Die Bestimmung Unterdrückung des Immunsystems gegen ZNS-Schutz für pharmakologische Interventionen im Bereich der Autoimmun- Demyelinisierung

Das übergeordnete Ziel dieser konzeptionellen Methode ist es, festzustellen, ob pharmakologische Behandlungen für experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis ihren Schutz des Zentralnervensystems während des Ansturms der Immunzellinfiltration oder als Folge der Unterdrückung der Immunzellinfiltration zeigen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der neuronalen Immunologie zu beantworten. Zum Beispiel, wie die Manipulation der EAE-Behandlungszeiten die Auswirkungen auf die Infiltration von Immunzellen von den Auswirkungen auf den Schutz unterscheidet.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Therapie der Multiplen Sklerose, da es derzeit keine neuronalen Schutzbehandlungen für diese Krankheit gibt. Die Idee zu dieser Methode hatten wir, als wir entdeckten, dass die Behandlung von EAE-Mäusen mit einem Inhibitor des Systems Xc-Transporter sowohl neuroprotektiv als auch immunmodulatorisch ist. Obwohl diese Methode zur Untersuchung von medikamentösen Behandlungen verwendet werden kann, kann sie auch auf Studien mit genetischen Knockout-Mäusen angewendet werden, die EAE oder anderen Manipulationen unterzogen wurden.

Beginnen Sie damit, mit einer sterilen Schere das Gehirn und das Rückenmark einzelner Tiere in kleine Stücke zu zerkleinern. Verwenden Sie dann einen Drei-Milliliter-Spritzenkolben pro Gewebe, um jede Probe über einzelne 70-Mikron-Zellsiebe in einzelne konische 50-Milliliter-Röhrchen zu zerdrücken, während Sie die Siebe mit Medium spülen. Wenn alle Stücke mazeriert sind, bringen Sie das endgültige Volumen in den Röhrchen auf 50 Milliliter mit frischem Medium und zentrifugieren Sie dann die Zellsuspensionen.

Resuspendieren Sie jedes Pellet in vier Millilitern einer Lösung mit einem Dichtegradienten von 40 %. Schichten Sie dann die Zelle vorsichtig langsam an den Wänden einzelner konischer 15-Milliliter-Röhrchen entlang auf zwei Milliliter Gradientenlösung mit 70 % Dichte pro Röhrchen. Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation und verwenden Sie Ein-Milliliter-Transferpipetten, um die oberen Myelinschichten vorsichtig zu entsorgen.

Als nächstes werden die lebensfähigen Zellen von den Probengrenzflächen in neue konische 15-Milliliter-Röhrchen überführt und die Zellen in einem endgültigen Volumen von 15 Millilitern frischem Medium pro Röhrchen gewaschen. Resuspendieren Sie die Pellets in 200 Mikrolitern frischem Medium und überführen Sie die Zellsuspensionen in einzelne Vertiefungen einer runden Bodenplatte mit 96 Vertiefungen. Zentrifugieren Sie die Platte und schnippen Sie die Überstände ab.

Dann resuspendieren Sie die Pellets in 200 Mikrolitern Restimulationsmedium und inkubieren Sie die Zellen vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Platte erneut und entfernen die Überstände. Waschen Sie dann die Zellen in 200 Mikrolitern PBS, ergänzt mit 2%FCS, und resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern PBS, ergänzt mit 2%FCS und FC-Block für 10 bis 15 Minuten auf Eis.

Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation wie gerade gezeigt und resuspendieren Sie die Pellets in 15 Mikrolitern Zelloberflächen-Fleckencocktail für 15 Minuten auf Eis. Schleudern Sie dann die Zellen herunter und waschen Sie die Proben zweimal in 200 Mikrolitern PBS. Als nächstes resuspendieren Sie die Zellen in FOXP3-Transkriptionsfaktor-Färbereagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers für 30 Minuten bis über Nacht bei 4 Grad Celsius.

Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation in 150 Mikrolitern Permeabilisierungspuffer. Zentrifugieren Sie dann die Zellen und resuspendieren Sie die Pellets in den intrazellulären Antikörpern von Interesse in 15 Mikrolitern Permeabilisierungspuffer auf Eis. Nach 30 Minuten schleudern Sie die Zellen herunter, gefolgt von drei Wäschen in 200 Mikrolitern Permeabilisierungspuffer

Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie die Pellets in 200 Mikrolitern PBS und analysieren Sie die Proben mittels Durchflusszytometrie, wobei Sie die lebenden CD4-positiven, TCR-Beta-positiven Zellen anzapfen. Es ist auch wichtig, die periphere T-Zellproliferation zu beurteilen, da Veränderungen in der Peripherie die Infiltration von Immunzellen in das ZNS beeinflussen können. Um die Anzahl der Astrozyten und Gliazellen zu quantifizieren, die nach der EAE-Induktion in den Gewebeproben des Rückenmarks vorhanden sind, erhalten Sie Bilder jedes Schnitts mit einer 4-fachen Vergrößerung und speichern Sie die Bilder als TIFF-Dateien.

