Vergleich von Tabakwirtszellprotein Abbaumethoden von Intact Pflanzen oder Blanchieren durch Wärmebehandlung von Extrakten

Das übergeordnete Ziel dieser Versuchsreihe ist es, pflanzliche Wirtszellproteine mit Hilfe von Hitze auszufällen. Dies erleichtert die anschließende chromatographische Aufreinigung von rekombinanten biopharmazeutischen Proteinen. Diese Methode kann dazu beitragen, die Prozessentwicklung zu rationalisieren und die Produktstabilität zu erhöhen, zum Beispiel durch die Aktivierung von Wirtsproteasen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie sich leicht in bestehende Proteasen implementieren lässt und schnell an verschiedene Zielproteine angepasst werden kann. Vorführen wird das Verfahren von Hannah Gruchow, einer Masterstudentin aus meinem Labor. Zum Erhitzen fallen Sie Proteine der Wirtszelle aus.

Zum Beispiel aus Tabakblättern. Nach der Kultivierung der Tabakpflanzen nach dem Textprotokoll ein Wasserbad mit acht Litern Arbeitsvolumen in einem wärmeisolierten Styropor-Schaumeimer aufstellen. Übertragen Sie die gesamte Baugruppe auf eine magnetische Rührplatte und legen Sie einen Magnetstab in das Wasserbad.

Umgeben Sie dann den Rührstab mit einer nichtmagnetischen Stützkachel, die den Rührstab um etwa einen Zentimeter überragt. Darauf wird später während des Eingriffs ein Polypropylenkorb gestellt. Geben Sie acht Liter Puffer in das Wasserbad.

Stellen Sie dann einen 23 x 23 x 23 Zentimeter großen Polypropylenkorb auf die Stützplatten. Sicherstellen, dass die Halterung die Drehung des Rührstabs nicht beeinträchtigt und dass der Korb vollständig in die Flüssigkeit eingetaucht ist. Dann den Korb entfernt.

Verwenden Sie ein einstellbares Thermostat, um das Wasserbad auf 70 Grad Celsius zu bringen. Warten Sie mindestens 15 Minuten, nachdem die gewünschte Temperatur erreicht ist, um sicherzustellen, dass die gesamte Baugruppe das thermische Gleichgewicht erreicht hat. Bereiten Sie anschließend 150 Gramm Aliquots aus den Tabakblättern vor.

Legen Sie ein Aliquot in den Korb und vermeiden Sie dabei eine irreversible Kompression und Beschädigung der Blätter. Zum Beispiel durch Tearing. Tauchen Sie den Korb vorsichtig, aber schnell in die heiße Flüssigkeit und stellen Sie ihn auf die Stützplatten.

Legen Sie dann einen Edelstahlblock auf den Korb, um ein Aufschwimmen zu verhindern. Inkubieren Sie die Blätter fünf Minuten lang in der Blanchierflüssigkeit. Oder wählen Sie einen Zeitpunkt, der für das Versuchsdesign geeignet ist.

Überwachen Sie die Flüssigkeitstemperatur während der gesamten Inkubationszeit. Nach der Inkubation den Korb vorsichtig aus der Blanchierflüssigkeit nehmen und die Blätter 30 Sekunden lang abtropfen lassen. Nehmen Sie dann die Pflanzenblätter aus dem Korb, geben Sie sie in den Mixer und beginnen Sie sofort mit der Extraktion gemäß den Textprotokollen.

Zum Erhitzen der HCPs in einem gerührten Gefäß. Übertragen Sie ein Wasserbad auf eine magnetische Rührplatte und stellen Sie ein Zwei-Liter-Edelstahlgefäß so in das Wasserbad, dass die Mitte des Gefäßes mit der Mitte der Rührplatte ausgerichtet ist. Legen Sie einen Magnetrührstab in das Edelstahlgefäß.

Füllen Sie das Gefäß mit Extraktionspuffer. Dann mit dem entionisierten Wasser. Füllen Sie das Wasserbad bis zu fünf Zentimeter unter den oberen Rand des Edelstahlgefäßes.

Verwende einen Deckel aus Polystyrolschaum, um ihn abzudecken. Führen Sie anschließend ein Thermometer durch ein beruhigendes Loch im Deckel in das Edelstahlgefäß ein. Stellen Sie dann die Temperatur im Wasserbad auf 78 Grad Celsius ein und inkubieren Sie die gesamte Baugruppe 15 Minuten lang, um das thermische Gleichgewicht zu erreichen.

Wenn die Anlage das Gleichgewicht erreicht hat, leeren Sie das Gefäß und gießen Sie 300 Milliliter Extrakt in das Gefäß, während es sich noch im Wasserbad befindet, und starten Sie den Timer. Rühren Sie den Extrakt bei 150 U/min um, während Sie ihn fünf Minuten lang inkubieren. Stellen Sie sicher, dass der Extrakt während der Inkubationszeit mindestens zwei Minuten lang eine Temperatur von 70 Grad Celsius erreicht.

Nach der Inkubation das Heißwasserbad aus dem Magnetrührer nehmen. Nehmen Sie das Edelstahlgefäß heraus und stellen Sie es in einen Eimer mit eiskaltem Wasser. Stellen Sie dann den Eimer auf die Rührplatte.

Stellen Sie sicher, dass das Pflanzenhomogenat bei 150 U/min gut gerührt wird. Legen Sie das Thermometer in den Extrakt und inkubieren Sie es, bis es eine Temperatur von 20 Grad Celsius oder die angegebene Temperatur erreicht. Nachdem Sie zwei Wasserbäder mit einem Arbeitsvolumen von acht Litern gemäß dem Textprotokoll eingerichtet haben, verwenden Sie deionisiertes Wasser, um das erste Bad zu füllen.

