Automatische Analyse von C. elegans Swim Verhalten mit CELEST Software

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist die quantitative Bewertung des Schwimmverhaltens von C.Elegans mit Hilfe der Computer-Vision-Software CeleST (für C.Elegans Swim Test). Diese Analysemethode kann dazu beitragen, die Auswirkungen genetischer Mutationen oder pharmakologischer Eingriffe auf das Schwimmverhalten von C. elegans zu untersuchen. Auch der altersbedingte Rückgang der Lokomotivkapazitäten kann problemlos bewertet werden. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass mehrere Tiere gleichzeitig verfolgt werden können, wobei verschiedene Aspekte der Schwimmhaltung analysiert werden, um acht Parameter des Schwimmverhaltens zu bewerten, und eine automatisierte Datenauswertung.

Beginnen Sie mit der Anschaffung eines Stereomikroskops und einer digitalen CCD-Kamera sowie eines Computers mit digitaler Videoaufzeichnungssoftware und Computer-Vision-Software für die Analyse des Schwimmverhaltens von C.Elegans. Nehmen Sie in der digitalen Videoaufzeichnungssoftware die folgenden Einstellungen vor:Decken Sie das Mikroskop mit einem dunklen Tuch ab, um Blendung im Schwimmbereich auf dem Objektträger zu vermeiden und die Bildqualität zu verbessern. Stellen Sie den Arbeitsabstand und die Vergrößerung des Mikroskops so ein, dass der Schwimmbereich vollständig sichtbar ist, und stellen Sie den Basisspiegel ein, um einen scharfen Kontrast der Tiere zum Hintergrund zu erhalten.

Stellen Sie dann die Beleuchtung auf Dunkelfeld ein, um die Körper der Erwachsenen weiß vor schwarzem Hintergrund zu visualisieren. Pipettieren Sie anschließend 60 Mikroliter 1 x M9-Puffer in einen 10-Millimeter-Ring, der auf einem Objektträger vorgedruckt ist, und stellen Sie sicher, dass der Tropfen den inneren Bereich des Rings vollständig bedeckt. Übertragen Sie vier adulte Nematoden in den Tropfen mit 1 x M9 Puffer und minimieren Sie gleichzeitig den Transport von Bakterien, die die Flüssigkeit trüben können.

Minimieren Sie Bakterien in der Schwimmvertiefung, indem Sie Nematoden entweder kurz auf einem nicht sitzenden Bereich der Platte kriechen lassen, bevor sie übertragen werden, oder indem Sie die Schwimmwanne leicht mischen, um kleinere Bakterienspuren vor der Aufzeichnung zu zerstreuen. Positionieren Sie als Nächstes den mit adulten Nematoden beladenen Objektträger auf der Basis des Mikroskops, um ihr Schwimmverhalten in Flüssigkeit in 30-Sekunden-Videos aufzuzeichnen. Um aufzunehmen, wählen Sie unter der Überschrift "Start" die Option "Neue Sequenz im RAM" aus und drücken Sie dann die rote Aufnahmetaste.

Nachdem die Aufnahme abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Überschrift Start und wählen Sie Vollständige Sequenz exportieren, um das Video in eine Sequenz von Bildframes zu fragmentieren. Starten Sie zunächst die Computer Vision Software für die Analyse des Schwimmverhaltens von C.elegans von Mat Lab, indem Sie auf die Schaltfläche Ausführen klicken. Verwenden Sie auf dem Startbildschirm des Schwimmanalyseprogramms die Schaltflächen Ein Video hinzufügen" oder "Mehrere Videos hinzufügen", um Sequenzen von Bildbildern einzeln oder in Gruppen hochzuladen, während Sie relevante Beschriftungen wie Genotyp, Datum, Versuch und Dauer anhängen.

Klicken Sie dann auf Videos verarbeiten", um die gleichzeitige Verfolgung mehrerer Tiere in den hochgeladenen Sequenzen zu ermöglichen. Wählen Sie im neuen Bildschirm, der erscheint, die gewünschten Videos im linken Feld aus und klicken Sie auf Zur Liste hinzufügen"Als nächstes grenzen Sie die Schwimmzone ab, indem Sie drei Punkte innerhalb des Rings auswählen, und starten Sie die Verarbeitung, indem Sie auf Alle oben aufgeführten Videos verarbeiten klicken. Zeigen Sie den Fortschritt der Videoverarbeitung in der unteren Mitte des Bildschirms an.

