Wunden der Hornhaut zu beurteilen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit kleinen interferierenden RNA und Reagenzien gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieser Verfahren immer Vorläufer wie eine biologische Sicherheitswerkbank und eine Schutzmaske verwendet werden sollten.