Name: Die Bestimmung Unterdrückung des Immunsystems gegen ZNS-Schutz für pharmakologische Interventionen im Bereich der Autoimmun- Demyelinisierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Erfahren Sie, wie pharmakologische Behandlungen bei experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis ZNS-Schutz durch Immunsuppression oder Neuroprotektion vermitteln. Diese Methode unterscheidet immunmodulatorische von neuroprotektiven Effekten.

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Diese Arbeit wurde von NINDS P30-NS069324 finanziert, die National Multiple Sclerosis SocietyRG 4587-A-1, die Civitan International Research Foundation, The Mike L. Jezdimir QuerMyelitis Foundation, The University of Alabama Health Services Foundation - Allgemeine Endowment Fund, The National Science Foundation 1355183 und T32 AI007051 vom nationalen Institut für Allergie und Infektionskrankheiten, National Institutes of Health.

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Patienten mit MS weiterhin Krankheitsrückfälle zu erleben, während Medikamente, die T-Zell-Aktivierung und / oder Infiltration in das ZNS, rechtfertigen die Entwicklung von Behandlungsmöglichkeiten zu dämpfen, die direkt in das ZNS zu schützen. EAE ist klassisch verwendet worden , um die Symptome der MS zu modellieren und kann ein mächtiges Werkzeug sein , wenn die Natur der Wechselwirkungen zwischen dem Immunsystem und ZNS in vivo zu studieren. Verwendung Zeitpunkt der Behandlung Überlegungen in EAE, beispielsweise vor oder nach der Initiierung der Krankheit, in Verbindung mit der Prüfung Immunzellinfiltration in das ZNS und die Proliferation und Aktivierung in der Peripherie, ist es möglich , die Auswirkungen der Behandlungen auf sowohl das Immunsystem zu umreißen und das ZNS. Während EAE in der Maus C57BL / 6 wird auf breiterer Ebene genutzt, EAE in SJL-Maus kann mehr repräsentativ für die Mehrheit der MS-Fälle, da diese Mäuse eine rezidivierende-remittierende Phänotyp und Infiltration von Immunzellen im Parenchym habendes Gehirns 10. SJL Mäuse haben deutliche Erholung während der Remission als auch, was es ermöglicht, eine Behandlung zu beginnen, nachdem die Krankheit vorgelegt hat, aber in Zeiten der reduzierten Entzündung. Es ist wichtig zu bedenken, dass SJL-Mäusen nicht immer in Synchronität Rückfall und überweisen, in potenziell große Variabilität führt, wenn Ergebnisse zusammengefasst werden. Daher können sich entscheiden, einige Forscher repräsentative Ergebnisse für die klinische Scores von einem Tier zu zeigen, während Mäuse für FACS-Analyse und Histologie an individualisierten Punkte in den Krankheitsverlauf nehmen. Berücksichtigung bei Manipulationen EAE Mäuse hergestellt werden bei der Bestimmung der helfen kann, wie eine Behandlung, um das Immunsystem oder ZNS beeinflusst. Es gibt viele Optionen für die Behandlung beginnt, wenn, jede mit ihrer eigenen Konnotation für ob Immunzellen haben die CNS eingegeben und wie sie mit dem CNS interagieren kann. Behandlung vor Auftreten der Symptome impliziert, daß Immunzellen noch nicht eingegeben oder Beschädigung des ZNS verursacht.Die Behandlung nach dem Auftreten der Symptome bedeutet, dass Immunzellen in das ZNS eingegeben haben und einen Schaden verursacht. Verwendung von SJL-Mäusen, die Behandlung kann auch bei einem Rückfall beginnen, wo Immunzellen Entzündung aktiv zu infiltrieren und zu verursachen, oder während der Remission, wo Immunzellen im ZNS weniger verbreitet sein kann mit weniger Entzündung. Erste Hypothesen darüber, wie Behandlungen auf das ZNS und Immunsystem beeinflussen kann gemacht werden, wenn man bedenkt, wo Immunzellen im pathologischen Prozess während der Behandlung sind. Es gibt eine Reihe von Möglichkeiten, in denen Behandlungen Immunzellen und das ZNS, die jeweils mit dem Ergebnis der Verringerung der Schwere von EAE-Symptome beeinflussen. Daher ist es notwendig, Durchflusszytometrie-Analyse und Immunhistochemie, um zu sehen, wie Immunzellen in der Peripherie und ZNS betroffen sind, ob Immunzellen das ZNS eingegeben haben, und wie das ZNS reagiert auf die Behandlung. Während durchflusszytometrische Analyse des Rückenmarks kann bestimmen, wie viele Zellen have das ZNS zu einem bestimmten Zeitpunkt eingegeben, kann man nicht feststellen, daß dieser Effekt zu einer verminderten Immunzellhandel zurückzuführen ist, es sei denn die Proliferation von Immunzellen unbeeinflußt in der Milz ist. Es ist daher notwendig, sowohl die peripheren und ZNS-Gewebe zu analysieren und zu bestimmen, was mechanistisch Ergebnisse bedeuten, wenn beide Gewebe verglichen werden. Es ist auch möglich, Immunzellaktivitätsprofile durch Behandlung verändert werden, zum Beispiel einen Schalter in einem pathogenen T-Helferzell-heavy Profil mit einer regulatorischen T-Zell-heavy Profil aufweist. Mit