Name: Herstellung und Charakterisierung von Lipophile Doxorubicin Pro-drug Mizellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung und Charakterisierung lipophiler Doxorubicin-Prodrug-Mizellen. Diese Methode verbessert die Arzneistoffbeladung und Stabilität für eine gezielte Tumortherapie mit reduzierter Toxizität.

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Diese Arbeit wurde durch die folgenden Zuschüsse unterstützt: NIH-SC3 Zuschuss, NSF-PREM Zuschuss, Hampton University Faculty Research Grant. Wir danken Frau Michele A. Cochran vom Virginia Institute of Marine Science (VIMS) für den Einsatz des Partikelgrößenanalysators. Wir danken auch Frau Corinne R. Ramaley für die Durchsicht des Manuskripts.

1. Synthese von DOX-PA <ol><li> Wiegen 390 mg Doxorubicin und 243 mg Palmitinsäure Hydrazid, und in einen Rundkolben gegeben. </li><li> Zugabe von 150 ml wasserfreiem Methanol in den Kolben mit einer Glasspritze. In 39 ul Trifluoressigsäure (TFA) mit einer Pipette. Verwendung eines magnetischen Rührers, rühre das Reaktionsgemisch 18 h bei RT im Dunkeln. HINWEIS: Die Mengen an Reaktionsmaterialien skaliert werden können oder nach unten unterschiedlichen Mengen von DOX-PA zu erhalten. Das Verhältnis der Reaktanten sollte in den gleichen Proportionen eingehalten werden. Reaktionen unter Verwendung von DOX Mengen im Bereich von 78 mg bis 1.170 mg in einem regelmäßigen Chemielabor durchgeführt werden. </li><li> Reinigung von DOX-PA eine Kieselgelsäule mit. 17 <ol><li> Entferne das Lösungsmittel in dem Reaktionsgemisch mit einem Rotationsverdampfer. Werden 3 g Kieselgel, nachdem das Volumen des Gemisches auf etwa 20 ml reduziert. Weiter Rotationsverdampfen trockene Pulver zu ergeben, und t zu ermöglichener Adsorption von Produkten auf das Silicagel. Halten der Probe unter einem Vakuum für weitere 30 min, nachdem die Trockenpulver gebildet werden. </li><li> Pack 50 g Kieselgel in einer Kolonne von Dichlormethan als Lösungsmittel verwendet wird. Vorsichtig die Kieselgel-Probe adsorbierte Produkt an die Säule enthält. </li><li> Eluieren der Säule mit einem Gemisch aus Dichlormethan und Methanol, wobei nach und nach den Anteil an Methanol zu, wodurch Lösungsmittelpolarität zunehmende (Tabelle 1). </li><li> Sammle Fraktionen des Eluenten in Teströhrchen (25 ml / Röhrchen) und den Fortschritt durch Dünnschichtchromatographie (TLC). </li><li> Kombinieren Sie alle Fraktionen, die reine DOX-PA und entferne das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer bis trockenes Pulver gebildet wird. Trocknen das Produkt weiter unter Vakuum O / N. </li></ol></li><li> Analyse von DOX-PA durch TLC. <ol><li> Schneiden Sie ein 4 cm x 8 cm langen Abschnitt der DC-Platte. Spot-Probenlösungen 0,5 cm von der Unterseite der Platte mit TLC Spek Kapillaren unter Verwendung erfülltHANOL als Lösungsmittel. </li><li> Platzieren Sie die DC-Platte in eine Entwicklungskammer mit einer Mischung aus Dichlormethan und Methanol, das (3/1, v / v). Die Tiefe der Lösungsmittel sollte als 0,5 cm nur weniger. </li><li> Entfernen Sie die Platte aus der Entwicklerkammer, wenn die Lösungsmittelfront die Oberseite der Platte erreicht. Markieren Sie die Stelle des Lösungsmittelfront mit einem Bleistift und lassen Sie die Platte zu trocknen. Legen Sie die DC-Platte in eine Färbungskammer gesättigt Joddampfes enthält, um Proben zu visualisieren. </li></ol></li><li> Analyse von DOX-PA mit 1 H-Kernresonanzspektroskopie (1 H-NMR). 18 <ol><li> Man löst 15 mg des DOX-PA in 1 ml Methylsulfoxid-d 6 (DMSO) und Übertragung der Probe in ein NMR-Röhrchen. </li><li> Legen Sie die NMR-Röhrchen in den Magneten des NMR-Instrument. Messung der Protonenspektrum, Auswählen DMSO als Lösungsmittel. Entfernen Sie das NMR-Röhrchen von dem Magneten. Analysieren Sie den NMR - Ergebnis 18. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von DOX-PA Mizellen durch Film-Dispersionsverfahren <ol><li> Auflösen DSPE-PEG (40 mg) und DOX-PA (4 mg) mit 2 ml Methanol in einem 10 ml Glasfläschchen. </li><li> Entfernen des organischen Lösungsmittels im Vakuum am Rotationsverdampfer, bis sich ein dünner Film bildet sich in der Phiole verwendet. HINWEIS: Alternativ verdampfen die organischen Lösungsmittel unter Inertgas (zB Argon oder Stickstoffgas) einen Film zu bilden und das Fläschchen in einem Vakuumexsikkator halten , um weitere Lösungsmittelreste zu entfernen. </li><li> Transfer 2 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,4, DPBS) auf dem Glasfläschchen. </li><li> Legen Sie das Fläschchen in einem Ultraschallbad für 3 min bei RT zu Mizellen erzeugen. HINWEIS: Die Ultraschall-Leistung variiert zwischen den verschiedenen Modellen von Ultraschallbädern. Wählen Sie eine Einheit, die genügend Ultraschallleistung erzeugen kann, die dünne Polymer / Arzneimittel-Film zu zerstreuen. Die Ausgangsleistung des Ultraschallbades in diesem Protokoll verwendet ist 110 W. </li><li> Halten Mizellen bei 4 ° C für die kurzzeitige Lagerung und -20 ° C für lange-term Lagerung. HINWEIS: Alternativ können