Name: Murine experimentellen Modell der ursprünglichen Tumor-Entwicklung und Peritoneal Metastasierung über Orthotopische Inokulation mit Ovarialkarzinomzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Lernen Sie die orthotope Inokulation von Ovarialkarzinomzellen in Mäusen zur Untersuchung von Tumorentwicklung und peritonealer Metastasierung. Dieses Modell liefert wertvolle Einblicke in Metastasemechanismen.

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Die Autoren danken den Mitgliedern der Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie und Krebsbiologie für ihre hilfreichen Diskussionen und technische Hilfe. Diese Studie wurde von einer japanischen Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaft (JSPS) Zuschuss-in-Aid for Scientific Research unterstützt (15K15604; H. Kajiyama).

Das Behandlungsprotokoll folgt den Richtlinien für Tierversuche von Nagoya University angenommen. 1. Herstellung von Zellsuspensionen <ol><li> Menschliche ovarian klarzelligen Karzinom-Zelllinie. <ol><li> Pflegen ES-2 - Zellen 12 in RPMI-1640 - Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und Penicillin / Streptomycin (Penicillin 100 Einheiten / ml, Streptomycin: 0,1 mg / ml). Kulturzellen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator. </li><li> Sammeln Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase in 0,05% Trypsin / 0,02% EDTA-Lösung (Trypsin / EDTA). <ol><li> Entfernen Sie zuerst die alten Medien aus dem Zellkulturgefäß, dann die Zellen waschen einmal mit PBS (PBS ohne Ca 2+ / Mg 2+, 3 bis 4 ml pro 25 cm 2). </li><li> Als Nächstes fügen Sie 1 ml pro 25 cm 2 von Trypsin / EDTA. Drehen Sie den Zellkulturgefäß die Zellschicht mit Trypsin / EDTA zu decken. Nach dem Entfernen und Trypsin / EDTA zu verwerfen, Rückkehr in die ZelleKulturgefäß in den Inkubator 3 - 5 min oder bis die Zellen abgelöst werden. </li><li> Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, werden die Zellen von der Oberfläche der Zellkulturschale abgelöst und schwebend. </li><li> Frisches Serum - Wachstumsmedium enthält , um das Trypsin (5 ml pro 25 cm 2) zu inaktivieren, und die Zellen erneut zu suspendieren. Übertragen resuspendierten Zellen zu einer 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifuge bei 300 xg für 5 min. Führen Zentrifugierung entweder bei 4 ° C oder Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Zellen mit Wachstumsmedium (5 ml pro 25 cm 2). </li></ol></li><li> Zählen von Zellen (beispielsweise durch Trypan-Blau - Ausschluß) , dann resuspendieren in Wachstumsmedium bei einer Dichte von 2 x 10 8 Zellen / ml. Legen Sie die suspendierten Zellen auf Eis. </li></ol></li><li> Tauen gefrorenen extrazellulären Matrix (ECM) -basierte Hydrogel-Aliquots in einem Eisbad. </li><li> Fügen Sie die Zellsuspension auf ECM-basierten Hydrogel Aliquots bei einem Verhältnis von 1: 1 (letzte Zelle cONZENTRATION: 1 x 10 5 Zellen / ul Medium-ECM-basierten Hydrogel) und gründlich mischen. Legen Sie die vorbereiteten Zellsuspensionen in einem Eisbad bis zur Verwendung. </li></ol> 2. Orthotopische Inokulation mit Zellsuspensionen HINWEIS: Chirurgie keine eigene Suite benötigen. Die Operation kann in einem Bereich des Raumes auf einem Labortisch durchgeführt werden, die getrennt ist und eine minimale Aktivität. Eine laminare Haube kann ebenfalls verwendet werden. Sterile chirurgische Instrumente verwendet werden müssen und Schere sollte nicht verwendet werden, um Hautschnitte zu machen. <ol><li> Verwenden weibliche Nacktmäuse (Balb / c nu / nu) bei 8 Wochen alt für dieses orthotoper Impfung Modell. </li><li> Zunächst betäuben die Maus mit Isofluran mit Inhalation (2-4%). Überprüfen Narkosetiefe durch einen Mangel an Rückzug auf festen Zehe Prise zu überprüfen. Nachdem die Maus betäubt, eine milde sterile Augensalbe für die Augen gelten als notwendig, um zu verhindern