Blick auf Marker für verschiedene Zelltypen und Vergleichen Prozent Expression zwischen behandelten und unbehandelten Tieren ist deshalb auch ein wichtiger Gesichtspunkt. Ein aufkommender Konzept in der MS-Forschung legt nahe, dass B-Zellen eine wichtige Rolle im Bereich der Autoimmun- Demyelinisierung spielen. Dies basiert auf Studien , die zeigen , dass B - Zellen notwendig sind , für die Reaktivierung von T - Zellen 20. Dieses Konzept wird durch den Erfolg von Behandlungen wie Rituximab, einem Antikörper gegen CD20 ex unterstützt21,22 auf der Oberfläche von B - Zellen gedrückt wird . Wie durch den Erfolg des monoklonalen Antikörpers Ocrelizumab in klinischen Studien gezeigt, Drogen verschiedene Epitope von CD20 - Targeting kann die Wirksamkeit von B - Zell-gezielte Therapeutika 23 verbessern. Eine Einschränkung der Techniken, die hier vorgestellt ist, dass es möglich ist, für die Immunzellen des ZNS zu gelangen, aber nicht in der Lage in das Parenchym zu reisen. Immunhistochemie verwendet werden perivaskuläre cuffing von Immunzellen zu erkennen und zu bewerten Abstand im Parenchym gereist zwischen behandelten und unbehandelten Tieren. Eine weitere potentielle Beschränkung beinhaltet, die Auswirkungen der microbiome auf EAE Pathogenese. Commensal Darmmikrobiota kann stark 24 Pathogenese der Erkrankung beeinflussen; daher Mäuse in verschiedenen Kolonien untergebracht und sogar in verschiedenen Käfigen können große Unterschiede in der Schwere der Erkrankung haben. Dementsprechend ist es immer vorzuziehen, wenn möglich, littermate Kontrollen im gleichen Käfig angehoben zu verwenden, umExperimente mit EAE. Eine letzte Anmerkung ist, dass wenn es experimentell wünschenswert ist, die Wirkungen von Immunzellen proliferative Veränderungen in der Peripherie zu beseitigen, kann es möglich sein, so unter Verwendung von passiven Transfer Induktions zu tun, anstatt die aktive Induktion in diesem Protokoll beschrieben. Eine weitere Bestätigung für die Neuroprotektion 11 kann unter Verwendung eines Co-Kultursystem durchgeführt werden , um spezifische Mechanismen des Zelltods zu testen , oder durch die Verwendung von bedingten Knock - out - Mäusen , die zum Löschen von Proteinen selektiv auf einem Zelltyp ermöglicht. Darüber hinaus die Erforschung von pharmakologischen Mitteln zu erweitern, die neuroprotektive sind, Marker der axonalen transection und neuronalen Tod sollten einbezogen werden. Ein weiterer Bereich von Bedeutung ist die Remyelinisierung. Verletzt Axone sind nicht in der Lage zu remyelinate weitere Unterstützung verleihen, die neuroprotektive Therapien sollte ein wichtiger Bestandteil der Remyelinisierung Therapien sein. Darüber hinaus sind unmyelinated Axone anfälliger für Verletzungen als myelinated Axone. Dies deutet darauf hin, dass, wenn ein Axon demyelinierten therapeutische Interventionen wird die rechtzeitige Remyelinisierung fördern axonalen Verletzungen zu vermeiden. Um diese Alleen, andere in - vivo - Modellen für Demyelinisierung und Remyelinisierung erkunden können verwendet werden (dh Cuprizon und Lysolecithin). Das hier beschriebene Verfahren konzentriert Neuroprotektion auf der Beurteilung von Myelinverlust zu quantifizieren. die Anzahl der Vorläuferzellen sowie deren Fähigkeit, auch zu untersuchen, sich zu vermehren und reifen wäre wichtig für die Bewertung der Remyelinisierung. Mit der Erwähnung dieser alternativen Modellen, muss man auch verschiedene Modelle von Enzephalitis berücksichtigen, die viral vermittelt werden. Es gibt zwei gut charakterisierte RNA - Virusmodelle , die Myelinverlust produzieren: Die eine ist Maus - Enzephalomyelitis der Theiler, ein nicht-umhüllten Picornaviridae - Virus, und der andere ist der Maus - Hepatitis - Virus, ein Mitglied der Coronaviridae Virusfamilie 25,26. EAE ist ein wertvolles Werkzeug für studies, wie Manipulationen oder Behandlungen das Immunsystem beeinflussen und das ZNS in vivo. Das Protokoll kann hier beschrieben helfen, festzustellen, wo Behandlungen den Krankheitsprozess beeinflussen, sei es in der Peripherie sein, an der Blut-Hirn-Schranke, oder im ZNS. Keine aktuellen Behandlungen für MS heilen die Krankheit und die Patienten oft erleben Rückgang im Laufe der Zeit. Ebenso können andere Krankheiten Immunzellinfiltration in das ZNS und den Abbau von Myelin beteiligt, einschließlich akuter disseminierter Enzephalomyelitis, Querschnittsmyelitis und Optikusneuritis, fehlende Behandlungen, die das ZNS zu schützen, wie es durch die Infiltration Immunzellen direkt unter Beschuss. Unter Berücksichtigung der Zeitpunkt der Behandlung und Verwendung von Durchflußzytometrie-Analyse der Milz und im Rückenmark in Verbindung mit Immunhistochemie des ZNS Entzündung und Schädigung zu beurteilen, wird für mechanistische Bestimmungen erlauben bezüglich Behandlungen gemacht werden.

