Name: Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Lernen Sie die Umprogrammierung von Maus-Embryonalfibroblasten durch Überexpression von Transkriptionsfaktoren zur Induktion eines hämogenen Programms. Diese Methode ermöglicht die direkte Generierung hämatopoietischer Vorläuferzellen ohne pluripotente Zwischenstufe.

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Diese Arbeit wurde durch ein NHLBI-Stipendium an K.M. und I.R.L. (1RO1HL119404) unterstützt. Carlos-Filipe Pereira erhielt ein Revson Senior Biomedical Fellowship. Wir danken der Mount Sinai hESC/iPSC Shared Resource Facility und S. D'Souza für die Unterstützung mit Materialien und Protokollen. Wir danken auch den Einrichtungen für Durchflusszytometrie, Genomik und Maus am Mount Sinai.

Ethik-Anweisung: Maus-Zelllinien sind im Anschluss an die Tierpflege Richtlinien der Icahn School of Medicine am Berg Sinai abgeleitet und sollte in Übereinstimmung mit jedem Host Institution durchgeführt werden. 1. Maus embryonale Fibroblasten (MEF) Isolierung von C57BL / 6-Mäuse <ol><li> Richten Sie timed Paarung 13. Sobald ein Vaginalpfropfens sichtbar ist, sollten Sie diesen Tag 0,5. </li><li> Trennen Sie die angeschlossen Weibchen am Stecker Datum und überprüfen sie auf Tag 10-11 Schwangerschaft zu bestätigen. </li><li> Am Tag 13,5-14,5 schwangere weibliche Mäuse über CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte einschläfern. </li><li> Tränken Sie schwangere Frau Bauch mit 70% Ethanol, sezieren die Bauchhöhle mit einer sterilen Schere und Pinzette auf der Mittellinie, und operativ entfernen die Gebärmutterhörner mit den 14 Embryonen. Nehmen Sie die Embryonen vorsichtig aus, während die restlichen Bauchgewebe abzuschneiden. HINWEIS: Wiederherstellen etwa 8 Embryonen mit 4 auf jeder Seite. </li><li> Legen Sie die Gebärmutter-hORNs die Embryonen in einer 10 cm-Schale mit 5-10 ml steriler gekühlter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) enthält. </li><li> Mit einer sterilen Schere und Pinzette, machen einen Einschnitt entlang der Gebärmutterhörner die Säcke zu isolieren, um die Embryonen tragen. Übertragen Sie die Säcke zu einem neuen 10-cm-Schale mit 5-10 ml sterilem PBS gekühlt und auf Eis. </li><li> Legen Sie ein paar der Säcke in eine neue 10 cm-Schale mit 5-10 ml sterilem PBS gekühlt. Mit einer sterilen Schere und Pinzette vorsichtig die Säcke aufgeschnitten (ohne zu tief schneiden), um die Embryonen zu vermeiden, Piercing. </li><li> Trennen Sie die Embryonen aus der Plazenta durch die Nabelschnur zu schneiden. </li><li> Übertragen Sie die Embryonen auf eine neue 10 cm-Schale mit 5-10 ml gekühlter PBS und verlassen auf dem Eis, während die restlichen Dissektionen Abschluss. </li><li> Enthaupten die Embryonen mit einer sterilen Pinzette. Schneiden Sie vorsichtig die Mittellinie des Embryos mit einer sterilen Schere und Pinzette nach unten, von der enthaupteten Bereich Starten des Bauches zu öffnen. Position Zange unterhalb ter inneren Organe (einschließlich des Herzens, der Leber und Lunge) und kratzen sie 15 aus. </li><li> Schneiden Sie das verbleibende Gewebe in kleine Stücke mit einer Schere und Pinzette und in ein 50 ml konischen Röhrchen mit 10 ml Trypsin. </li><li> Pipettieren