Die Herstellung von Inverted Kolloid-Kristallen Poly (Ethylenglycol) Scaffold: Eine dreidimensionale Zellkultur-Plattform für Leber-Tissue Engineering

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Herstellung von PEG-basierten invertierten kolloidalen Kristallgerüsten mit einer extrazellulären Matrix, die für Anwendungen im Bereich der Lebergewebezüchtung kodiert. Das Liver Tissue Engineering ist ein spannendes Feld für das Tissue Engineering und die regenerative Medizin. Wir entwickeln ein 3D-Engineering-Gerüst, das es den Leberzellen ermöglicht, ihre Funktion für lange Zeit aufrechtzuerhalten.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auch auf Arzneimitteltests, da Leberzellen, die mit diesem System kultiviert werden, ihre Funktion länger behalten und besser auf das Medikament ansprechen können. Obwohl diese Methode Einblicke in das Tissue Engineering geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf solche, die Stammzellen verwenden. Hitomi, eine Doktorandin aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen.

Um die Mikroperlenformen vorzubereiten, schneiden Sie zunächst die Spitzen aus 0,2 Milliliter kochenden Mikrozentrifugenröhrchen auf der 40-Mikroliter-Ebene ab. Verwenden Sie wasserfesten Kleber, um die Oberseiten der geschnittenen Röhren auf Glasmikroskop-Abdeckgläser zu kleben, und kleben Sie dann um die Formen herum. Ersetzen Sie anschließend das Wasser in einem Fläschchen mit Polystyrol-Mikrokügelchen durch 70 % Ethanol.

Geben Sie die Kugellösung in ein Ultraschallbad und beschallen Sie das Gemisch drei Minuten lang mit 30 Watt, um die aggregierten Kugeln zu lösen. Sobald die Mikrokügelchen vorbereitet sind, pipettieren Sie 100 Mikroliter Ethanol in jede der Formen. Schneiden Sie dann vier Millimeter von der Oberseite einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze ab und pipettieren Sie damit zweimal 25 Mikroliter der Polystyrol-Mikrokügelchen in die Form.

Stellen Sie die Formen auf einen Wippschüttler und stellen Sie ihn auf 120 U/min ein. Lassen Sie die Proben über Nacht auf dem Shaker ruhen. Legen Sie die Formen am nächsten Tag unter ein Mikroskop und prüfen Sie, ob die Kugeln sechseckig angeordnet sind.

Lassen Sie das Ethanol zwei Nächte lang bei Raumtemperatur verdampfen. Legen Sie zu diesem Zeitpunkt den Form- und Perlenkomplex vorsichtig für sechs Stunden in einen 130 Grad Celsius heißen Ofen, um die Styroporkügelchen zu glühen und das Negativ des 3D-Gerüsts zu formen. Zunächst werden Polyethylenglykoldiacrylat-Makromere unter Verwendung etablierter Protokolle synthetisiert, wie in diesen beiden Referenzen beschrieben.

Bereiten Sie anschließend eine 50%ige Lösung von PEGDA in entionisiertem Wasser vor und zentrifugieren Sie die Mischung, bis sie sich vollständig aufgelöst hat. Für konjugierte Gerüste mit extrazellulärer Matrix fügen Sie der 50%igen PEGDA-Lösung eine Zugabe von 10 % eines Krillöls PEG NHS hinzu. Bereiten Sie dann eine 20%ige Stammlösung des Photoinitiators in 70%igem Ethanol vor.

Für jeden Milliliter des PEGDA-Gemisches werden 50 Mikroliter der Photoinitiatorlösung zugegeben. Dann die Mischung eine Minute lang wirbeln. Schälen Sie anschließend die Formen von den Objektträgern ab, drücken Sie die Gitter vorsichtig mit einem Spachtel heraus und geben Sie sie in separate 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Pipettieren Sie 300 Mikroliter der PEGDA-Lösung in jedes Röhrchen und zentrifugieren Sie dann die Röhrchen, damit die PEGDA-Lösung in das Polystyrolgitter eindringen kann. Entfernen Sie anschließend das Gitter mit einer Pinzette von der Tube und tupfen Sie überschüssige PEGDA-Lösung vorsichtig von der Oberfläche ab. Legen Sie das Gitter mit der flachen, kreisförmigen Oberfläche nach oben auf ein mit Paraffinfolie bedecktes Glas.

Setzen Sie dann das Gerüst mit einer UV-Spotlampe fünf Minuten lang 365 Nanometer ultraviolettem Licht aus. Geben Sie etwa zehn polymerisierte PEGDA-Kristallgitter in ein neues Fläschchen und fügen Sie 20 Milliliter THF hinzu. Schütteln Sie die Fläschchen auf einem Orbitalschüttler sechs Stunden lang bei 300 U/min.