Multiple Sklerose (MS) wird durch Entzündungsläsionen vorwiegend in der weißen Substanz Regionen des Gehirns in frühen Krankheits charakterisiert. Nach langfristige Progression wird graue Substanz Atrophie durch MRT-Bildgebung erfasst und markiert die neurodegenerative Phase der Krankheit. Reaktive Gliose, Demyelinisierung und axonale Schäden in der weißen Substanz an CNS-infiltrierenden Immunzellen zugeschrieben. Keine der Behandlungen derzeit in MS verwendet umkehren oder direkt Neurodegeneration im ZNS verhindern - sondern sie reduzieren Entzündung durch T-Zell-Aktivierung zu dämpfen und / oder Infiltration in das ZNS. Da es keine Heilung für MS und Patienten aktuellen Behandlungen weiterhin Fortschreiten der Krankheit zu erfahren, Entdeckungen von Medikamenten, die Demyelinisierung und neuronalen Verlust verhindern sind von entscheidender Bedeutung. Jedoch kann experimentell schwer, wie das Ergebnis sein , zwischen den Effekten auf Immunzellen und die auf das ZNS Differenzierung - dh reduzierte Schädigung des ZNS - sieht die same unabhängig von den Mechanismen, durch die sie auftritt. Daher Beurteilung von CNS Schutz muss mit Bewertungen von CNS-infiltrierenden Immunzellen und Proliferation von Immunzellen in der Peripherie zusammengeschlossen werden, um zu bestimmen, wie pharmakologische Wirkstoffe Krankheitsmechanismen beeinflussen. Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein gut etabliertes Tiermodell der Autoimmunentzündungserkrankungen , die direkt verantwortlich für die Entdeckung von Arzneimitteln zur Zeit verwendet wurde , um MS 1-4 behandeln. Mäuse werden häufig für EAE verwendet, mit C57BL / 6-Mäuse eine beliebte Stamm basiert auf der Verfügbarkeit von genetischen Varianten. C57BL / 6-Mäuse induziert mit EAE zeigen chronischen Krankheitsverlauf mit Beginn um Tag 10 nach Induktion. Die Infiltration des Rückenmarks Parenchym und Cerebellum sind charakteristisch für die Histopathologie dieser Tiere, mit der Abwesenheit der Infiltration im Rindenparenchym 5. Zusätzlich kortikalen Läsionen und Demyelinisierung in der bregen sind Kennzeichen der Krankheit 6-9, die in C57BL / 6 - Mäuse relativ fehlen. Daher kann es bevorzugt sein , wenn möglich SJL - Mäuse zu verwenden, die sowohl gefunden rezidivierend-remittierender Erkrankung und Läsionen im Gehirn und Rückenmark, die mit denen in MS 10 ähnlich erscheinen. Die Behandlung kann nicht als neuroprotektive eingestuft werden, wenn Immunzellen nie das ZNS erreichen. Daher macht dieses Protokoll Gehirnen Verwendung von Durchflußzytometrie - Analyse, Rückenmark und Milz von Mäusen EAE Wirkungen der Behandlung auf die Immunzellinfiltration in das ZNS und die Proliferation von Immunzellen in der Peripherie zu bestimmen, wie zuvor 11 gezeigt. Immunhistochemische Analysen von ZNS-Gewebe Ausmaß und die Art der Neuroprotektion zu bestimmen, wird ebenfalls beschrieben. Kombination dieser Methoden ermöglicht die Bestimmung, ob Immunzellen in der Peripherie aktiviert und proliferiert wurden, ob Immunzellen des ZNS eingegeben, und ob der CNS war protected von Entzündung oder Beschädigung. Wenn neuroprotektive Effekte trotz Auswirkungen auf das Immunsystem im Verdacht stehen, können Experimentatoren verändern Behandlungszeiten nach Immunzellinfiltration Start in das ZNS aufgetreten ist. Hier stellen wir ein Protokoll unter Verwendung von zwei verschiedenen Modellen aktiver EAE, einem T-Zell-vermittelte Tiermodell der MS, und Zytometrie-Analyse mit Immunhistochemie zu verschiedenen Zeitpunkten während des Krankheits kombinierte Strömungs die Wirksamkeit von experimentellen Therapien, die auf verschiedene Aspekte der zu bestimmen, MS Pathogenese. Diese Methode wird den Forschern helfen, zwischen Auswirkungen auf die Immunzellproliferation und Infiltration gegen ZNS-Schutz bei der Differenzierung, so dass es leichter zu verengen, wie Drogen auf Pathogenese der Erkrankung handeln.