nach oben und unten mit einer 10-ml-Pipette 20-30 mal das Gewebe zu mischen und trennen. </li><li> Inkubieren des Gewebes und Trypsin Mischung in einem 37 ° C Wasserbad für 45 min, wirbelnde gelegentlich. </li><li> Pipettieren nach oben und unten mit einer 10-ml-Pipette für etwa 5 Minuten um den Inhalt zu mischen. </li><li> Hinzufügen trypsiniert Zellen Volumen Standard Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) zu 3x, 10 ug / ml Penicillin / Streptomycin (P / S), und 1 mM L-Glutamin (L-GLUT) in 10-cm-Schalen (~ 10 ml) und die Kultur bei 37 ° C bis zur Konfluenz (ca. 2-4 Tage). Kultur etwa 1-2 Embryonen pro 10 cm Schale. HINWEIS: Freeze-Zellen einmal Platten konfluent sind. Gefrorene Zellen können aufgetaut werden und agierten 2 weitere Male. Die Zellen können alternativgeteilt 2 mal vor dem Einfrieren, und dann noch einmal nach dem Auftauen. </li></ol> 2. virale Produktion <ol><li> 293T-Zellen in 10 cm-Platten mit 10 ml DMEM mit 10% FBS erweitern, 1% P / S und 1% L-GLUT zur Transfektion. <ol><li> Trypsinize 293T-Zellen mit 2 ml Trypsin, für 5 min bei 37 ° C inkubieren, sammeln die Zellen in 15-ml-Röhrchen, Schleudern bei 300 g, und die Platte in geeigneter Weise (10 ml pro 10 cm Schale). </li></ol></li><li> 24 Stunden vor der Transfektion aufgeteilt konfluenten 10 cm-Platte von 293T-Zellen 1: 6 und Samen in 10 cm Gelatine (0,1% Gelatine in PBS) Platten. HINWEIS: 4 Platten pro Virus benötigt werden. <ol><li> Zu beschichten Platten in Gelatine, fügen mindestens 2 ml der 0,1% igen Gelatinelösung zu beschichten, die Unterseite 10 cm-Platten. bei 37 ° C inkubieren mindestens 20 min. Absaugen Gelatine vor der Zellen auf die Platten hinzufügen. </li></ol></li><li> In einem 15-ml-Röhrchen, fügen Sie 84 ug Plasmid (zB GATA2, Gfi1b, cFos oder ETV6 (subkloniert in die pFUW-TetO vectoder 16) oder FUW-M2rtTA 17), 84 &amp; mgr; g psPAX2, und 42 &amp; mgr; g pMD2.G. Wasser (H 2 O) , um das Volumen auf 2 ml zu begrenzen . Bereiten Sie eine Röhre für jeden Faktor (zB. GATA2, Gfi1b, cFos, ETV6 und FUW-M2rtTA). </li><li> Nach Eintragen von 250 ul 2 M CaCl 2 in jedes Röhrchen 2 ml der Mischung aus 84 &amp; mgr; g des ausgewählten Gen enthält (GATA2, Gfi1b, cFos, ETV6 oder FUW-M2rtTA) + 84 &amp; mgr; g psPAX2 + 42 &amp; mgr; g pMD2.G + H 2 O . </li><li> Mit Hilfe einer Pasteur - Pipette der Pipettierhilfen eingefügt in, Blasen Freisetzung in die 2,25 ml DNA + H 2 O + 2 M CaCl 2 - Gemisch. Da die Blasen mit der Spitze eines P1000 gegen die Glaspipette wird erzeugt werden, legen und langsam auszuwerfen 2 ml 100 mM N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethansulfonsäure (BES), Kochsalzlösung auf der Pasteur-Pipette 1 ml auf einmal. </li><li> Inkubieren alle Rohre in der Kulturhaube bei Raumtemperatur für mindestens 15 min. HINWEIS: Die 4,25 ml Mischung (jetzt DNA + H 2 O + 2M CaCl 2 </sub&gt; + BES Salzlösung) aussehen wird leicht bewölkt. </li><li> Wenn die Mischung brütet, absaugen Medien aus 293T-Platten und 10 ml DMEM + 10% FBS + 1 mM L-Glutamin + 25 nM Chloroquin hinzufügen. HINWEIS: Diese Medien nicht P / S enthalten. </li><li> Nach mindestens 15 min Inkubation (oder bis Medien auf 293T - Zellen zu verändern), fügen Sie die 4,25 ml DNA + H 2 O + 2 M CaCl 2 + BES Salzmischung fallen weise auf die 293T - Zellen pro Röhrchen gleichmäßig über 4 Zellenplatten verteilen (also etwas mehr als 1 ml des Gemisches pro Platte). </li><li> Inkubieren Platten über Nacht (O / N) bei 37 ° C. </li><li> 24 Stunden nach der Inkubation ersetzen Medien auf allen Platten mit 4 ml Standard DMEM (siehe Schritt 1.15). </li><li> Halten Zellen in einem 32 ° C Inkubator von nun an. </li><li> 24 Stunden nach dem Schritt 2.10, sammeln Medien in separate 50-ml-Röhrchen. Ersetzen Sie die gesammelten Medien von jeder Platte mit 4 ml Standard DMEM. HINWEIS: 4 Platten pro anfänglichen Rohr Mischung Ergebnisse in 16 ml gesammelt Medien. <ol><li> EINN ach 12 h Inkubation sammeln Medien wieder in die gleichen 50-ml-Röhrchen und ersetzen mit weiteren 4 ml Standard DMEM. </li><li> Nach 12 h Inkubation, die Medien zu sammeln und zu den gleichen 50-ml-Röhrchen hinzufügen. HINWEIS: jedes Rohr sollte nun enthalten etwa 48 ml Medium, das Virus. </li></ol></li><li> das gesammelte Virus, erste Filter die gesammelten Medien durch 0,45 &amp; mgr; M Low-Protein-Bindung Filter zu konzentrieren. </li><li> Gießen die gefilterten Medien mit Virus in virale Konzentration Zentrifugenröhrchen (ca. 16 ml auf einmal). </li><li> Spin bei 4.000 × g bei 4 ° C für 25 min und Durchfluss entfernen. HINWEIS: Ein kleines Volumen konzentrierter Medien und Virus wird in den Filter sichtbar. </li><li> Fügen Sie weitere 16 ml der gefilterten virushaltigen Medien zu dem konzentrierten Medien + Virus Volumen im Filter verbleibende und mischen durch das Rohr zu invertieren. </li><li> Spinnrohr wieder bei 4.000 × g bei 4 ° C für 25 min und Durchfluss verwerfen. </li><li> Die restlichen gefiltertSammlung der konzentrierten Medien + Virus Volumen links im Filter und mischen durch den Schlauch zu invertieren. </li><li> Spin erneut bei 4.000 × g bei 4 ° C für 10-20 min (abhängig von dem Volumen in dem Filter) und sicherzustellen, dass das verbleibende Volumen von konzentriertem Medium + Virus in dem Filter nach links beträgt etwa 1 ml. Wenn mehr als 1 ml konzentrierter Medien + Virus im Filter bleibt, drehen wieder bei 4.000 × g für 1 min und wiederholen, bis 1 ml im Filter verbleibt. </li><li> Aliquot 200 ul des konzentrierten Virus in 1,5-ml-Röhrchen und Einfrieren bei -80 ° C oder sofort ab. </li></ol> 3. MEF Reprogrammierung <ol><li> Pre-Mantel 6 Well-Platten mit 0,5 ml 0,1% Gelatine in PBS pro Vertiefung, um sicherzustellen, dass die Gelatine den gesamten Bereich des Bohrlochs erstreckt. Legen Sie in einem 37 ° C Inkubator und Inkubation für mindestens 20 min. Nach der Inkubation der Platten zu entfernen und die Gelatine absaugen. </li><li> Platte MEFs mit Standard DMEM mit einer Dichte von 25.000 Zellen pro Vertiefung (150.000 Zellenpro 6-Well-Platte) auf der gelierten 6-Well-Platte (n) aus Schritt 3.1 und ermöglichen O / N in einem 37 ° C Inkubator absetzen. </li><li> Bereiten Sie eine 100 ul-Virus-Cocktail durch Mischen von 50 &amp; mgr; l M2rtTA und die restlichen 50 ul einer Mischung aus GATA2, Gfi1b, cFos und ETV6 (12,5 ul jeweils). </li><li> Absaugen Medien von MEFs und 2 mL Standard DMEM mit 8 ug / ml Hexadimethrinbromid. </li><li> O / N bei 37 ° C transduzieren jede Vertiefung der