Mizellen auch gefriergetrocknet und vor Gebrauch mit Wasser rekonstituiert. Normalerweise kein Gefrierschutzmittel oder Lyoschutzmittel wird für diese Formulierung erforderlich. </li></ol> 3. Charakterisierung der DOX-PA Mizellen <ol><li> Bestimmung der DOX-PA - Konzentration in Mizellen und Drogen Verkapselungswirksamkeit <ol><li> Auflösen DOX-PA in vorherigen Schritten in DMSO synthetisiert DOX-PA-Lösungen von fünf verschiedenen Konzentrationen herzustellen: 1 &amp; mgr; g / ml, 5 ug / ml, 20 ug / ml, 50 ug / ml und 100 &amp; mgr; g / ml. Messen der Absorption von DOX-PA-Lösungen mit einem UV-VIS-Spektrometer bei 490 nm. Generieren Sie eine Standardkurve auf der Basis der DOX-PA Wirkstoffkonzentrationen und deren bei 490 nm entsprechenden Absorption. </li><li> Verdünne 25 &amp; mgr; l von mit Wirkstoff beladenen Mizelle mit 500 ul DMSO. Messen Sie die Absorption bei 490 nm mit einem UV-VIS-Spektrometer. Berechnen Wirkstoffkonzentrationen mit der Standardkurve in 3.1.1 erzeugt. </li><li> Berechnen Verkapselungseffizienz Verwendung der folgenden Gleichung: Drug Umhüllungs-Effektivität (%) = (Menge an Arzneimittel in Mizellen) / (Menge an zugesetztem drug) × 100% </li></ol></li><li> Charakterisierung von Partikelgröße mit dynamischer Lichtstreuung (DLS) <ol><li> Verdünnte Mizellen mit DPBS (pH 7,4) auf eine endgültige DSPE-PEG-Konzentration von 1 mg / ml. Analysieren eine 2 ml Probe mit einem Teilchengrßenanalysator das Z-gemittelte Größe und Polydispersitätsindex (PDI) zu erhalten. </li></ol></li><li> Bewertung der in - vitro - Aktivität gegen Krebs HINWEIS: Verwenden Sie geeignete sterile Technik und in einem Biosicherheitsschrank bedienen. <ol><li> Entfernen des Zellkulturmediums aus einer Zellkulturflasche (beispielsweise T25) enthält , DU-145 menschlichen Prostatakrebszellen und spülen Sie die Zellen mit 2 ml DPBS (pH 7,4). </li><li> Aspirat DPBS, 1 ml Trypsin-Lösung (0,25%) und bei 37 ° C für 2 min inkubiert, um die Zellen abzulösen. </li><li> In 10 ml Zellkulturmedium (RPMI 1640 + 10% fötales Rinderserum + 1% Antibiotic-Antimykotische), wenn die meisten der Zellen aus dem Kolben abgelöst werden. Transfer-Zellen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere die Zellen bei 1.000 × g für 5 min. </li><li> Resuspendieren des Zellpellets mit 5 ml Kulturmedium Zelle und Entfernen mit einem Hämozytometer eine Probe Zellzahlen zum Zählen. Verdünne die Zellen mit Zellkulturmedium bis zu einer Dichte von 50.000 Zellen / ml. Fügen Sie die verdünnten Zellsuspensionen in einer 96-Well-Zellkulturplatte (100 &amp; mgr; l / Well). Inkubieren der Zellen in einem Zellkulturbrutschrank (37 ° C, 5% CO 2) für 18 h Zellanheftung zu ermöglichen. </li><li> Verdünnte DOX Dimethylsulfoxid (DMSO) -Lösung und DOX-PA DMSO Lösung mit Zellkulturmedium bis zur endgültigen Arzneimittelkonzentrationen von 0,1 &amp; mgr; M zu erhalten, 0,5 uM, 2 uM, 5 uM und 10 uM, respectively. Halten DMSO-Endkonzentration in allen obigen Proben auf 0,5%. Verdünnte DOX-PA Mizellen mit Zellkulturmedium endgültige Arzneimittel co zu erhaltenncentrations von 0,1 uM, 0,5 uM, 2 uM, 5 uM und 10 uM, respectively. Verwenden Sie die leere Zellkulturmedium, das eine Kontrolle. </li><li> Entfernen Sie die 96-Well-Zellkulturplatte aus dem Inkubator und ersetzen Sie die Zellkulturmedium mit 100 ul Medium unterschiedliche Behandlungsmittel enthalten, hergestellt in Schritt 3.3.5 (n = 4 für jede Gruppe). Inkubieren der Zellen in der Zellkulturbrutschrank (37 ° C, 5% CO 2) für eine weitere 72 hr. </li><li> Anzusaugen, das Medium und füge 100 ul Medium, enthaltend 0,5 mg / ml 3- (4,5-dimethyl-thiazol-2-yl) -2,5-diphenyl Tetrazolium Bromid (MTT). </li><li> Inkubieren der Zellen in der Zellkultur-Inkubator für weitere 2 Stunden. Sie vorsichtig das Medium zu entfernen und 100 ul DMSO hinzufügen Formazankristallen aufzulösen. </li><li> Messung der Extinktion mit dem Mikroplatten-Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 570 nm und einer Referenzwellenlänge von 670 nm. </li><li> Berechnen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung der folgenden Gleichung: <strong&gt; Zell Viability (%) = (A Test / A - Steuerung) × 100% HINWEIS: Vergleichen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen zwischen den verschiedenen Gruppen unter Verwendung einer Einwegvarianzanalyse (ANOVA) statistischer Test. Berechnen Sie die IC 50 basierend auf die Lebensfähigkeit der Zellen gegen die Arzneimittelkonzentration Daten. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In dieser Arbeit beschreiben wir eine unkomplizierte, schnelle Filmdispersionsverfahren zur Herstellung von Mizellen. Dieses Verfahren nutzt die Selbstorganisation eines amphiphilen Polymers (zB DSPE-PEG) Kern-Schale - strukturierten Mizellen in einer wässrigen Umgebung zu bilden. Diese Mizellen Herstellungsverfahren hat mehrere Vorteile. 1. Es handelt sich eine einfache Formulierungsverfahren, die die Verwendung von komplizierten Zerkleinerungsschritten (wie Extrusion oder Homogenisierung) vermeidet üblicherwe...

