Herstellung von Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebe Cores sowohl für RNA und DNA-Extraktion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die sequentielle Extraktion von RNA und DNA aus archivalen, formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebekernen. Dabei handelt es sich um ein Protokoll zur Entnahme von Gewebekernen, aus dem wir sowohl RNA als auch DNA extrahieren werden. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es die RNA- und DNA-Ausbeute aus genau anvisierten Regionen im Gewebeblock verbessert.

Dieses Verfahren wird weitgehend in archivierten Prostatakrebsgeweben entwickelt. Es kann auch auf andere Arten von Archivgeweben angewendet werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte des Entkernens von Geweben in Forschungslabors nicht üblich sind.

Die meisten Forschungslabore verwenden stattdessen Querschnitte, was das Gewebe schneller erschöpft und die Probe erheblich heterogenisiert. Beginnen Sie damit, den Objektträger zu überprüfen und den interessierenden Bereich mit einem feinen Permanentmarker zu umreißen. Schneiden Sie als Nächstes einen Abschnitt des Paraffinfilms ab, der groß genug ist, um den interessierenden Bereich auf dem Objektträger abzudecken.

Legen Sie dann die Folie fest auf das Objektträger und wickeln Sie die Folie über die Kanten, damit sie nicht verrutscht. Umreißen Sie mit einem feinen Permanentmarker das gesamte Gewebe und den interessierenden Bereich innerhalb des Gewebes. Entfernen Sie anschließend die Folie vom Objektträger und übertragen Sie sie auf den entsprechenden Gewebeblock.

Richten Sie die Folie durch Drehen oder Drehen so aus, dass der Umriss des gesamten Gewebes mit der beobachteten Form des Gewebes im Block übereinstimmt. Drücken Sie den Folienabschnitt fest auf die Oberfläche des Blocks, um ein Verrutschen zu verhindern. Machen Sie mit der Spitze des Permanentmarkers flache, aber sichtbare Vertiefungen entlang des Umrisses des interessierenden Bereichs und entfernen Sie dann den Film.

Reinigen Sie als Nächstes den Rezeptorstempel vom 0,6-Millimeter-Stempelsatz, indem Sie die Spitze in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Milliliter Bleiche tauchen und den Stempel mehrmals auf und ab schieben. Wiederholen Sie die Wäsche mit der Tube mit 70 Prozent Ethanol und dann mit Wasser. Drücken Sie nun den gereinigten Stempel bis zu einer Tiefe von drei Millimetern in den interessierenden Bereich und ziehen Sie ihn zurück.

Geben Sie den Kern in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung ab, indem Sie ihn mit dem Stift aus dem Stempel drücken. Geben Sie einen Milliliter Xylol in die Mikrofuge-Röhrchen mit den Gewebekernen und wirbeln Sie zehn Sekunden lang kräftig vortexen. Dann drei Minuten lang in einen auf 50 Grad Celsius eingestellten Heizblock geben.

Nach der Inkubation zwei Minuten lang bei Raumtemperatur bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren. Legen Sie die Kerne nach der Zentrifugation fünf Minuten lang auf Eis, um die wachsartigen Rückstände zu verfestigen. Entfernen Sie nun vorsichtig das Paraffin, das sich um den Meniskus herum angesammelt hat, zusammen mit dem Überstand, mit einer Pipettenspitze.

Wiederholen Sie dann die Xylol-Behandlung. Nach dem Entfernen der Paraffin-Xylol-Mischung einen Milliliter 100 Prozent Ethanol hinzufügen und zehn Sekunden lang kräftig vortexen. Nach dem Zentrifugieren bei maximaler Geschwindigkeit für zwei Minuten das Ethanol vorsichtig entsorgen.

Wiederholen Sie die Ethanolwäsche noch einmal, bevor Sie mit der Homogenisierung beginnen. Die entparaffinierten Kerne werden vor der Homogenisierung in 700 Mikrolitern 100 Prozent Ethanol resuspendiert. Verwenden Sie einen motorisierten Gewebehomogenisator auf mittlerer Stufe, um die Kerne zu feinen Partikeln zu zerkleinern.