MEF-Platten mit 15 ul des Cocktail-Virus und brüten. Hinweis: Dies ist Tag 0 der Reprogrammierung. </li><li> Am Tag 1 nach 16-20 h Inkubation ersetzen Medien mit 2 ml frischem Standard DMEM mit 1 ug ergänzt / ml DOX pro Vertiefung. </li><li> Bereiten hämatopoetischen Kulturmedien mit Hydrocortison supplementiert (10 -6 M), 100 ng / mL Stammzellfaktor (SCF), 100 ng / ml Fms-verwandte Tyrosinkinase 3 - Ligand (Flt3L), 20 ng / ml Interleukin-3 (IL- 3) 20 ng / ml Interleukin-6 (IL-6) und 1 &amp; mgr; g / ml DOX. </li><li> Am Tag 4 aspirate Medien aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Zellen mit 1 ml PBS pro Vertiefung. </li><li> Absaugen PBS distanzieren Zellen unter Verwendung von 1 ml 0,05% Trypsin pro Vertiefung und die Zellen zu sammeln. </li><li> Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer, Spin bei 300 g für 5 min, Resuspension in 12 ml hämatopoetischen Medien in Schritt 3.7 beschriebenen und Platte 60.000 Zellen pro 6-Well-Platte auf 0,1% Gelatine beschichtete Platten (2 ml pro Vertiefung, 10.000 Zellen pro Vertiefung ). </li><li> Ersetzen Medien mit frischen hämatopoetischen supplementierten Nährböden alle 6 Tage für die Dauer der Kultur (35-36 Tage). </li><li> Analysieren Sie entweder Zwischenzellen oder Schwellen hämatopoetischen-ähnlichen Zellen über Immunfärbung 12, FACS - Analyse 8,12, qRT-PCR 12 und mRNA - Sequenzierung 12 den Erwerb von hemogenic endothelialen oder HSC-ähnliche Markierungen und die Genexpression zu bestätigen. </li></ol> 4. Plazentare Aggregation und koloniebildende Einheit (CFU) Assays in Methylcellulose <ol><li> Präparieren Plazenten von schwangeren C57BL / 6 - Mäuse wie zuvor beschrieben 18 bei E12,5 und halten Gewebe auf Eis. </li><li> Um 19 Plazenta Dissoziation beginnen, waschen Plazentagewebe in 2-5 ml 0,2% Kollagenase Typ I in PBS mit 20% FBS und mechanisch mit einer 18G Nadel distanziere durch Passagierung die Plazenta und PBS durch die Nadel einer 5 - ml - Spritze angebracht in mindestens dreimal. </li><li> Nach der mechanischen Dissoziation, halten für 1,5 Std Plazentazellen in 2-5 ml Kollagenase-Lösung bei 37 ° C. </li><li> Passage-Zellen durch 20-25 G Nadeln auf 5 ml Spritzen mehrmals angebracht weiter distanzieren mechanisch die Plazentazellen. </li><li> Filter Einzelzellsuspensionen durch 70 um Zellsiebe. </li><li> Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer und bestrahlen bei 2.000 cGy für mitotische Inaktivierung 20. </li><li> 10 ml hämatopoetischen Nährmedien mit 100 ng / ml SCF ergänzt, 100 ng / ml Flt3L, 20 ng / ml IL-3, 20 ng / ml IL-6, und 10 ng / ml Thrombopoietin (TPO) auf eine 10 cm Gericht. HINWEIS: DOX ist in diesem Stadium nicht erforderlich. </li><li> Legen Sie ein 0,65-um-Filter direkt auf das hämatopoetische Kulturmedien in der Schale, so dass sie zu schweben ein Flüssigkeits-Gas-Schnittstelle zu schaffen und die Schale beiseite stellen. </li><li> Dissoziieren Tag 25 transduziert MEFs (abgeleitet von Schritt 3.11) als 3,8 bis 3,10 in den Schritten und mit 167.000 Zellen der Plazenta-Aggregate aus Schritt 4.6 33.000 der transduzierten MEFs mischen (1: 6-Verhältnis). </li><li> Ein Aggregat 18,21, erste Spin - Down der MEF und Plazenta - Zellmischung aus Schritt 4.9 für 5 Minuten