<table><tbody><tr><td>22 x 22 x 20 mm Einbettform</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9719245</td><td></td></tr><tr><td>22 x 30 x 20 mm Einbettform</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9531194</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutan</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>30 x 22 x 20 mm Einbettungsform</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-30</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>552775</td><td>0,2 mg/ml Stammkonzentration</td></tr><tr><td>anti-Foxp3-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5773-82</td><td>0,5 mg/ml Stammkonzentration</td></tr><tr><td>anti-GFAP (Cocktail)</td><td>Biolegend</td><td>835301</td><td>1 - 3 mg/ml Stammkonzentration</td></tr><tr><td>anti-Iba-1 Polyklonaler Antikörper (50 &#181; g)</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>0,5 mg/ml Stammkonzentration</td></tr><tr><td>anti-IFN-& gamma APC</td><td>eBioscience</td><td>17-7311-82</td><td>0,2 mg/ml Stammkonzentration</td></tr><tr><td>anti-IL-17A PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-7177-82</td><td>0,2 mg/ml Stammkonzentration</td></tr><tr><td>anti-Ki-67 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5698-82</td><td>0,2 mg/ml Stammkonzentration</td></tr><tr><td>anti-MBP (D-18)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-13912</td><td>0,2 mg/ml Stammkonzentration</td></tr><tr><td>anti-TCR&beta; FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5961-85</td><td>0,5 mg/ml Stammkonzentration</td></tr><tr><td>Anti-TCR&Beta; PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5961-83</td><td>0,2 mg/ml Stammkonzentration</td></tr><tr><td>Biotinylierte Ziege Anti-Kaninchen</td><td>IgG Vector Labs</td><td>BA-1000 1,5</td><td>mg/ml Stammkonzentration</td></tr><tr><td>Biotinyliertes Pferd Anti-Maus IgG</td><td>Vektor Labs</td><td>BA-2000&nbsp;</td><td>1,5 mg/ml Stammkonzentration</td></tr><tr><td>Zitronensäure, wasserfrei, 99,5 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC42356-5000</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Tetranatriumsalzdihydrat, 99 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC446085000</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Objektträger, Karton mit 10</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Golgi Plug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>Proteintransporthemmer</td></tr><tr><td>Immedge Hydrophobic Barrier</td><td>Pen Fisher Scientific</td><td>NC9545623</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>EMD Millipore</td><td>407952-5mg</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin, 100x</td><td>Corning</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nichtessentielle Aminosäuren</td><td>Corning</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Nahes IR Lebend/Tot Färbeset</td><td>Life Technologies</td><td>L10119</td><td>Lebensfähigkeitsfarbstoff</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Vector Labs</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Normales Pferdeserum</td><td>Vector</td><td>Labs S-2000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 96%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC416785000</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Gesundheitswesen</td><td>17-0891-01</td><td>Dichtegradient</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td>harziges Eindeckmedium</td></tr><tr><td>Phorbol 12-Myristat-13-acetat (PMA)</td><td>Sigma</td><td>P1585-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Gereinigtes Anti-Myelin-Basisprotein Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>808401</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Corning</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>nichtionisches Reinigungsmittel</td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC Kit (Standard)</td><td>Fisher</td><td>Scientific NC9206402</td><td>Avidin-Biotin-Peroxidase&nbsp; Komplex (ABC) in Immunperoxidase&nbsp;</td></tr><tr><td>Vector Laboratories Peroxidase-Substrat-Kit (DAB)</td><td>Fisher</td><td>Scientific NC9276270</td><td>DAB-Lösung</td></tr></tbody></table>

die bestimmung unterdrückung des immunsystems gegen zns-schutz für pharmakologische interventionen im bereich der autoimmun- demyelinisierung

Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

Ein Hauptmerkmal der autoimmunen demyelinisierenden Krankheit Multiple Sklerose (MS) ist die Infiltration von Immunzellen in das Gehirn und das Rückenmark, was zu einer Myelinzerstörung führt, die nicht nur die Weiterleitung von Nervenimpulsen verlangsamt, sondern auch axonale Verletzungen verursacht, die zu motorischem und kognitivem Verfall führen. Die derzeitigen Behandlungen für MS konzentrieren sich auf die Abschwächung der Infiltration von Immunzellen in das Zentralnervensystem (ZNS). Diese Behandlungen verringern die Anzahl der Schübe und verbessern die Lebensqualität, beseitigen aber die Schübe nicht vollständig, so dass die langfristige Behinderung nicht verbessert wird. Daher sind Therapeutika, die das ZNS schützen, gerechtfertigt. Sowohl in Tiermodellen als auch bei menschlichen Patienten mit MS wird der Eintritt von T-Zellen in das ZNS im Allgemeinen als das auslösende Entzündungsereignis angesehen. Um beurteilen zu können, ob ein Medikament das ZNS schützt, müssen mögliche Auswirkungen auf die Infiltration oder Proliferation von Immunzellen in der Peripherie ausgeschlossen werden. Dieses Protokoll beschreibt, wie festgestellt werden kann, ob der nach einer medikamentöse Intervention beobachtete ZNS-Schutz eine Folge der Schwächung von ZNS-infiltrierenden Immunzellen oder der Blockierung des Absterbens von ZNS-Zellen bei entzündlichen Insulten ist. Die Möglichkeit, MS-Behandlungen zu untersuchen, die das ZNS bei entzündlichen Beleidigungen schützen, ist für die Weiterentwicklung therapeutischer Strategien von entscheidender Bedeutung, da die derzeitigen Behandlungen Rückfälle (d. h. die Infiltration von Immunzellen) reduzieren, aber nicht vollständig beseitigen, wodurch das ZNS anfällig für Degeneration wird.

Dieses Protokoll beschreibt, wie bestimmt werden kann, ob pharmakologische Behandlungen für experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis einen ZNS-Schutz als Folge der Unterdrückung der Immunzellinfiltration zeigen oder während des Ansturms der Immunzellinfiltration neuroprotektiv sind.

Die Bestimmung Unterdrückung des Immunsystems gegen ZNS-Schutz für pharmakologische Interventionen im Bereich der Autoimmun- Demyelinisierung

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in ...