Chemotherapie wird häufig verwendet, um verschiedene Formen von Krebs zu behandeln. Die meisten, wenn nicht alle, chemotherapeutische Medikamente haben toxische Nebenwirkungen, die von handhabbaren minor Bedingungen, wie Übelkeit und Diarrhö, um mehr lebensbedrohlichen Zuständen variieren kann. Da die meisten Krebsmedikamente toxisch, nicht-selektive Belichtung dieser Medikamente zu normalem Gewebe sind verursacht unweigerlich Toxizität. Daher besteht ein großer Bedarf für einen therapeutischen Ansatz, der selektiv Drogen in Krebszellen liefern kann. Eine weitere Herausforderung bei der Verabreichung von Anti-Krebs-Medikamente ist ihre schlechte Wasserlöslichkeit. Üblicherweise werden Solubilisierungsmittel notwendig, um diese schlecht löslichen Arzneimitteln zu formulieren. Allerdings sind die meisten Lösungsvermittlern, wie Dimethylsulfoxid (DMSO), Cremophor EL, und Polysorbat 80 (Tween 80) kann zu Leber- und Nierentoxizität, Hämolyse und akute Überempfindlichkeitsreaktionen und periphere Neuropathien. 1 daher sicher und biokompatibel Formulierungen erforderlich sind für die klinische Verwendung von schlechtenly löslichen Krebsmedikamente. Nanocarriers sind vielversprechende Wirkstoffabgabesysteme für die oben genannten Herausforderungen. Diese Nanocarriern umfassen Liposomen, 2 Nanopartikel, 3 Mizellen, 4-7 Polymer-Wirkstoff - Konjugate, 8 und anorganischen Materialien. 9 Mehrere Nanoprodukte (zB Caelyx, Abraxane und Genexol) wurden von den Aufsichtsbehörden genehmigt worden , um Krebspatienten zu behandeln. 10 Polymere Mizellen sind vielversprechende nanoskalige Wirkstoffabgabeträger, die für die Abgabe von Antikrebsmitteln erfolgreich verwendet wurden. 4-7,11,12 Typische polymere Mizellen werden aus amphiphilen Polymeren durch eine Selbstorganisation. Die Kern-Schale-strukturierte polymere Mizellen umfassen eine hydrophile Schale und einen hydrophoben Kern. Die hydrophile Schale kann sterisch Mizellen stabilisieren und ihre Zirkulation im Blutstrom zu verlängern. Der hydrophobe Kern kann wirksam hydrophob d einzukapselnTeppiche. Aufgrund der geringen Größe der Mizellen (typischerweise weniger als 200 nm) und Langzirkulationseigenschaften werden polymere Mizellen angenommen Tumor-Targeting durch erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) Effekte (passive Tumor Targeting) zu erreichen. Wirkstoffbeladung Stabilität ist für den Tumor kritische Fähigkeit von Mizellen Targeting. Um eine optimale Tumor-Targeting zu erreichen, sollte Mizellen minimale Medikamenten Leckage haben, bevor die Tumorstelle zu erreichen, noch kurz die Droge nach Krebszellen gelangt. Zusätzlich ist Formulierungsstabilität auch eine wesentliche Voraussetzung für die Produktentwicklung, weil Formulierungsstabilität, die Durchführbarkeit der Produktentwicklung bestimmt, sowie die Haltbarkeit der entwickelten Produkte. Kürzlich wurde viel Anstrengung unternommen, die Belastung von Medikamenten in Lieferträger zu verbessern. Die lipophile Prodrug - Ansatz ist eine Strategie , die erforscht wurde Wirkstoffbeladung in Lipid - Nanopartikel und Emulsionen zu verbessern. 13,14 Die Konjugation von Lipiden mit Medikamenten deutlich ihre Lipophilie verbessern und in den lipophilen Komponenten von Nanocarriern Laden und Retention zu verbessern. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Herstellung von lipophilen Doxorubicin Prodrug geladenen Mizellen. Zunächst wird die Syntheseprozedur lipophilen Prodrug für Doxorubicin beschrieben. Dann wird ein Protokoll für die Mizellen mit einem filmDispersionsVerfahren Erzeugen eingeführt. Diese Methode wurde in unseren früheren Studien. 5 DSPE-PEG wurde ausgewählt als Trägermaterial zur Herstellung von Micellen , weil es wurde für Micelle Arzneimittelabgabe erfolgreich eingesetzt erfolgreich eingesetzt. 15,16 Schließlich wir Micelle mehrere in vitro - Assays zur Charakterisierung beschreiben Formulierungen und Anti-Krebs-Aktivität zu bewerten.

