Vergleich von Tabakwirtszellprotein Abbaumethoden von Intact Pflanzen oder Blanchieren durch Wärmebehandlung von Extrakten
8. August 2016
Drei Wärmefällungsverfahren vorgestellt werden, die effektiv mehr als 90% der Wirtszellproteine (HCP) von Tabak entfernen Extrakte vor jeder anderen Reinigungsschritt. Die Anlage HCPs aggregieren irreversibel bei Temperaturen über 60 ° C.
Das übergeordnete Ziel dieser Versuchsreihe besteht darin, pflanzliche Wirtszellenproteine durch Hitze auszufällen, um so die anschließende chromatographische Reinigung rekombinanter biopharmazeutischer Proteine zu erleichtern. Diese Methode kann dazu beitragen, die Prozessentwicklung zu optimieren und die Produktstabilität zu erhöhen, beispielsweise durch Aktivierung von Wirtsproteasen.
Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie leicht in bestehende Proteasen integriert werden kann und schnell an verschiedene Zielproteine angepasst werden kann. Den Ablauf wird Hannah Gruchow, eine Masterstudentin aus meinem Labor, demonstrieren. Um Wirtszellproteine durch Erhitzen auszufällen.
Zum Beispiel aus Tabakblättern. Nach dem Kultivieren von Tabakpflanzen gemäß dem schriftlichen Protokoll richten Sie ein acht Liter fassendes Wasserbad in einem thermisch isolierten Polystyrol-Eimer ein. Übertragen Sie die gesamte Apparatur auf einen magnetischen Rührer und geben Sie einen Magnetrührstab in das Wasserbad.
Danach den Rührstab mit einer nichtmagnetischen Stützplatte umgeben, sodass die Stützplatte etwa einen Zentimeter über dem Rührstab abschließt. Auf diese wird im weiteren Verlauf des Verfahrens ein Polypropylenkorb gesetzt. Acht Liter Puffer in das Wasserbad geben.
Danach einen 23 mal 23 mal 23 Zentimeter großen Polypropylenkorb auf die Stützplatten stellen. Sicherstellen, dass die Stütze die Rührstabrotation nicht behindert und der Korb vollständig in der Flüssigkeit eingetaucht ist. Anschließend den Korb entfernen.
Verwenden Sie einen einstellbaren Thermostaten, um das Wasserbad auf 70 Grad Celsius zu bringen. Warten Sie mindestens 15 Minuten, nachdem die gewünschte Temperatur erreicht ist, um sicherzustellen, dass die gesamte Apparatur das thermische Gleichgewicht erreicht hat. Bereiten Sie anschließend 150-Gramm-Aliquote aus den Tabakblättern vor.
Legen Sie eine Portion in den Korb, wobei irreversible Kompression und Beschädigung der Blätter vermieden werden müssen, z. B. durch Einreißen. Tauchen Sie den Korb vorsichtig, aber zügig in die heiße Flüssigkeit und stellen Sie ihn auf die Stützplatten.
Dann einen Edelstahlblock auf den Korb legen, um Auftrieb zu verhindern. Die Blätter fünf Minuten lang in der Blanchierflüssigkeit inkubieren. Oder eine für den Versuchsansatz geeignete Zeit wählen.
Überwachen Sie die Flüssigkeitstemperatur während des gesamten Inkubationszeitraums. Entfernen Sie nach der Inkubation vorsichtig den Korb aus der Blanchierflüssigkeit und lassen Sie die Blätter 30 Sekunden lang abtropfen. Nehmen Sie anschließend die Pflanzenblätter aus dem Korb, überführen Sie sie in den Mixer und beginnen Sie unmittelbar mit der Extraktion gemäß den schriftlichen Protokollen.
Um HCPs in einem gerührten Gefäß durch Erhitzen auszufällen. Stellen Sie ein Wasserbad auf eine magnetische Rührplatte und setzen Sie ein zwei Liter fassendes Edelstahlgefäß in das Wasserbad ein, sodass die Mitte des Gefäßes mit der Mitte der Rührplatte ausgerichtet ist. Geben Sie einen magnetischen Rührstab in das Edelstahlgefäß.
Füllen Sie das Gefäß mit Extraktionspuffer. Danach mit entionisiertem Wasser. Füllen Sie das Wasserbad bis fünf Zentimeter unterhalb der oberen Kante des Edelstahlgefäßes.
Decken Sie es mit einem Deckel aus Polystyrolschaum ab. Stecken Sie anschließend ein Thermometer durch ein Dämpfungsloch im Deckel in das Edelstahlgefäß. Stellen Sie dann die Wassertemperatur auf 78 Grad Celsius ein und inkubieren Sie die gesamte Apparatur 15 Minuten lang, um das thermische Gleichgewicht zu erreichen.