Wählen Sie als Nächstes in ImageJ das gewünschte Bild aus und verwenden Sie das Polygonauswahlwerkzeug, um den gesamten Abschnitt des Wirbelsäulengewebes nachzuzeichnen. Wählen Sie im Bildmenü Typ und 16-Bit aus, um das Bild in 16-Bit zu konvertieren. Öffnen Sie dann das Prozessmenü und wählen Sie Motivhintergrund, um den Radius der rollenden Kugel mindestens auf die Größe des größten Objekts einzustellen, das nicht Teil des Hintergrunds ist.

Aktivieren Sie das Gleitparaboloid und klicken Sie auf OK. Wählen Sie dann unter Bild die Option Anpassen und Schwellenwert aus, und verwenden Sie die Schieberegler, um den unteren Schwellenwert festzulegen. Um den prozentualen Anteil des Schwellenwertbereichs innerhalb des ausgewählten Bereichs zu ermitteln, wählen Sie unter Analysieren und Messwerte festlegen die Option Flächenfraktion aus. Stellen Sie sicher, dass der Grenzwert auf Schwellenwert deaktiviert und die Anzeigebeschriftung aktiviert ist, und klicken Sie auf OK.To Abrufen der Messwerte, und wählen Sie unter Analysieren die Option Messen aus.

Ein Popup-Fenster für die Ergebnisse wird angezeigt. Speichern Sie diese Daten und vergleichen Sie die Flächenanteilswerte zwischen den Behandlungsgruppen. Um die basische Myelinfärbung anhand der optischen Dichte zu quantifizieren, öffnen Sie das Bild von Interesse und verwenden Sie das Werkzeug Polygonschnitte, um einen interessanten Bereich innerhalb der Probe zu zeichnen.

Wählen Sie unter Messungen analysieren und festlegen die Option Mittlerer Grauwert aus, und vergewissern Sie sich, dass die Option Grenzwert auf Schwellenwert deaktiviert ist und die Anzeigebeschriftung aktiviert ist. Klicken Sie auf OK. Wählen Sie dann im Menü "Analysieren" die Option "Messen" aus. Es erscheint ein neues Popup-Fenster mit den Daten zum mittleren Grauwert des Myelin-Basisproteins.

Entfernung des Rückenmarks und die durchflusszytometrische Analyse ermöglichen die Beurteilung der Infiltration von Immunzellen des Zentralnervensystems, wobei die Infiltration von Immunzellen auf dem Höhepunkt der Erkrankung am größten ist. Die statistische Analyse der CD4-positiven, Interferon-gamma-positiven, IL-17-positiven und FOXP3-positiven Zellzahlen kann die Bedeutung der Veränderungen der CD4-positiven infiltrierenden T-Zellzahlen bei medikamentös behandelten Tieren im Vergleich zu Kontrolltieren aufzeigen, wobei eine eingehende Koexpressionsanalyse unerlässlich ist, um eine Verzerrung als Störfaktor für die Gesamtreduktion der CD4-positiven infiltrierenden T-Zellzahl auszuschließen. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass eine Verringerung der in das Zentralnervensystem infiltrierenden T-Zellen eine Folge der Hemmung der Proliferation, Aktivierung und Differenzierung in der Peripherie ist, kann die Anzahl der aktiv proliferierenden T-Zellen und der Anteil der T-Zell-Subtypen bewertet werden.

Zur quantitativen Bewertung der Myelinintegrität kann eine statistische Analyse der optischen Dichte der Myelin-Basisproteinfärbung durchgeführt werden, die eine signifikante Demyelinisierung des Rückenmarksgewebes bei nicht näher spezifizierten genetischen Knockout-Tieren im Vergleich zu z.B. Wildtyp-Wurfgeschwistern zeigt. Um weiter zu untermauern, dass die Neuroinflammation durch therapeutische Interventionen aufrechterhalten oder verringert wird, kann die reaktive Gliose auch durch Messung der mittleren Fraktionsfläche für reaktive Gliose beurteilt werden, wie gerade gezeigt. Einmal gemeistert, kann die durchflusszytometrische Technik in zwei Tagen abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird, während die Quantifizierung der Gewebefärbung in etwa zwei Stunden pro Färbung durchgeführt werden kann.

Die Immunmodulation kann durch die Einführung der Behandlungen vor der Infiltration der Immunzellen beurteilt werden, um die wandernden und proliferativen Veränderungen in den T-Zellen zu quantifizieren. Der ZNS-Schutz kann beurteilt werden, indem die Behandlungen während des Höhepunkts der Erkrankung eingeleitet werden, wenn die Immunzellen bereits in das ZNS eingedrungen sind. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, die optimalen Schwellenwerteinstellungen in ImageJ nur für die spezifische Hervorhebung der Zellfärbung zu bewerten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Auswirkungen bestimmter Behandlungen auf das Zentralnervensystem, die T-Zell-Proliferation und die Migrationsreaktionen beurteilen können. Durch Änderung der Behandlungszeiten vor und nach der Infiltration von Immunzellen.