<table><tbody><tr><td>DSPE-PEG2K</td><td>Cordenpharm</td><td>LP-R4-039></td><td>95%</td></tr><tr><td>Doxorubicin</td><td>LC Laboratorien</td><td>D-4000></td><td>99%</td></tr><tr><td>Palmitinsäurehydrazid</td><td>TCI AMERIKA&nbsp; &nbsp;</td><td>P000425G</td><td>>98,0%</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>ACROS Organics</td><td>610981000</td><td>wasserfreies</td></tr><tr><td>Methylenchlorid&nbsp;</td><td>FISCHER&nbsp;</td><td>D151-4</td><td>99,90%</td></tr><tr><td>Methylsulfoxid-d6</td><td>ACROS Organische Stoffe</td><td>AC320760075</td><td>NMR-Lösungsmittel</td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>ACROS Organics</td><td>AC293811000</td><td>99,50%</td></tr><tr><td>Kieselgel</td><td>FISHER&nbsp;</td><td>L-7446</td><td>230-400</td></tr><tr><td>mesh Baker Flex TLC Platten</td><td>FISHER&nbsp;</td><td></td><td></td>NC9990129</tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>DU 145&nbsp; Prostatakrebszellen</td><td>ATCC</td><td>HTB-81</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>ACROS Organische Stoffe</td><td>158990050</td><td>98%</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>MEDIATECH INC&nbsp;</td><td>10041CV</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum&nbsp;</td><td>LIFE TECHNOLOGIES&nbsp;</td><td>15240062</td><td>100x Stammlösung</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>LIFE TECHNOLOGIES&nbsp;</td><td></td><td></td>10437077</tr><tr><td>Kernspinresonanzspektroskopie</td><td>Varian, Inc</td><td></td><td>300 NMR&nbsp;</td></tr><tr><td>B&uuml; chi R-3 Rotavapor</td><td>Büchi</td><td>1103022V1&nbsp;</td><td>Rotationsverdampfer</td></tr><tr><td>Ultraschallbad</td><td>BRANSON ULTRASONICS CORPORATION&nbsp;</td><td></td><td></td>CPX952318R</tr><tr><td>UV-VIS Spektrometer Biomate 3</td><td>Thermo Spectronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS90&nbsp;</td><td>Malvern Instruments</td><td></td><td>Partikelgrößenanalyator</td></tr><tr><td>Mikroplatten-Spektralphotometer&nbsp;</td><td>Rio-Rad</td><td>Benchmark Plus&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur-Inkubator</td><td>Napco</td><td>CO2 6000</td><td></td></tr><tr><td>Biologische Sicherheitswerkbank</td><td>Nuaire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot</td><td>Systat Software, Inc.</td><td></td><td>Analytische Software</td></tr><tr><td>96-Well-Zellkulturplatte</td><td>Becton Dickinson</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin&nbsp; 0,25 %</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung und charakterisierung von lipophile doxorubicin pro-drug mizellen