Wenn die Apparatur das Gleichgewicht erreicht hat, leeren Sie das Gefäß und geben Sie 300 Milliliter Extrakt in das Gefäß, während es sich noch im Wasserbad befindet, und starten Sie die Stoppuhr. Rühren Sie den Extrakt 5 Minuten lang bei 150 U/min unter Inkubation. Stellen Sie sicher, dass der Extrakt während der Inkubationszeit mindestens zwei Minuten lang eine Temperatur von 70 Grad Celsius erreicht.
Nach der Inkubation das heiße Wasserbad vom Magnetrührer entfernen. Den Edelstahlbehälter herausnehmen und in einen Eimer mit eiskaltem Wasser stellen. Anschließend den Eimer auf die Rührplatte setzen.
Stellen Sie sicher, dass das Pflanzenhomogenat gut bei 150 U/min durchmischt wird. Platzieren Sie das Thermometer im Extrakt und inkubieren Sie ihn, bis er eine Temperatur von 20 Grad Celsius oder der angegebenen Temperatur erreicht hat. Nachdem zwei Wasserbäder mit einem Arbeitsvolumen von jeweils acht Litern gemäß dem Textprotokoll eingerichtet wurden, füllen Sie das erste Bad mit entionisiertem Wasser.
Stellen Sie den Thermostaten auf 74,5 Grad Celsius ein und inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang, um das thermische Gleichgewicht zu erreichen. Bereiten Sie ein isoliertes Aufbewahrungsgefäß vor, indem Sie einen 0,5-Liter-Kunststoffbecher in einen 1-Liter-Kunststoffbecher stellen. Füllen Sie die Zwischenräume mit einem Isoliermaterial wie Watte.
Verbinden Sie den Wärmetauscher mit einem Schlauch der Bezeichnung LS24 an einem Ende mit einer peristaltischen Pumpe und am anderen Ende mit einem Ablaufschlauch. Legen Sie beide Schlauchenden zusammen mit dem Thermometer in das isolierte Lagervessel und füllen Sie es mit 300 Millimetern Extraktionspuffer.
Als Nächstes platzieren Sie den Wärmetauscher in das heiße Wasserbad und starten die peristaltische Pumpe mit einer Geschwindigkeit von 300 Millilitern pro Minute. Nach drei Minuten stellen Sie sicher, dass die resultierende Temperatur im Behälter 70 Grad Celsius beträgt, etwa 4,5 Grad Celsius unterhalb des Sollwerts des Wasserbads.
Entfernen Sie den Extraktionspuffer aus dem isolierten Gefäß und bereiten Sie 300 Milliliter-Aliquote des Pflanzenextrakts vor. Füllen Sie dann mit einem Aliquot das isolierte Gefäß. Pumpen Sie anschließend den Pflanzenextrakt fünf Minuten lang mit 300 Milliliter pro Minute durch den Wärmetauscher.
Danach sicherstellen, dass die Extrakttemperatur nach drei Minuten 70 Grad Celsius beträgt oder der in der Versuchsplanung festgelegten Temperatur entspricht. Nach fünf Minuten den Wärmetauscher in ein Eiswasserbad überführen. Sicherstellen, dass die Temperatur des Extrakts vor Fortsetzung unter 30 Grad Celsius liegt.
Entfernen Sie den Schlauch am Einlass, der mit der peristaltischen Pumpe verbunden ist, aus dem isolierten Behälter. Pumpen Sie weiter, um den im Wärmetauscher verbliebenen, durch Hitze ausgefällten Pflanzenextrakt zu sammeln. Danach stoppen Sie die Pumpe.
Um die Sackfiltration des Pflanzenextrakts durchzuführen, montieren Sie einen Sackfilter in den entsprechenden Trägerkorb, der in das Filtergehäuse eingefügt ist. Stellen Sie ein einliteriges Gefäß unter den Korb und geben Sie die Extrakt-Aliquote mit einer Geschwindigkeit von 150 Milliliter pro Minute auf den Sack. Messen Sie nach der Filtration die Trübung einer 1:10-Verdünnung des Filtrats im Extraktionspuffer mithilfe eines Trübmessgeräts.
Portionieren Sie eine 1 mL-Probe und verarbeiten Sie das Beutelfiltrat. Zum Beispiel durch Tiefenfiltration und Chromatographie. Analysieren Sie die Probe anschließend gemäß dem schriftlichen Protokoll.
Die Hitzefällung von Wirtszellproteinen durch Blanchieren verringert das gesamte lösliche Protein (TSP) um 96 ± 1 Prozent. Durch das Blanchieren wurden bis zu 83 ± 1 Prozent von DsRed und 51 Prozent des Zielproteins Vax8 zurückgewonnen. Dadurch erhöhte sich die Reinheit vor der chromatographischen Trennung von 0,1 Prozent auf 1,2 Prozent.