Trocknen. </li><li> Legen Sie die narkotisierten Maus auf einem operating Bühne Bauchseite nach unten. Desinfizieren Sie die OP-Bereich mehrmals sowohl mit Alkohol und einem Jod-basierte oder Chlorhexidin-basierten Gestrüpp. </li><li> Machen Sie eine ~ 2 cm lange Inzision vertikal in der Nähe der Wirbelsäule zwischen dem rechten Rippenbogen und Oberschenkelknochen. Verwenden Sie eine sterile Operationstuch um die Einschnittstelle. Befestigen Sie die eingeschnittenen Hautoberflächen mit Klammern um die Öffnung zu halten. Hinweis: Retraktoren können anstelle von Klemmen verwendet werden. </li><li> Als nächstes wird ein zweiter Schnitt machen (ca. 1 cm) an der parietalen Peritoneum unter dem ersten Einschnitt in die Bauchhöhle zu öffnen. Klemmen Sie die eingeschnitten Bauchoberflächen. Clip das Fettgewebe, das die ipsilateral Ovar und Eileiter mit einer Klemme umgibt den Ovar aus der Bauchhöhle zu entfernen. Legen Sie das Ovar und Eileiter auf Gaze. Dann setzen Sie die Maus Bauchseite nach unten unter dem Binokular. </li><li> Legen Sie die Zellsuspension in einer Insulinspritze (1/2 ccm, 29 G) kurz vor der Injektion. Sorgfältig injizieren, um die vorbereiteten Zellsuspension (1- 2 &amp; mgr; l) in den Eierstöcken. Mehrere sec, behalten im Ovar die Nadel Gelierung des ECM-basierten Hydrogel zu gewährleisten. Nach dem Gelieren, bleiben die injizierten Tumorzellen innerhalb des Ovars. </li><li> Rückkehr vorsichtig das Ovar in den Körper. Vernähen den zweiten Schnitt mit sterilen medizinischen Seide, und dann versiegeln die Haut mit Wundklammern. </li><li> Nach der Operation werden die Mäuse eine Analgesie (beispielsweise Meloxicam, intramuskulär (im) oder subkutan (sc), 0,2 mg / kg) für eine anfängliche 24 - Stunden - Zeitraum verabreicht. </li></ol> 3. Post-chirurgische Behandlung <ol><li> Platzieren Sie jede Maus in einem separaten Käfig auf sauberes Papier mit einer heißen Packung mit der Maus warm zu halten, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat. Dann kehren die Tiere in ihre Käfige für die Aufzucht und Überwachung. Überwachen Sie die Mäuse täglich für 3 bis 7 Tage nach der chirurgischen Behandlung. </li><li> Die Überwachung der postoperativen Mäuse <ol><li> Bei Anzeichen von Schmerzen, zu verwalten Analgetäglich SICS (zB Meloxicam, im oder sc, 0,2 mg / kg). </li><li> Wenn Mäuse Anzeichen einer Infektion (zB, Rötung, Schwellung, Entladung), verabreichen tägliche Injektion mit einem anti-infektiösen Reagenz (zB Penicillin, im, 100.000 IU / kg). </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Haut Verschlussmaterialien 10 bis 14 Tage nach der postoperativen Behandlung. </li></ol> 4. Analyse von Tumoren und Metastasen HINWEIS: Der Tumor wird bei den injizierten Ovar 2 gebildet werden - 3 Wochen nach der Impfung. <ol><li> Opfern , um die Mäuse durch Kohlendioxid, und dann sammeln die Proben (zB Tumoren, Metastasen, Organe) 13-15 für die weitere Analyse 14,16-20. HINWEIS: Wenn eine in vivo - Bildgebungssystem zur Verfügung steht, Enzyme tragenden Zellen , die in diesem Protokoll Biolumineszenz (zB Luciferase) oder fluoreszierendes Protein (beispielsweise GFP) produzieren verwendet werden kann. Dieses modifizierte Protokoll wird nützliche Informationen fürdie Dynamik der Ausbreitung von Krebszellen aus dem Primärtumor. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Tiermodelle sind wichtig, die Mechanismen der Tumorentstehung, Progression, Metastasierung und Wirksamkeit von Medikamenten gegen Krebszellen zu analysieren. Mäuse menschlichen Zellen Eierstockkrebs haben Lager auch als Tiermodell verwendet. Hier beschreiben wir ein weniger invasives Verfahren zur Verabreichung von Eierstocktumorzellen in einem orthotopischen Ort. Unter Verwendung dieses Verfahrens Inokulation in den Ovarien durch einen retroperitonealen Zugang von der dorsalen Flanke bietet erhebliche Vorteile gegenübe...