Preparation and Characterization of Lipophilic Doxorubicin Pro-drug Micelles

Mizellen wurden erfolgreich für die Verabreichung von Krebsmedikamenten eingesetzt. Amphiphile Polymere bilden in wässriger Umgebung durch Selbstorganisation Kern-Schale-strukturierte Mizellen. Der hydrophobe Kern der Mizellen fungiert als Wirkstoffreservoir und kapselt hydrophobe Arzneimittel ein. Die hydrophile Hülle verhindert die Aggregation von Mizellen und verlängert auch deren systemische Zirkulation in vivo. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zur Synthese eines lipophilen Doxorubicin-Pro-Drugs, Doxorubicin-Palmitinsäure (DOX-PA), das die Wirkstoffbeladung in Mizellen erhöht. Ein pH-empfindlicher Hydrazon-Linker wurde verwendet, um Doxorubicin mit dem Lipid zu konjugieren, was die Freisetzung von freiem Doxorubicin in Krebszellen erleichtert. Synthetisiertes DOX-PA wurde mit einer Kieselgelsäule unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol als Eluent gereinigt. Aufgereinigtes DOX-PA wurde mittels Dünnschichtchromatographie (DC) und 1H-Kernspinresonanzspektroskopie (1H-NMR) analysiert. Ein Filmdispergierverfahren wurde verwendet, um DOX-PA-beladene DSPE-PEG-Mizellen herzustellen. Darüber hinaus werden mehrere Methoden zur Charakterisierung von Mizellenformulierungen beschrieben, einschließlich der Bestimmung der DOX-PA-Konzentration und der Verkapselungseffizienz, der Messung der Partikelgröße und -verteilung sowie der Bewertung der In-vitro-Antikrebsaktivitäten. Dieses Protokoll liefert nützliche Informationen zur Herstellung und Charakterisierung von wirkstoffbeladenen Mizellen und wird somit die Erforschung und Entwicklung neuartiger mizellenbasierter Krebs-Nanomedikamente erleichtern.

Abbildung 1 zeigt das Syntheseschema von DOX-PA. DOX-PA wurde durch Konjugation von Palmitinsäure synthetisiert mit Doxorubicin über eine pH-sensitive Hydrazonbindung. Ein geringer Überschuß an Palmitinsäure Hydrazid wurde verwendet, um die Vervollständigung der Reaktion zu erleichtern. Dieses Reaktionsverfahren hat einen sehr hohen Wirkungsgrad und nur eine geringe Menge von Doxorubicin blieb nach 18 h Reaktion (Abbildung 2). Die Ausbeute betrug etwa 88...

Ein Protokoll für die Herstellung und Charakterisierung von lipophilen Doxorubicin Prodrug geladen 1,2-Distearoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [Amino (Polyethylenglykol) -2000] (DSPE-PEG) Micellen beschrieben.