Die Filterkapazität nahm bei Blanchiertemperaturen über 63 Grad Celsius ab. Dies kann durch Zugabe von Flockungsmitteln nach der Proteingewinnung und Filterhilfsmitteln nach der Beutelfiltration behoben werden. Ein Rührbehälter zur thermischen Fällung entfernte maximal 84 ± 1 Prozent der HCPs.
Eine Reinheit von 0,33 ± 0,02 Prozent für Vax8 und 20,2 ± 1,4 Prozent für DsRed erreicht. Im Gegensatz zur Blanchierung und der Wärmetauscheranordnung erhöht die HCP-Fällung in einem Behälter die Kapazität der nachgeschalteten Tiefenfiltration um das 2,5-Fache, was den geringeren Scherkräften im Behälter im Vergleich zum Pumpen des Extrakts durch den Wärmetauscher oder die Homogenisierung nach der Blanchierung entspricht.
Etwa 88,3 ± 0,7 Prozent des HCP-Gehalts wurden mithilfe eines Wärmetauschers zwischen 60 und 70 Grad Celsius durchgängig aus dem Extrakt entfernt. Dabei wurde eine Reinheit von 0,31 ± 0,01 Prozent für Vax8 und 27,6 ± 2,0 Prozent für DsRed erreicht.
Schließlich erreichte der Wärmetauscher auch die geringste Durchflussmenge des nachgeschalteten Tiefenfilters. Er klärt nur 13,5 ± 6,0 Liter pro Quadratmeter, bevor er verstopft. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie in weniger als 50 Minuten pro Probe durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.
Bei der Anwendung dieser Methode ist es wichtig, darauf zu achten, dass das Zielprotein hitzestabil ist. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Chromatographie durchgeführt werden, um das Produkt auf das erforderliche Maß weiter zu reinigen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Pflanzen mithilfe einer Technologie den Weg zur Erforschung der Reinigung von vakzinenrelevanten Proteinen und Nicotiana-Arten.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie pflanzliche Wirtszellproteine mithilfe von Blanchieren, Rührbehälter oder Wärmetauscher ausgefällt werden können.
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Übersicht
Diese Studie stellt drei Hitzefällungsmethoden vor, die über 90 % der Wirtszellproteine (HCPs) aus Tabakextrakten effektiv entfernen. Die Methoden erleichtern nachfolgende Reinigungsschritte für rekombinante biopharmazeutische Proteine.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biotechnologie
- Proteinaufreinigung
- Pharmazeutische Entwicklung
Hintergrund
- Wirtszellproteine können die Reinigung rekombinanter Proteine stören.
- Die Wärmepräzipitation ist eine Technik zur Entfernung unerwünschter Proteine.
- Eine wirksame Entfernung von HCPs ist entscheidend für die Produktstabilität.
- Diese Methode kann für verschiedene Zielproteine angepasst werden.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Fällung pflanzlicher Wirtszellproteine mittels Hitzebehandlung.
- Vereinfachung der Prozessentwicklung rekombinanter Biopharmazeutika.
- Verbesserung der Stabilität des Endprodukts.
Verwendete Methoden
- Wärmepräzipitation von Tabakextrakten.
- Temperaturkontrolle zur Induktion der Proteinaggregation.
- Anschließende chromatographische Reinigungstechniken.
- Demonstration durch eine Masterstudentin im Labor.
Hauptergebnisse
- Mehr als 90 % der HCPs wurden aus den Extrakten entfernt.
- Die Wärmebehandlung führte ab 60 °C effektiv zur Aggregation pflanzlicher HCPs.
- Die Methode ist einfach zu implementieren und anpassungsfähig.
- Erleichterte die Reinigung rekombinanter Proteine.
Schlussfolgerungen
- Die Wärmepräzipitation ist eine geeignete Methode zur Entfernung von HCP.
- Diese Technik kann die Effizienz von Proteinreinigungsverfahren verbessern.