Schließen Sie nach Abschluss des Vorgangs den Bildschirm für die Videoverarbeitung. Klicken Sie zunächst auf "Maßnahmen berechnen", um einen neuen Bildschirm zu öffnen, in dem die verarbeiteten Videos nacheinander hochgeladen werden können, um die Verfolgung einzelner Tiere zu validieren oder abzulehnen. Verwenden Sie diesen manuellen Schritt, um sich auf die Bereiche mit verpasstem Tracking zu konzentrieren, die in den roten Blöcken angezeigt werden, und auf den Kontrast zum erfolgreichen Tracking, die in den grünen Blöcken angezeigt werden.

Suchen Sie die Gültigkeit des segmentierten Textes in der ersten Farbleiste auf dem Bildschirm in der unteren Hälfte. Beachten Sie, dass der Prozentsatz der gültigen Frames grün und der Prozentsatz der abgelehnten Frames rot ist. Navigieren und ändern Sie dann Blöcke gültiger oder abgelehnter Frames mit dem nächsten Block, den Optionen Gültigkeit "Block teilen" und "Frame isolieren".

Für den seltenen Fall, dass sich zwei Tiere in einer nicht überfüllten Schwimmzone kreuzen, schalten Sie ihre Identifikationsnummern über einen bestimmten Rahmenbereich mit der "Switch"-Taste um. Klicken Sie abschließend auf "Maßnahmen speichern und berechnen", um die Gültigkeitseingabe zu speichern, bevor Sie ein anderes verarbeitetes Video hochladen. Wählen Sie dann "Schließen" aus, um den Bildschirm "Messwerte berechnen" zu schließen.

Beachten Sie, dass die Software im Hintergrund Krümmungskarten der Schwimmleistung einzelner Tiere sowie die acht später angegebenen Parameter berechnet. Klicken Sie auf dem Startbildschirm des Softwareprogramms für maschinelles Sehen auf Ergebnisse anzeigen", um die Analyseausgabe zu erhalten. Erstellen Sie dann Stichprobengruppen für die statistische Verarbeitung, indem Sie die gewünschten analysierten Frame-Sequenzen im linken Feld auswählen und sie in eine neuere vorhandene Stichprobengruppe verschieben, indem Sie auf die Schaltflächen "Zur ausgewählten Stichprobe hinzufügen" oder "Zu einer neuen Stichprobe hinzufügen" klicken.

Klicken Sie auf Diagramme für diese Stichproben anzeigen", um zu einem zweiten Bildschirm zu gelangen, in dem die Diagramme und Schlüsselstatistiken der Stichproben für jeden der acht Parameter angezeigt werden, indem Sie oben auf dem Bildschirm auswählen. Wählen Sie als Nächstes 2D-Histogramme, um Kombinationen von zwei beliebigen Parametern über das Measure auf der X-Achse und das Measure auf der Y-Achse auf der linken Seite des Bildschirms darzustellen. Klicken Sie auf "Schließen", um den Vorgang zu beenden und zum Bildschirm "Anzeigeergebnisse" zurückzukehren.

Wählen Sie dann die Schaltfläche "Exportieren" oben links auf dem Bildschirm aus, um detaillierte numerische Daten als CSV-Datei zu speichern, um sie in einem Tabellenkalkulationsprogramm zu öffnen und weiter zu bearbeiten. Wählen Sie abschließend Schließen, um den Bildschirm "Anzeigeergebnisse" zu verlassen und zum Startbildschirm zurückzukehren. Klicken Sie auf "Beenden", um sicherzustellen, dass die Datenbank mit den analysierten Videosequenzen gespeichert wird.

Bestimmte Parameter des Schwimmens, wie z. B. die Welleninitiierungsrate, der Aktivitätsindex, der Pinselstrich und die Reisegeschwindigkeit, nahmen mit zunehmendem Alter allmählich ab, selbst bei günstigen genetischen Hintergründen. Auf der anderen Seite stiegen die Parameter für die Anzahl der Körperwellen, die Asymmetrie, die Dehnung und das Locken mit zunehmendem Alter bei Wildtyp- und alternden mutierten Erwachsenen an. Obwohl alle Nematoden als gesunde Erwachsene beginnen, verlieren einige schnell ihre körperliche Fitness, während andere über längere Zeiträume ihre Vitalität bewahren, was darauf hindeutet, dass Bad Ager eine deutlich kürzere Gesundheitsspanne haben als Graceful Ager.

Einmal gemeistert, kann die Analyse von vier schwimmenden Würmern in wenigen Minuten durchgeführt werden. Die Berechnung dauert etwa sechs Minuten pro Video und kann aus der Ferne durchgeführt werden. Es ist machbar, 250 Tiere pro Tag zu verarbeiten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Videos von Schwimmversuchen aufnehmen und Daten verarbeiten können, um eine Bewertung der Fortbewegung in Flüssigkeit zu erhalten.