Herstellung und Charakterisierung von Lipophile Doxorubicin Pro-drug Mizellen

Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Verfahren zur Herstellung und Charakterisierung lipophiler Mizellenformulierungen, die mit einem Doxorubicin-Prodrug beladen sind, zu beschreiben. Diese Methode bietet einen einfachen und zuverlässigen Ansatz zur Herstellung von Mizellen. Die Synthese eines lipophilen Prodrugs von Doxorubicin kann die Arzneimittelbeladung und -stabilität verbessern und trägt somit dazu bei, eine bedeutende Herausforderung bei der Entwicklung von Mizellenformulierungen zu bewältigen.Die Mizellenformulierung kann die gezielte Abgabe von Wirkstoffen in Tumore verbessern und dadurch die Toxizitäten der Krebstherapie verringern. Neben der in diesem Projekt beschriebenen Anwendung kann diese Technik auch zur Herstellung von Nanomedizin für Wirkstoffe verwendet werden. Um das lipophile Doxorubicin-Prodrug DOX-PA herzustellen, wiegen Sie 390 Milligramm Doxorubicin und 243 Milligramm Palmitinsäurehydroxid ab und geben Sie diese in einen Rundkolben. Geben Sie 150 Milliliter wasserfreies Methanol mit einer Glas-Spritze in den Kolben. Fügen Sie anschließend 39 Mikroliter Trifluoressigsäure (TFA) mit einer Pipette hinzu. Rühren Sie das Reaktionsgemisch unter Verwendung eines magnetischen Rührers 18 Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln um. Um DOX-PA mithilfe einer Kieselgelsäule zu reinigen, entfernen Sie zuerst das Lösungsmittel im Reaktionsgemisch mit einem Rotationsverdampfer. Geben Sie drei Gramm Kieselgel hinzu, nachdem das Volumen des Gemischs auf etwa 20 Milliliter reduziert wurde. Fahren Sie mit der Rotationsverdampfung fort, um trockene Pulver zu erhalten und die Absorption der Produkte an das Kieselgel zu ermöglichen.Belassen Sie die Probe weitere 30 Minuten unter Vakuum, nachdem die trockenen Pulver gebildet wurden. Füllen Sie 50 Gramm Kieselgel unter Verwendung von Dichlormethan als Lösungsmittel in eine Säule. Geben Sie die Kieselgelsäule, die das absorbierte Produkt enthält, vorsichtig auf die Säule.Eluieren Sie die Säule mit einer Mischung aus Dichlormethan und Methanol, wobei der Methanolanteil schrittweise erhöht wird, um so die Polarität des Lösungsmittels zu steigern. Sammeln Sie die Eluatfraktionen in Reagenzgläsern mit jeweils 25 Milliliter pro Glas und überwachen Sie den Verlauf mittels Dünnschichtchromatographie (TLC). Vereinigen Sie alle Fraktionen, die reines DOX-PA enthalten, und entfernen Sie das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer, bis ein trockenes Pulver vorliegt.Trocknen Sie das Produkt anschließend über Nacht unter Vakuum. Zum Herstellen von Mizellen lösen Sie 40 Milligramm DSPE-PEG und vier Milligramm DOX-PA mit zwei Milliliter Methanol in einem 10-Milliliter-Glasfläschchen. Entfernen Sie das organische Lösungsmittel unter Vakuum mithilfe eines Rotationsverdampfers, bis sich ein dünner Film im Fläschchen bildet.Überführen Sie anschließend zwei Milliliter Dulbeccos phosphatgepufferte Salzlösung, pH 7,4 in das Glasfläschchen. Wählen Sie ein Ultraschallbad, das ausreichende Ultraschallleistung erzeugen kann, um den dünnen Polymer-Wirkstoff-Film zu dispergieren. Die Ausgangsleistung des in diesem Protokoll verwendeten Ultraschallbads beträgt 110 Watt.Stellen Sie das Gefäß drei Minuten lang bei Raumtemperatur in ein Ultraschallbad, um Mizellen zu bilden. Lagern Sie die Mizellen kurzfristig bei vier Grad Celsius und langfristig bei minus 20 Grad Celsius. Führen Sie nach der Herstellung der Mizellen verschiedene Charakterisierungen durch, um die Arzneimittelkonzentration in den Mizellen, die Partikelgrößen sowie die in-vitro-Antikrebsaktivitäten zu bestimmen.Um die DOX-PA-Konzentration und die