Stellen Sie den Thermostat auf 74,5 Grad Celsius ein und inkubieren Sie die Baugruppe 15 Minuten lang, um ein thermisches Gleichgewicht zu erreichen. Bereiten Sie ein isoliertes Vorratsgefäß vor, indem Sie ein 0,5-Liter-Plastikbecherglas in ein Ein-Liter-Kunststoffbecherglas einsetzen. Und verwenden Sie ein Isolationsmaterial wie Watte, um die Lücken zu füllen.

Verbinden Sie den Wärmetauscher mit einem LS24-Schlauch an einem Ende mit einer Schlauchpumpe und am anderen Ende mit einem Auslassschlauch. Legen Sie beide Schlauchenden zusammen mit dem Thermometer in das isolierte Vorratsgefäß. Und füllen Sie ihn mit 300 Millimetern Extraktionspuffer.

Stellen Sie dann den Wärmetauscher in das Heißwasserbad und starten Sie die Schlauchpumpe mit einer Geschwindigkeit von 300 Millilitern pro Minute. Stellen Sie nach drei Minuten sicher, dass die resultierende Temperatur im Gefäß 70 Grad Celsius beträgt. Etwa 4,5 Grad Celsius unter dem Sollwert des Wasserbads.

Entsorgen Sie den Extraktionspuffer aus dem isolierten Gefäß und bereiten Sie 300 Milliliter Aliquots des Pflanzenextrakts vor. Füllen Sie dann das isolierte Gefäß mit einem Aliquot. Pumpen Sie nun den Pflanzenextrakt mit 300 Millilitern pro Minute für fünf Minuten durch den Wärmetauscher.

Stellen Sie dann sicher, dass die Extrakttemperatur nach drei Minuten 70 Grad Celsius beträgt oder der Temperatur entspricht, die im Versuchsdesign zu finden ist. Übertragen Sie den Wärmetauscher nach fünf Minuten in das eiskalte Wasserbad. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur des Extrakts unter 30 Grad Celsius liegt, bevor Sie fortfahren.

Entfernen Sie den an die Schlauchpumpe angeschlossenen Zulaufschlauch aus dem isolierten Behälter. Und pumpen Sie weiter, um die Restwärme des gefällten Pflanzenextrakts aus dem Inneren des Wärmetauschers zu sammeln. Stoppen Sie dann die Pumpe.

Um eine Beutelfiltration des Pflanzenextrakts durchzuführen, wird ein Beutelfilter in den entsprechenden Stützkorb eingebaut, der in das Filtergehäuse eingebaut ist. Stellen Sie ein Ein-Liter-Gefäß unter den Korb und tragen Sie die Extrakt-Aliquots mit einer Geschwindigkeit von 150 Millilitern pro Minute auf den Beutel auf. Verwenden Sie nach der Filtration ein Trübungsmessgerät, um die Trübung einer Verdünnung von Filtrat von 1 bis 10 im Extraktionspuffer zu messen.

Aliquotieren Sie eine Probe von einem Milliliter und verarbeiten Sie das Beutelfiltrat. Zum Beispiel durch Tiefenfiltration und Chromatographie. Analysieren Sie die Probe weiter gemäß dem Textprotokoll.

Die Hitzefällung von Wirtszellproteinen durch Blanchieren reduziert das gesamte lösliche Protein (TSP) um 96 plus oder minus ein Prozent. Durch das Blanchieren wurden bis zu 83 plus oder minus ein Prozent DsRed und 51 Prozent des Vax8-Zielproteins zurückgewonnen. Erhöhung der Reinheit von 0,1 Prozent auf 1,2 Prozent vor der chromatographischen Trennung.

Bei Blanchiertemperaturen über 63 Grad Celsius nahm die Filterkapazität ab. Dies kann durch die Zugabe von Flockungsmitteln nach der Proteinextraktion und Filterhilfsmitteln nach der Schlauchfiltration behoben werden. Ein gerührtes Gefäß für die Wärmefällung entfernte maximal 84 plus oder minus ein Prozent HCPs.

Erreicht wird eine Reinheit von 0,33 plus oder minus 0,02 Prozent für Vax8 und 20,2 plus oder minus 1,4 Prozent für DsRed. Im Gegensatz zum Blanchieren und dem Aufbau des Wärmetauschers erhöht die HCP-Fällung in einem Behälter die Kapazität der nachgeschalteten Tiefenfiltration um das 2,5-fache. Dies spiegelt die geringeren Scherkräfte im Behälter wider, verglichen mit dem Pumpen von Extrakt durch den Wärmetauscher oder der Homogenisierung nach dem Blanchieren.

Etwa 88,3 plus/minus 0,7 Prozent des HCP-Gehalts wurden mit einem Wärmetauscher zwischen 60 und 70 Grad Celsius konsequent aus dem Extrakt entfernt. Erreichen einer Reinheit von 0,31 plus oder minus 0,01 Prozent für Vax8. Und 27,6 plus oder minus 2,0 Prozent für DsRed.

Schließlich erreichte der Wärmetauscher auch die geringste nachgeschaltete Tiefenfilterkapazität. Klärung von nur 13,5 plus oder minus 6,0 Litern pro Quadratmeter vor dem Verstopfen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als 50 Minuten plus Probe durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie diese Methode ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, dass das Zielprotein hitzestabil ist. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Chromatographie durchgeführt werden, um das Produkt weiter auf das erforderliche Niveau zu reinigen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Pflanze, indem sie eine Technologie zur Erforschung der Reinigung von Impfstoffkandidatenproteinen und Nicotiana-Spezies entwickelte.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man pflanzliche Wirtszellproteine durch Blanchieren, Rühren oder Wärmetauscher ausfällt.