Für eine optimale DNA- und RNA-Ausbeute ist eine gründliche Homogenisierung der Gewebekerne erforderlich. Füllen Sie anschließend separate 15-Milliliter-Röhrchen mit etwa zehn Millilitern Bleichmittel, RNase Neutralisationslösung und 70 Prozent Ethanol. Nach der Homogenisierung der Probe ist die Homogenisatorsonde in jeder der Reinigungslösungen der Reihe nach zu waschen.

Lassen Sie den Homogenisator während der Waschphase auf höchster Geschwindigkeit laufen. Wischen Sie die Sonde mit einem Taschentuch ab und lassen Sie die Sonde vollständig trocknen, bevor Sie die nächste Probe homogenisieren. Überprüfen Sie die Sondenklingen visuell auf Gewebereste und reinigen Sie die Sonde erneut, falls sie gefunden werden.

Nach der Homogenisierung wird das Probenvolumen auf einen Milliliter mit 100 Prozent Ethanol gebracht und anschließend 15 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Aspirieren Sie das Ethanol vorsichtig und trocknen Sie die Pellets etwa 15 bis 20 Minuten lang an der Luft, bevor Sie mit der Proteinase-K-Extraktion beginnen. Suspendieren Sie die Pellets in 150 Mikrolitern Proteinase-K-Aufschlusspuffer und schnippen Sie mit den Röhrchen, um das Pellet zu lösen.

Für eine höhere DNA-Rückgewinnung wird ein Proteinase-K-Verdau über Nacht empfohlen. 10 Mikroliter temperaturstabile Proteinase K zugeben und durch Schnippen mischen. Bei 56 Grad Celsius 15 Minuten lang unter leichtem Rühren inkubieren.

Inkubieren Sie die Röhrchen drei Minuten lang auf Eis. Nach dem Abkühlen zentrifugieren Sie das Röhrchen 15 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit. Übertragen Sie anschließend jeden Überstand vorsichtig in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen zur RNA-Aufreinigung, ohne die Pellets zu stören.

Extrahieren Sie RNA und DNA mit dem optimierten Verfahren im schriftlichen Protokoll, das eine verlängerte Gewebeverdauungszeit für die DNA-Extraktion beinhaltet. RNA und DNA können mit dieser Methode aus älteren, formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeproben gewonnen werden. Nukleinsäuren wurden aus Prostatakrebsproben im Alter von drei bis 14 Jahren koextrahiert.

Die durchschnittliche Ausbeute lag bei 2.270 Nanogramm RNA und 820 Nanogramm DNA. Interessanterweise gab es keine signifikante Korrelation zwischen dem Alter der Gewebeprobe und der Nukleinsäuregewinnung. Insgesamt wurden RNA- und DNA-Ausbeuten über die Proben hinweg korreliert, obwohl in den meisten Fällen mehr als doppelt so viel RNA im Verhältnis zur DNA zurückgewonnen wurde.

Um die Leistungsfähigkeit der mit diesem Protokoll extrahierten genomischen DNA zu demonstrieren, wurden Bisulfit-konvertierte DNA-Extrakte aus archivierten Prostatakrebsproben durch methylierungsspezifische PCR amplifiziert. ALU-repetitive Elemente wurden als Methylierungskontrolle verwendet und zeigten geringe Unterschiede zwischen den Proben. GSTP1, ein Gen, von dem bekannt ist, dass es bei Prostatakrebs hypermethyliert ist, zeigte keine nachweisbare Amplifikation durch methylierungsspezifische PCR, wenn DNA aus gutartigen Proben verwendet wurde.

DNA-Proben von Patienten mit aggressivem Prostatakrebs wiesen nachweisbare QPCR-Zyklus-Schwellenwerte auf, die niedriger waren als die von indolenten Prostatakrebszellen, was auf eine erhöhte Methylierung von GSTP1 bei aggressivem Prostatakrebs hinweist. Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von drei bis vier Stunden für RNA und nach dem Verdau über Nacht in vier Stunden für DNA durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Diese Technik soll es Forschern in der molekularen Pathologie ermöglichen, diagnostische DNA- und RNA-Biomarker bei einer Vielzahl von Krebsarten zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Gewebekerne für die Extraktion von DNA und RNA aus genau kartierten Bereichen von Interesse in archivierten Gewebeblöcken vorbereitet werden.