Einschließungseffizienz des Wirkstoffs zu bestimmen, verdünnen Sie 25 Mikroliter beladene Mizellen mit 500 Mikrolitern DMSO. Messen Sie die Absorption bei 490 Nanometern mit einem UV-VIS-Spektrometer und berechnen Sie die Wirkstoffkonzentrationen sowie die Einschließungseffizienz, wie im textlichen Protokoll beschrieben. Um die antikanzeröse Wirkung in vitro zu bewerten, geben Sie die verdünnten Zellsuspensionen je 100 Mikroliter pro Vertiefung in eine 96-Loch-Zellkulturplatte.Inkubieren Sie die Zellen 18 Stunden lang in einem Zellkulturschrank, um die Zelladhäsion zu ermöglichen. Verdünnen Sie anschließend eine DOX-DMSO-Lösung und eine DOX-PA-DMSO-Lösung mit Zellkulturmedium, um die gewünschten Endkonzentrationen des Wirkstoffs zu erhalten. Achten Sie darauf, dass die Endkonzentration von DMSO in allen Proben bei 0,5 % liegt. Verdünnen Sie danach die DOX-PA-Micellen mit Zellkulturmedium, um die gewünschten Endkonzentrationen des Wirkstoffs zu erreichen.Verwenden Sie das leere Zellkulturmedium als Kontrolle. Entnehmen Sie die 96-Loch-Zellkulturplatte dem Inkubator und ersetzen Sie das Zellkulturmedium durch 100 Mikroliter Medium, das verschiedene Behandlungsstoffe enthält. Inkubieren Sie die Zellen im Zellkulturinkubator für weitere 72 Stunden.Als Nächstes das Medium abpipettieren und 100 Mikroliter Medium mit 0,5 Milligramm pro Milliliter MTT hinzufügen. Die Zellen weitere zwei Stunden im Zellkultur-Inkubator inkubieren. Das Medium vorsichtig entfernen und 100 Mikroliter DMSO hinzufügen, um die Formazankristalle aufzulösen.Messen Sie die Extinktion mit dem Mikroplatten-Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 570 Nanometern und einer Referenzwellenlänge von 670 Nanometern. Berechnen Sie abschließend die Zellviabilität, wie im Textprotokoll beschrieben. Das Syntheseschema von DOX-PA ist hier dargestellt.Palmitinsäure ist über einen pH-empfindlichen Hydrazin-Linker an Doxorubicin gebunden. Die Struktur von DOX-PA wurde durch ein Protonen-NMR-Spektrum weiter bestätigt. Charakteristische NMR-Signale sowohl von Doxorubicin als auch von Palmitinsäure sind nachweisbar.Buchstaben kennzeichnen die Peaks und die entsprechenden Strukturelemente innerhalb der Verbindung. Leere DSPE-PEG-Mizellen ohne Wirkstoff erscheinen als transparente Flüssigkeit, während DOX-PA-beladene DSPE-PEG-Mizellen als rote Flüssigkeit erscheinen, was auf das in den Mizellen enthaltene DOX-PA zurückzuführen ist. Die mittlere Partikelgröße leerer DSPE-PEG-Mizellen beträgt etwa 17,0 Nanometer.Die Beladung mit DOX-PA erhöhte die Größe der Mizellenpartikel leicht, wobei die mittlere Partikelgröße von DOX-PA-DSPE-PEG-Mizellen bei etwa 25,7 Nanometern lag. Durch die Behandlung von DU145-Zellen mit freiem Doxorubicin, freiem DOX-PA oder DOX-PA-Mizellen wurde eine konzentrationsabhängige Verringerung der Zellviabilität erzielt. Obwohl freies Doxorubicin bei niedrigeren Konzentrationen wirksamer ist als freies DOX-PA oder DOX-PA-Mizellen, zeigten die DOX-PA-Gruppen bei höheren Konzentrationen eine stärkere Abnahme der Zellviabilität im Vergleich zu freiem Doxorubicin.Außerdem scheint es keinen signifikanten Unterschied zwischen DOX-PA und DOX-PA-Micellen bei höheren und niedrigeren Konzentrationen zu geben. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Micell-Formulierungen mit einer Filmdispersionsmethode herstellt. Es ist wichtig zu beachten, dass die beschriebene Methode zur Herstellung von Micellen mit verschiedenen Wirkstoffen und Trägermaterialien verwendet werden kann.Die Gestaltung des Trägermaterials ist entscheidend, um die Formulierungsleistung zu verbessern. Anschließend kann die Mizellenformulierung an tierischen Tumormodellen in vivo hinsichtlich ihrer Antitumoraktivität überprüft werden.