- Weitere Studien könnten ihre Anwendung auf andere Proteine untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Kontamination mit Wirtszellproteinen (HCP) stellt weiterhin eine kritische Engstelle bei der Reinigung biopharmazeutischer Wirkstoffe dar, insbesondere in pflanzlichen Expressionssystemen, bei denen hohe HCP-Konzentrationen die chromatographische Effizienz beeinträchtigen. In dieser Studie werden drei skalierbare Methoden zur Wärmepräzipitation – das Blanchieren intakter Tabakblätter, die Behandlung in gerührten Reaktoren und die Aufbereitung mittels Wärmetauscher – untersucht, um HCPs selektiv bei Temperaturen über 60 °C zu aggregieren und zu entfernen, wodurch die Ergebnisse der nachgeschalteten Reinigung verbessert werden. Da diese Ansätze eine höhere Reinheit des Zielproteins bereits vor der Chromatographie ermöglichen, tragen sie zur Prozessintensivierung bei, verringern den Pufferverbrauch und steigern die gesamte Herstellungsrobustheit für in Pflanzen produzierte Impfstoffkandidaten und therapeutische Proteine.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die funktionelle Beurteilung von Zielproteinen, indem HCP-Störungen in frühen Reinigungsverfahren reduziert werden.
- Operationaler Wert: Bietet einen schnellen, hitzebasierten Klärungsschritt, der mit der Expressionsanalyse im kleinen Maßstab in Nicotiana spp. kompatibel ist.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt geklärte Extrakte mit reduziertem HCP-Hintergrund, wodurch die Signal-Rausch-Verhältnisse bei nachgeschalteten Immunassays und Aktivitätsmessungen verbessert werden.
- Operativer Wert: Standardisiert die Aufbereitung des Ausgangsmaterials, um eine konsistente chromatographische Leistung über mehrere Wiederholungen hinweg zu gewährleisten.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Herstellung von Impfstoffkandidaten wie Vax8 mit verbesserter Reinheit, was die Beurteilung von Immunogenität und Sicherheit erleichtert.
- Operationaler Wert: Kann in bestehende Perfusions- oder Batch-Harvest-Prozesse integriert werden, ohne dass eine genetische Modifikation des Wirts erforderlich ist.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Wärmepräzipitation fungiert als Verfahrensschritt zwischen der Ernte und der Chromatographie und ist in rekombinanten Proteinverfahren auf Pflanzenbasis von der frühen Entdeckung bis zur Erzeugung präklinischer Mengen anwendbar.
- Entdeckungsbioanalytik: Verringert HCP-verursachtes Rauschen bei der Detektion des Zielproteins und unterstützt die mechanistische Entlastung therapeutischer Kandidaten.
- Screening: Verbessert die Klarheit und Filterbarkeit von Extrakten und ermöglicht zuverlässige Hochdurchsatz-Reinigungs-Screenings.
- Analytik: Liefert quantifizierbare Angaben zur HCP-Reduktion (z. B. 84–96 % Entfernung) und Reinheitsgewinne (z. B. DsRed von 0,1 % auf 27,6 %) für den Prozessvergleich.
- Translationale Forschung: Erhält die Integrität des Zielproteins (z. B. Vax8, DsRed) nach der Behandlung und ermöglicht nahtlose Fortschritte zur Formulierung und Wirksamkeitsprüfung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Übertragbar auf verschiedene Pflanzenexpressionssysteme und Zielproteine mit minimalem Wiederzulassungsaufwand und somit geeignet für die Implementierung auf Plattformebene.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagbare Zuverlässigkeit bei Reinigungsergebnissen durch konsistente HCP-Depletion und verringerte chromatographische Verschmutzung.
- Operationaler Wert: Erhöhung der Kapazität von Tiefenfiltern in der nachgeschalteten Verarbeitung (bis zum 2,5-Fachen im Rührbehälter) und Verringerung der Häufigkeit des Pufferaustauschs.
- Strategischer Wert: Verringerung des Herstellungsrisikos durch frühzeitige Entfernung von Prozessverunreinigungen und somit geringere Wahrscheinlichkeit von Fehlschlägen in späteren Produktionsstadien.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung pflanzlich hergestellter Kandidaten durch Verbesserung früher Entwickelbarkeitskennzahlen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der thermischen Prozesssteuerung und der Beurteilung der Proteinstabilität, um eine Denaturierung des Zielproteins zu vermeiden.
- Hängt von der Verfügbarkeit temperaturgeregelter Behälter, Wärmetauscher oder Blanchierausrüstung mit präziser Rühreinrichtung und Überwachungsmöglichkeiten ab.
- Erfordert eine Standardisierung von Blanchierdauer, Temperatur und Geometrie der Behälter über verschiedene Standorte hinweg, um eine reproduzierbare HCP-Entfernung zu gewährleisten.
- Beinhaltet Abwägungen: Blanchieren kann die Filterkapazität verringern, während der Einsatz von Wärmetauschern Reinigungsprobleme mit sich bringt, trotz guter Skalierbarkeit.
- Erfordert eine empirische Optimierung mittels Versuchsplanung (Design-of-Experiments), um die HCP-Entfernung, Produktausbeute und die Handhabbarkeit im Downstream-Prozess für jedes Zielprotein auszugleichen.