Das übergeordnete Ziel dieser konzeptionellen Methode besteht darin, zu ermitteln, ob pharmakologische Behandlungen bei experimenteller autoimmune Enzephalomyelitis ihren Schutz des zentralen Nervensystems während des Einwanderungsansturms von Immunzellen oder als Folge der Unterdrückung der Immunzelleinwanderung entfalten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der neuroimmunologischen Forschung zu beantworten, beispielsweise, wie die Variation der Behandlungszeitpunkte bei EAE die Wirkung auf die Immunzelleinwanderung im Vergleich zum Zellschutz differenziert.Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Therapie der Multiplen Sklerose, da es derzeit keine neuroprotektiven Behandlungen für diese Erkrankung gibt. Wir hatten erstmals die Idee zu dieser Methode, als wir entdeckten, dass die Behandlung von EAE-Mäusen mit einem Inhibitor des System-Xc--Transporters sowohl neuroprotektiv als auch immunmodulatorisch wirkte. Obwohl diese Methode zur Untersuchung von Arzneimitteltherapien verwendet werden kann, lässt sie sich auch auf Studien anwenden, bei denen genetisch veränderte Knockout-Mäuse EAE oder anderen Manipulationen unterzogen werden.Beginnen Sie damit, mit sterilen Scheren die Gehirne und Rückenmarkstücke einzelner Tiere in kleine Stücke zu zerkleinern. Verwenden Sie anschließend einen Drei-Milliliter-Spritzenstößel pro Gewebe, um jede Probe einzeln über 70-Mikrometer-Zellsiebe in jeweils einzelne 50-Milliliter-Konischgefäße zu pressen, wobei Sie die Siebe mit Medium spülen. Nachdem alle Stücke zerkleinert wurden, ergänzen Sie das Endvolumen in den Gefäßen mit frischem Medium auf 50 Milliliter und zentrifugieren Sie die Zellsuspensionen.Suspendieren Sie jedes Pellet in vier Milliliter 40%iger Dichtegradientenlösung. Schichten Sie die Zellen dann vorsichtig langsam entlang der Wände einzelner 15-Milliliter-Konizflaschen auf zwei Milliliter 70%iger Dichtegradientenlösung pro Röhrchen. Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation und verwenden Sie Ein-Milliliter-Transferpipetten, um die oberen Myelinschichten vorsichtig zu entfernen.Überführen Sie anschließend die vitalen Zellen von den Probengrenzflächen in neue konische 15-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie die Zellen in einem Endvolumen von 15 Milliliter frischem Medium pro Röhrchen. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 200 Mikroliter frischem Medium und überführen Sie die Zellsuspensionen in einzelne Vertiefungen einer 96-Loch-Rundbodenplatte. Zentrifugieren Sie die Platte und entfernen Sie die Überstände durch Abschütteln.Resuspendieren Sie die Pellets anschließend in 200 Mikroliter Reaktivierungsmedium und inkubieren Sie die Zellen vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Platte erneut und entfernen die Überstände. Waschen Sie die Zellen dann mit 200 Mikroliter PBS, das mit 2 % FCS ergänzt ist, und resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikroliter PBS, das mit 2 % FCS und FC-Block ergänzt ist, für 10 bis 15 Minuten auf Eis.Am Ende der Inkubation die Zellen wie gerade gezeigt waschen und die Pellets in 15 Mikrolitern Zelloberflächen-Färbemix für 15 Minuten auf Eis resuspendieren. Anschließend die Zellen zentrifugieren und die Proben zweimal mit jeweils 200 Mikrolitern PBS waschen. Danach die Zellen gemäß Herstelleranweisung in FOXP3-Transkriptionsfaktor-Färbelösung für 30 Minuten bis über Nacht bei 4 Grad Celsius resuspendieren.Am Ende der Inkubation die Zellen mit 150 Mikrolitern Permeabilisierungspuffer waschen. Anschließend die Zellen zentrifugieren und die Pellets in den gewünschten intrazellulären Antikörpern in 15 Mikrolitern Permeabilisierungspuffer auf Eis resuspendieren. Nach 30 Minuten die Zellen abzentrifugieren und danach dreimal mit jeweils 200 Mikrolitern Permeabilisierungspuffer waschen.Nach der letzten Wäsche die Pellets in 200 Mikrolitern PBS resuspendieren und die Proben per Durchflusszytometrie analysieren, wobei auf lebende CD4-positive, TCR-Beta-positive Zellen gezielt wird. Es ist außerdem wichtig, die Proliferation peripherer T-Zellen zu bewerten, da Veränderungen in der Peripherie die Infiltration von Immunzellen in das ZNS beeinflussen können. Um die Anzahl der Astrozyten und Gliazellen in den Gewebeproben des Rückenmarks nach EAE-Induktion zu quantifizieren, gewinnen Sie Bilder jedes Schnitts mit einer 4fachen Vergrößerung und speichern Sie die Bilder als TIFF-Dateien.Als Nächstes wählen Sie in ImageJ das gewünschte Bild aus und verwenden das Polygon-Auswahlwerkzeug, um den gesamten Rückenmarkgewebeschnitt nachzuzeichnen. Wählen Sie im Bildmenü „Typ“ und „16-Bit“, um das Bild in 16-Bit umzuwandeln. Öffnen Sie dann das Menü „Prozess“ und wählen Sie „Hintergrund subtrahieren“, um den Radius der Rollenden Kugel mindestens auf die Größe des größten Objekts festzulegen, das nicht zum Hintergrund gehört.