Epithelial Ovarialkarzinom (EOC) ist für die höchste Rate der durch Krebs verursachten Todesfälle bei gynäkologischen Malignomen 1. EOC ist mit einer schlechten Prognose verbunden, in erster Linie wegen seiner späten Symptomatologie und wird oft mit mehreren intraperitoneale Disseminationen und Fernmetastasen 2-4 verbunden. Peritoneal Verbreitung ist ein mehrstufiger Prozess. Erstens lösen Tumorzellen von den primären Läsionen und in die Bauchhöhle wandern. Wenn die Tumorzellen in die Bauch Mesothelium befestigen, beginnen sie Gewebe durch die Mesothel 5,6 einzudringen. Um die Tumorbiologie (zB Tumorprogression und therapeutische Reaktion), Maus - Modelle bieten eine Fülle von Informationen besser zu verstehen. A Xenotransplantat mit menschlichen Krebszellen ist für Mausmodelle, bei denen menschliche Krebszellen werden subkutan, intraperitoneal, intravenös und orthotop weit verbreitet. Ein Tiermodell mit einem orthotop grafted Tumor kann effizienter und die Ergebnisse genau zu erzeugen, das die Tumorumgebung beim Menschen im Vergleich zu einem Tiermodell mit einem heterotop gepfropft Tumor widerspiegeln. Daher ist für viele menschliche Tumore haben orthotoper Transplantationsmodellen wurden 7-11 etabliert. Hier beschreiben wir die orthotoper Inokulation von menschlichen EOC Zellen durch einen retroperitonealen Zugang von der dorsalen Flanke, die Invasivität im Vergleich zu ventralen Impfung begrenzt ist. Diese Technik kann eine Vielzahl von nützlichen Informationen über EOC bereitzustellen, insbesondere der Mechanismus der intraperitoneale Verbreitung.

<table><tbody><tr><td>Matrigel-Matrix&nbsp;</td><td>BD</td><td>354234</td><td>ECM-basiertes Hydrogel</td></tr><tr><td>Insulinspritze</td><td>TERUMO</td><td>SS-05M2913</td><td>1/2 cc, 29 G x 1/2"</td></tr> <tr><td>Nahtnadel mit Naht</td><td></td><td></td><td>11 mm, 3/8, Nylon6-0</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm Wundclip Applier</td><td>CellPoint Scientific</td><td>204-1000</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Reflex 7 mm gewickelte</td><td>Clips CellPoint Scientific</td><td>203-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

murine experimentellen modell der ursprünglichen tumor-entwicklung und peritoneal metastasierung<em&gt; über</em&gt; orthotopische inokulation mit ovarialkarzinomzellen

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Epithelial Ovarialkarzinom (EOC) mit einer schlechten Prognose verbunden, weil es Peritonealdialyse Verbreitung zeigt. Um die Vorhersage zu verbessern, ist es wichtig, peritoneal Verbreitung zu steuern. Es ist jedoch noch unklar, wie Tumorzellen von primären Läsionen lösen und an die Mesothel befestigen. Die Einrichtung eines geeigneten Tiermodell wird benötigt , um ein Verständnis des Mechanismus der Peritonealdialyse Verbreitung in vivo zu gewinnen. In der vorliegenden Studie, führen wir den Prozess von der lokalen Injektion von EOC Zellen in die murine ovarian Oberfläche zur Entwicklung von Metastasen, einschließlich des Peritoneums und der entfernten Organen. Weibliche Nacktmäuse (Balb / c nu / nu) bei 8 Wochen alt verwendet wurden. Unter einem mikroskopischen Gesichtsfeld, EOC - Zellen (1 × 10 5 Zellen / ul Medium-extrazellulären Matrix (ECM) -basierte Hydrogel / einseitige Ovar / Maus) in murine Ovarien durch eine retroperitoneale Ansatz von der dorsalen Flanke injiziert. Dieses vorgeschlagene Verfahren ist ein less-invasive Verfahren für die Maus und minimiert Schäden an den Ovarien. Hier beschreiben wir die methodischen Schritte in der Entwicklung des ursprünglichen und des metastasierenden Tumorbildung von EOC.