Nehmen Sie das Fläschchen alle ein bis zwei Stunden heraus und tauschen Sie das polymerhaltige Lösungsmittel durch frisches THF aus. Geben Sie nach dem letzten Spülen Wasser in die verwendete THF-Lösung, um zu prüfen, ob sich die PS-Kugeln vollständig aufgelöst haben. Wenn die Lösung weiß ist, spülen Sie weiter, bis die Lösung transparent ist.

Um die Gerüste zu sterilisieren, bereiten Sie ein 50-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit zwei Millilitern 70 % Ethanol pro Gerüst vor und legen Sie die Gerüste mit einem Spatel in das Röhrchen. Lassen Sie die Gerüste eine Stunde lang in Ethanol einweichen. Gießen Sie das Ethanol nach einer Stunde vorsichtig aus und ersetzen Sie es durch die gleiche Menge steriles PBS.

Zentrifugieren Sie dann die Gerüste, um Blasen zu entfernen. Lagern Sie die Zentrifugengerüste bei vier Grad Celsius und entfernen Sie sie alle ein bis zwei Stunden, um die Lösung durch frisches PBS zu ersetzen. Entfernen Sie nach einigen Änderungen des PBS die Gerüste, die mit Kollagen beschichtet werden sollen, und legen Sie sie in ein Röhrchen mit einem Milliliter Kollagen vom Typ eins, das pro zu beschichtendem Gerüst enthalten ist.

Zentrifugieren Sie anschließend das Röhrchen wie zuvor und schütteln Sie dann die Gerüste 30 Minuten lang bei 400 U/min auf einem Orbitalschüttler. Lagern Sie die Gerüste über Nacht bei vier Grad Celsius. Kultivieren Sie Hepatokarzinomzellen in 100-Millimeter-Zellkulturschalen mit 10 Millilitern Kulturmedium.

Wechseln Sie das Medium alle drei Tage, bis die Zelldichte 75 bis 80 % der Kulturoberfläche erreicht. Wenn die Zellen fertig sind, legen Sie die Gerüste vorsichtig mit der flachen Oberfläche nach oben in eine 24-Well-Platte. Spülen Sie dann jedes Gerüst mit zwei Millilitern PBS ab.

Aspirieren Sie das PBS und geben Sie zwei Milliliter Wachstumsmedium in die Gerüste. Entfernen Sie nach 30 Minuten das Medium und lassen Sie das Gerüst eine Stunde trocknen. Als nächstes ernten Sie die Hepatokarzinomzellen mit der Trypsin-Verdauungsmethode.

Entfernen Sie nach dem Pelletieren der Zellen den Überstand und suspendieren Sie das Pellet wieder, so dass eine Million Zellen pro 25 Mikroliter vorhanden sind. Pipettieren Sie langsam 25 Mikroliter der Zellsuspension direkt auf jedes Gerüst. Decken Sie dann die Platte ab und stellen Sie sie über Nacht in den Inkubator.

Übertragen Sie anschließend die Gerüste vorsichtig in eine neue 24-Well-Platte und pipettieren Sie zwei Milliliter Medium in jede Well, bevor Sie die Platte wieder in den Inkubator stellen. Hier ist ein Rasterelektronenmikroskop des Gerüsts zu sehen. Es besteht aus einer hexagonalen, engsten Packungsanordnung von Poren mit einem Durchmesser von durchschnittlich 100 bis 105 Mikrometern, die Verbindungen mit den benachbarten Poren bildet, die meist einen Durchmesser zwischen 35 und 40 Mikrometern haben.

Wenn sie mit Hepatokarzinomzellen besiedelt werden, wachsen und vermehren sich die Zellen auf den Gerüsten, die mit Kollagen Typ eins vorbeschichtet sind, aber auf den nackten Gerüsten nicht zahlenmäßig ausdehnen. Darüber hinaus zeigten die Hepatokarinomzellen auf den kollagenbeschichteten Gerüsten eine höhere Zellfunktion in Abhängigkeit von der Konzentration. An Tag 14 sezernierten die Hepatokarzinomzellen, die in den mit 400 Mikrogramm pro Milliliter beschichteten ICC-Gerüsten kultiviert wurden, mehr als die dreifache Menge an Albumin wie diejenigen, die im nackten Gerüst kultiviert wurden.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass die Styroporkugeln im Gitter richtig angeordnet sind. Eine schlechte Anordnung führt zu einer schlechten Interkonnektivität, die sich negativ auf die Zellaktivität auswirken kann. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man celciated PEG-basierte invertierte kolloidale Kristallgerüste mit einer Beschichtung herstellt.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Tetrahydrofuran gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten in einem Abzug und das Tragen von Handschuhen und Schutzbrillen bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden sollten.