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Forschung

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Biotechnik

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Herstellung und Charakterisierung von physikalisch eingeschlossenen, schwer wasserlöslichen Arzneimitteln in mizellaren Wirkstoffabgabesystemen zu beschreiben, die aus amphiphilen Blockcopolymeren bestehen.

Herstellung und Charakterisierung von Einzel-und Multi-Wirkstoff beladen Körperlich Eingeschlossene Polymermicellen

Wir berichten über eine intelligente Anwendung von Kohlenstoffnanoröhren zur kinetischen Stabilisierung von Lipidpartikeln, die selbstorganisierte Nanostrukturen in ihren Kernen enthalten. Die Herstellung von Lipidpartikeln erfordert relativ geringe Konzentrationen von Kohlenstoffnanoröhren, die ihren Einsatz in biomedizinischen Anwendungen wie der Verabreichung von Medikamenten ermöglichen.

Facile Herstellung von Intern Selbstorganisierte Lipidpartikel stabilisiert durch Kohlenstoff-Nanoröhren

Die Schlüsselschritte der lebenden anionischen Polymerisation von Phenylglycidylether (PheGE) auf Methoxypolyethylenglykol (MPEG - b -PPheGE) beschrieben. Die resultierenden Blockcopolymermizellen (BCMs) wurden unter physiologisch relevanten Bedingungen wurde mit Doxorubicin 14% (wt%) und eine verzögerte Freisetzung des Arzneimittels über 4 Tage geladen erhalten.

Die anionische Polymerisation eines amphiphilen Copolymer zur Herstellung von Blockcopolymermicellen Stabilisiert durch π-π-Stapelwechselwirkungen

Um Krebsmedikamente mit hoher Spezifität und reduzierten Nebenwirkungen an Tumorstellen zu bringen, sind neue Methoden auf Basis von Nanopartikeln erforderlich. Hier beschreiben wir disulfidvernetzte Mizellen, die durch Wasserstoffperoxid-vermittelte Oxidation leicht hergestellt werden können und in der Lage sind, unter einer reduzierenden Tumorumgebung effizient zu dissoziieren, um Nutzlasten freizusetzen.

Eine leichte und effiziente Ansatz für die Produktion von Reversible Disulfid Vernetzte Mizellen

Eine Flüssigkristall-Nanopartikel (LCNP) Nanotransporter wird als Träger für die kontrollierte Abgabe eines hydrophoben Ladung an die Plasmamembran lebender Zellen ausgenutzt.

Gezielte Plasma Membrane Lieferung eines Hydrophobic Transport Encapsulated in einem Liquid Crystal Nanoparticle Träger

Live Cell Imaging ist ein mächtiges Werkzeug, um dynamische Prozesse zu visualisieren. Die Prüfung der fixen Zellen bietet nur statische Bilder, was zu Fehlinterpretationen und Verwirrung über den Prozess führen kann. Dieses Werk stellt eine Methode zur Aufnahme, Wirkstofffreisetzung und intrazelluläre Lokalisation der liposomalen Nanopartikel in lebenden Zellen zu studieren.

Verwendung von In-vitro- Live Cell Imaging zur Erkundung Chemotherapeutika geliefert durch Lipid-basierte Nanopartikel

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente und komfortable analytischen Prozess der Probengewinnung und gleichzeitige Bestimmung von mehreren Medikamenten, Doxorubicin (DOX), Mitomycin C (MMC) und ein Cardio-toxische DOX Metabolit, Doxorubicinol (DOXol), in der biologischen Proben aus einem präklinischen Brust-Tumor-Modell mit Nanopartikel Formulierungen von synergistischen Arzneimittelkombination behandelt.

Probengewinnung und gleichzeitige chromatographische Quantifizierung von Doxorubicin und Mitomycin C nach Kombination Medikamentenabgabe in Nanopartikel zur Tumor-tragenden Mäusen

Diese Studie beschreibt die klassische Hydratation mit der Dünnschichtmethode zur Nanoliposomenpräparation, gefolgt von der Nanopartikelcharakterisierung. Ein 47 kDa-hydrophiles und kugelförmiges Protein, Tarin, wird erfolgreich als Strategie zur Verbesserung der Stabilität verkapselt, schnelle Clearance vermieden und eine kontrollierte Freisetzung gefördert. Die Methode kann an hydrophobe Moleküle angepasst werden.

Vorbereitung und Charakterisierung von Nanoliposomen zur Entrapment ierung bioaktiver hydrophiler Globularproteine

Das Protokoll stellt die optimierten Parameter für die Herstellung thermoempfindlicher Liposomen mit dem gestaffelten Fischgrät-Mikrofluidikgerät vor. Dies ermöglicht auch die Kokapselung von Doxorubicin und Indocyaningrün in die Liposomen und die photothermal ausgelöste Freisetzung von Doxorubicin zur kontrollierten/ausgelösten Wirkstofffreisetzung.

Mikrofluidische Produktion von Lysolipid-haltigen temperaturempfindlichen Liposomen

In diesem Protokoll werden doxorubicin-geladene AS1411-g-PEI-g-PEG modifizierte Gold-Nanopartikel über dreistufige Amidreaktionen synthetisiert. Dann wird Doxorubicin geladen und an Zielkrebszellen für die Krebstherapie geliefert.

Synthese von Aptamer-PEI-g-PEG Modifizierte Gold-Nanopartikel, die mit Doxorubicin für die gezielte Arzneimittelabgabe geladen werden

Erfahren Sie die Herstellung und Charakterisierung lipophiler Doxorubicin-Prodrug-Mizellen. Diese Methode verbessert die Arzneistoffbeladung und Stabilität für eine gezielte Tumortherapie mit reduzierter Toxizität.

Herstellung und Charakterisierung von Lipophile Doxorubicin Pro-drug Mizellen

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