<html> Sechs nackte Mäuse hatten ihre Ovarien mit dem menschlichen klarzelligen Karzinom-Zelllinie beimpft ES-2, wie in diesem Protokoll beschrieben. Als nach 2 Wochen in 1A gezeigt ist , 5 der 6 Mäuse hatten einen Tumor im Eierstock mit ES-2 - Zellen überimpft, aber es gab in der kontralateralen Ovar kein Tumor ohne Inokulierung (als Kontrolle verwendet). Außerdem 2 der 5 Mäuse zeigten multiple peritoneal Disseminationen mit Aszites. Zellen metastasieren in die Leber <st...

Um den mehrstufiger Prozess der Peritonealdialyse Verbreitung von Ovarialkarzinomen klären, die aktuelle Studie stellt eine murine experimentellen Modell der ursprünglichen Tumorentstehung und Metastasierung Peritonealdialyse über orthotoper Impfung mit diesen Tumorzellen.

Murine experimentellen Modell der ursprünglichen Tumor-Entwicklung und Peritoneal Metastasierung<em&gt; über</em&gt; Orthotopische Inokulation mit Ovarialkarzinomzellen

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Entwicklung von primären und metastatischen Tumoren beim epithelialen Ovarialkarzinom zu beobachten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der gynäkologischen Onkologie zu beantworten, beispielsweise zum Verständnis der Tumorbiologie oder der peritonealen Aussaat. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die orospatiale Inokulation von menschlichen epithelialen Ovarialkarzinomzellen, auch EOC-Zellen genannt, über einen retroperitonealen Zugang erfolgt, der am dorsalen Flankengewebe angelegt wird. Um eine Zelllinie des humanen ovariellen klarzellulären Karzinoms vorzubereiten, säen Sie ES2-Zellen aus und kultivieren Sie diese in RPMI-1640-Medium mit 10 % FBS sowie PenStrep bei 37 °C und 5 % CO2. In der log-phase der Zellvermehrung entfernen Sie das alte Kulturmedium und waschen die Zellen einmalig mit drei bis vier Millilitern PBS. Anschließend geben Sie ein Milliliter Trypsin/EDTA hinzu und schwenken das Gefäß, um die gesamte Monoschicht zu benetzen. Entfernen und verwerfen Sie danach die Trypsinlösung und stellen Sie die Zellen für drei bis fünf Minuten zurück in den Inkubator. Nach mikroskopischer Kontrolle, ob sich die Zellen gelöst und in Suspension befinden, fügen Sie fünf Milliliter frisches, serumhaltiges Wachstumsmedium hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren, und resuspendieren die Zellen, bevor Sie sie in ein 15-Milliliter-Konischgefäß überführen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 × g und Raumtemperatur.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Orthotopen Tiermodellen von Eierstockkrebs zu replizieren besser menschlicher Erkrankungen und damit zu unserem Verständnis der Tumorprogression und Ansprechen des Tumors auf die Therapie. Ein Maus-Modell erhält eine intrabursalen Injektion von Luciferase-exprimierenden Eierstock-Tumorzellen. Die Behandlung erfolgt über eine orale Sonde verabreicht. Das Tumorwachstum wird durch...

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Einem orthotopen Modell des seröse Ovarialkarzinom in immunkompetenten Mäusen für In vivo Tumor Imaging und Überwachung der Tumor Immunantworten

In diesem Video demonstrieren wir die Entwicklung eines in vitro dreidimensionalen Modells der Auskleidung der Bauchhöhle. Diese organotypische Kultur kann helfen, die Adhäsion, Invasion und Proliferation von Eierstockkrebszellen zu untersuchen.