Überprüfen Sie den verschiebbaren Paraboloiden und klicken Sie auf „OK“. Wählen Sie dann unter „Bild“ die Option „Anpassen“ und „Schwellwert“ und verwenden Sie die Schieberegler, um die untere Schwellwertgrenze festzulegen. Um den Prozentsatz des schwellwertbasierten Bereichs innerhalb des ausgewählten Bereichs zu erhalten, wählen Sie unter „Analysieren“ und „Messungen festlegen“ die Option „Flächenanteil“. Stellen Sie sicher, dass „Auf Schwellwert begrenzen“ nicht aktiviert ist und dass „Beschriftung anzeigen“ aktiviert ist, und klicken Sie auf „OK“. Um die Messungen zu erhalten, wählen Sie unter „Analysieren“ die Option „Messen“.Ein Ergebnis-Popup-Fenster wird angezeigt. Speichern Sie diese Daten und vergleichen Sie die Flächenanteilswerte zwischen den Behandlungsgruppen. Um die myelinspezifische Färbung anhand der optischen Dichte zu quantifizieren, öffnen Sie das Bild von Interesse und verwenden Sie das Polygon-Auswahlwerkzeug, um einen interessierenden Bereich innerhalb der Probe zu zeichnen.Wählen Sie unter „Analyze“ und „Set Measurements“ den mittleren Grauwert aus, stellen Sie sicher, dass „Limit to threshold“ nicht aktiviert ist, und aktivieren Sie „Display label“. Klicken Sie auf „OK“. Wählen Sie dann im Menü „Analyze“ die Option „Measure“. Es erscheint ein neues Popup-Fenster mit den Ergebnissen, das die Daten zum mittleren Grauwert des Myelin-Basik-Proteins enthält.Die Entnahme des Rückenmarks und die Durchflusszytometrie ermöglichen die Beurteilung des zentralnervösen Immunzellinfiltrats, wobei die Immunzellinfiltration zum Zeitpunkt des Krankheitshöhepunkts am stärksten ausgeprägt ist. Die statistische Analyse der Anzahlen von CD4-positiven, Interferon-gamma-positiven, IL-17-positiven und FOXP3-positiven Zellen kann die Bedeutung der beobachteten Veränderungen in der Anzahl der CD4-positiven infiltrierenden T-Zellen bei medikamentös behandelten Tieren im Vergleich zu Kontrolltieren aufzeigen, wobei eine detaillierte Co-Expressionsanalyse unerlässlich ist, um eine Verzerrung als störenden Faktor bei der Gesamtreduktion der Anzahl CD4-positiver infiltrierender T-Zellen auszuschließen. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass eine Verringerung der ins zentrale Nervensystem eindringenden T-Zellen auf einer Hemmung der Proliferation, Aktivierung und Differenzierung im peripheren Bereich beruht, kann die Anzahl der aktiv proliferierenden T-Zellen sowie der Anteil der T-Zellsubtypen evaluiert werden.Zur quantitativen Beurteilung der Myelinintegrität kann eine statistische Analyse der optischen Dichte der Myelin-Basik-Protein-Färbung durchgeführt werden, die beispielsweise eine signifikante Demyelinisierung des Rückenmarkgewebes bei nicht näher spezifizierten genetischen Knockout-Tieren im Vergleich zu Wildtyp-Wurfgenossen aufzeigt. Um weiter zu belegen, dass neuroinflammatorische Prozesse durch therapeutische Interventionen aufrechterhalten oder vermindert werden, kann die reaktive Gliose ebenfalls durch Messung des mittleren Bruchteils der Fläche für die reaktive Gliose, wie gerade gezeigt, bewertet werden. Sobald die Technik beherrscht ist, kann die Durchflusszytometrie innerhalb von zwei Tagen abgeschlossen werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird, während die Quantifizierung der Gewebefärbung pro Färbung etwa zwei Stunden in Anspruch nimmt.Die Immunmodulation kann bewertet werden, indem die Behandlungen vor dem Einwandern der Immunzellen eingeleitet werden, um die Veränderungen in Migration und Proliferation der T-Zellen zu quantifizieren. Der Schutz des ZNS kann bewertet werden, indem die Behandlungen während des Krankheitshöhepunkts durchgeführt werden, wenn die Immunzellen bereits in das ZNS eingewandert sind. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, stets die optimalen Schwellenwerte in ImageJ zu überprüfen, um ausschließlich die zelluläre Färbung gezielt hervorzuheben.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Auswirkungen spezifischer Behandlungen auf das zentrale Nervensystem sowie auf die Proliferation und Migrationsreaktionen von T-Zellen beurteilt werden können. Durch die Anpassung der Behandlungszeiten vor und nach dem Einwandern der Immunzellen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Bestimmte Maus-Stämme sind in der Lage, die Induktion der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) mit Myelin basisches Protein zu widerstehen. Hier beschriebene ist ein einfaches Protokoll, das die Immunisierung Teilnahmslosigkeit umkehrt und induziert paralytischen Erkrankung in mehreren typischen EAE resistent Maus Flecken.

Die Überwindung der nicht mehr reagiert, in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) Beständig Mausstämmen durch adoptiven Transfer-und Antigen-Challenge

Eine neue ex vivo Herstellung zum Abbilden der Rückenmark der Maus. Dieses Protokoll ermöglicht die Zwei-Photonen-Bildgebung von lebenden zellulären Interaktionen ganzen Rückenmark.

Zwei-Photonen-Imaging von Zelluläre Dynamik in der Maus Spinal Cord

Demyelinisierende Krankheiten können bei Tieren durch fokale Anwendung von Lysolecithin in das ZNS modelliert werden. Eine einzige Injektion von Lysolecithin in das Rückenmark der Maus führt zu einer Läsion, die sich im Laufe der Zeit spontan repariert. Ziel ist es, Faktoren zu untersuchen, die an der De- und Remyelinisierung beteiligt sind, und Wirkstoffe zur Verbesserung der Reparatur zu testen.

Experimentelle Demyelinisierung und Remyelinisierung von Murine Rückenmark von Focal Injektion von Lysolecithin

Dieses Manuskript beschreibt die Methoden zur Induktion und Bewertung des experimentellen Modells der autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), zusammen mit der Beurteilung der Immunzellverteilung und der mRNA-Zytokinspiegel in Lymphknoten, Milz, Blut und Rückenmark mittels Durchflusszytometrie bzw. quantitativer PCR in verschiedenen Krankheitsstadien.

Die Induktion der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis bei Mäusen und die Auswertung des Krankheitsabhängige Verteilung von Immunzellen in verschiedenen Geweben

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, um die Beeinträchtigung der neurovaskuläre Einheit während experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis in vivo zu untersuchen. Wir gezielt auf Durchlässigkeit der Blut - Hirn-Schranke und Gelatinase Tätigkeit in Leukozyte Migration über die Glia Limitans ermitteln.

Beeinträchtigung der Endothelzellen und glialen Barrieren des Referats neurovaskuläre während experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis In Vivo Visualisierung

Dieses Manuskript stellt ein Protokoll zur Induzieren von aktiver experimenteller Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) bei Mäusen dar. Eine Methode zur Isolierung und Charakterisierung der infiltrierten Lymphozyten im Zentralnervensystem (ZNS) wird ebenfalls vorgestellt, um zu zeigen, wie Lymphozyten an der Entwicklung einer CNS-Autoimmunerkrankung beteiligt sind.

Flow Cytometric Analyse der Lymphozyteninfiltration im Zentralnervensystem während der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in einem Mausmodell unter Verwendung von Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein und die Überwachung des Krankheitsprozesses mit einem klinischen Scoring-System. Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis-bezogene Symptome werden mittels Mausfemur-Mikro-Computertomographie und Freilandtest analysiert, um den Krankheitsprozess umfassend zu beurteilen.

Induktion und diverse Bewertungsindikatoren der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Zwei-Punkt-Injektion von Lysophosphatidylcholin über einen stereotaktischen Rahmen, um ein stabiles und reproduzierbares Demyelinmodell in Mäusen zu erzeugen.

Ein stabil etabliertes Zwei-Punkt-Injektionsmodell für Lysophosphatidylcholin-induziertes fokales Demyelin-Modell bei Mäusen

Bis heute sind Protokolle für die gleichzeitige Isolierung aller wichtigsten Zelltypen des Zentralnervensystems aus derselben Maus ein ungedeckter Bedarf. Das Protokoll zeigt ein Verfahren, das in naiven und experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis-Mäusen angewendet werden kann, um komplexe zelluläre Netzwerke während der Neuroinflammation zu untersuchen und gleichzeitig die erforderliche Anzahl von Mäusen zu reduzieren.

Gleichzeitige Isolierung der wichtigsten Zelltypen des Zentralnervensystems aus adulten Autoimmun-Enzephalomyelitis-Mäusen

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) dient als Tiermodell der Multiplen Sklerose. Dieser Artikel beschreibt einen Ansatz zur Bewertung von Rückenmarksentzündungen, Demyelinisierung und axonalen Verletzungen bei EAE. Darüber hinaus wird eine Methode zur Quantifizierung des löslichen Neurofilament-Lichtspiegels im Mäuseserum vorgestellt, die die Beurteilung der axonalen Schädigung in lebenden Mäusen erleichtert.

Bewertung von Entzündungen, Demyelinisierung und Axonverletzungen des Zentralnervensystems bei experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein Tiermodell für Multiple Sklerose (MS), das mit der menschlichen Krankheit eine robuste humorale Autoimmunreaktion teilt. In dieser Arbeit berichten wir über ein einfaches und flexibles ELISA-Protokoll zur Quantifizierung von Autoantikörpern im Serum von EAE-immunisierten Mäusen.

Quantifizierung autoreaktiver Antikörper in Mäusen nach experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

Erfahren Sie, wie pharmakologische Behandlungen bei experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis ZNS-Schutz durch Immunsuppression oder Neuroprotektion vermitteln. Diese Methode unterscheidet immunmodulatorische von neuroprotektiven Effekten.

Die Bestimmung Unterdrückung des Immunsystems gegen ZNS-Schutz für pharmakologische Interventionen im Bereich der Autoimmun- Demyelinisierung (Video) | JoVE Journal

Die Bestimmung Unterdrückung des Immunsystems gegen ZNS-Schutz für pharmakologische Interventionen im Bereich der Autoimmun- Demyelinisierung

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