Modellierung der Metastasierung von Eierstockkrebs in der Peritonealhöhle: Eine Methode zur Erstellung eines In-vitro-3D-Modells der Peritonealschleimhaut

In diesem Video demonstrieren wir die intrauterine Injektion von Eierstockkrebszellen in einem Mausmodell. Dieses orthotope Mausmodell hilft uns, das Tumorwachstum nicht-invasiv zu überwachen und die Wirksamkeit neuer Therapien zur Prävention und Behandlung von rezidivierendem Eierstockkrebs zu bewerten.

Intrauterine Injektion von Krebszellen: Eine Technik zur Verabreichung von Krebszellen zur Etablierung eines Mausmodells für intraperitoneales Eierstockkrebs

Dieses Video beschreibt das Protokoll zur Erstellung eines Maus-Versuchsmodells zur Untersuchung der Tumorentwicklung und der Peritonealmetastasierung. Dieses Eierstockkrebsmodell wird durch die orthotope Inokulation von humanen epithelialen Eierstockkrebszellen in die Eierstöcke einer weiblichen Maus erzeugt.

Orthotope Inokulation von Eierstockkrebszellen in den Eierstock der Maus: Ein Verfahren zur Etablierung eines Mausmodells für Eierstockkrebs zur Untersuchung der peritonealen Verteilung von Zellen

Wir beschreiben eine nicht-invasive Bildgebungsplattform für Tiere, die die Erkennung, Quantifizierung und Überwachung des Wachstums und Wiederauftretens von Eierstockkrebs ermöglicht. Dieses intraperitoneale Xenotransplantatmodell ahmt das klinische Profil von Patientinnen mit Eierstockkrebs nach.

Mausmodell für nicht-invasive Bildgebungs zu erfassen und zu überwachen Eierstockkrebs Rezidiv

Metastasierung bei Eierstockkrebs ist durch zahlreiche diffuse intraperitoneale Läsionen gekennzeichnet, so dass eine genaue visuelle Quantifizierung der Tumorlast eine Herausforderung darstellt.  In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur in situ und ex vivo Quantifizierung der metastasierten Tumorlast unter Verwendung von rot fluoreszierenden Protein (RFP)-markierten Tumorzellen und optischer Bildgebung.

Die Quantifizierung von Intraperitonealtest Ovarian Cancer Metastasis

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Intratibia-Osteosarkom-Zellinjektion zur Generierung von Mausmodellen mit orthotopen Osteosarkom- und Lungenmetastasenläsionen.

Intratibiale Osteosarkom-Zellinjektion zur Erzeugung orthotoper Osteosarkom- und Lungenmetastasen-Mausmodelle

Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung eines dreidimensionalen (3D) ex vivo Modells der Krebszell-Omentum-Interaktion. Das Modell bietet eine Plattform zur Aufklärung von Pro-Tumor-Mechanismen in der Fettnische und zur Erprobung neuartiger Therapien.

Ein Ex-vivo-Modell der Peritonealmetastasierung von Eierstockkrebs mit humanem Omentum

Dieses Manuskript beschreibt die Entwicklung eines Tiermodells, das es ermöglicht, die Auswirkungen von Tumorhypoxie auf die Metastasierung direkt zu testen und die Mechanismen ihrer Wirkung zu entschlüsseln. Obwohl sich die hier beschriebenen Experimente auf das Ewing-Sarkom konzentrieren, kann ein ähnlicher Ansatz auf andere Tumorarten angewendet werden.

In - vivo - Modell für die Prüfung von Wirkung von Hypoxie auf die Tumormetastasierung

Lernen Sie die orthotope Inokulation von Ovarialkarzinomzellen in Mäusen zur Untersuchung von Tumorentwicklung und peritonealer Metastasierung. Dieses Modell liefert wertvolle Einblicke in Metastasemechanismen.

Murine experimentellen Modell der ursprünglichen Tumor-Entwicklung und Peritoneal Metastasierung über Orthotopische Inokulation mit Ovarialkarzinomzellen (Video) | JoVE Journal

Murine experimentellen Modell der ursprünglichen Tumor-Entwicklung und Peritoneal Metastasierung

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