bei 300 x g zu erzeugen. Absaugen Medien und Resuspendieren der pelletierten Zellen in 30-50 ul Standard DMEM eine P200-Pipette, die Einzelzellsuspension in die 200 ul nonbevelled Pipettenspitze zu ziehen. </li><li> Verschließen Sie die Pipettenspitze mit Paraffinfilm. Legen Sie die blockierten Spitze in einen 15 ml-Zentrifugenröhrchen und Spin-down für 5 Minuten bei 300 g so ein Pellet bildet sich an der überdachten Ende der Spitze. </li><li> Die Spitze aus dem 15-ml-Röhrchen sorgfältig und Ortdie Spitze auf das Ende der P200 Pipette. Entsorgen Sie die Paraffinfilm und extrudieren des Zellpellets auf das Floating-Filter aus Schritt 4.8. HINWEIS: Platte höchstens 3 Aggregate pro Filter. </li><li> Kultur die Aggregate auf den schwebenden 0,65 um Filter für 4-5 Tage in 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Sammle die Aggregate (höchstens 3 pro Filter) mit einem Zellschaber, kombiniert sie und Verdau mit 0,2% Kollagenase, nach dem gleichen Protokoll wie bei den ganzen Plazenten getan, um die Zellen dissoziiert (Schritte 4,2-4,5). </li><li> Nach Dissoziation, waschen Sie die Aggregate mit 2-5 ml PBS mit 5% FBS und Zellen bei 300 g für 5 min Spin-Down. </li><li> Resuspendieren der Aggregate in 500 &amp; mgr; l DMEM ohne FBS, P / S, oder L-GLUT. Nehmen Sie das 500 &amp; mgr; l Aufwirbelung und fügen Sie ihn in 3 ml 1% Methyl Medien, ergänzt mit 10 / ml TPO ng, sorgfältig die Bildung von Blasen zu vermeiden. Platte gleichen Volumen dieser Mischung in 3 35 x 10 mm nicht behandelte Kulturschalen fürCFU - Assays 12. </li><li> Als Kontrolle wurden bestrahlte Kultur plazentalen Aggregate ohne 4-5 Tage in umprogrammiert MEFs Mischen und in CFU-Assays wie oben 4,7-4,16 in Schritten beschrieben. HINWEIS: Diese Aggregate allein keine Kolonien bilden. </li><li> Zählen hämatopoetische Kolonien manuell unter dem Mikroskop nach 10-14 Tagen Kultur bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Cytospin 22 nahm Kolonien morphologischen Phänotyps von einzelnen Zellen zu zeigen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.

Erzeugen HSPCs de novo aus leicht erreichbar somatischen Zellen bietet eine einzigartige Methode der Hämatopoese in vitro zu untersuchen und die Möglichkeit, potentiell diese Technologie auf das menschliche System anzuwenden. Diese Übersetzung würde ein neues Werkzeug zu studieren menschliche hämatologische Erkrankung in einer Schale zu erzeugen, sowie Drogentestplattformen und Gen-Targeting-Möglichkeiten bieten zu zahlreichen Erkrankungen mit neuartiger Therapeutika oder HSC-Transplantationen behandel...

Hämatopoese ist ein komplexer Prozess , bei dem Entwicklungs hämatopoetischer Stammzellen (HSZ) vorhanden hemogenic Endothel abgeschnürt in einer Vielzahl von embryonalen hämatopoetischen Stätten wie die Aorta-Gonad-Mesonephros und der Plazenta 1,2. Die Unfähigkeit zur Kultur HSCs in vitro verhindert , dass die eingehende Analyse dieses Prozesses sowie die klinische Anwendung dieser Studien. Zur Umgehung dieser Einschränkung, frühere Studien haben versucht abzuleiten HSZ de novo entweder über die Differenzierung von pluripotenten Stammzellen (PSCs) 3, oder induzierte Plastizität in somatischen Zellen und gerichtete Differenzierung mit Neuprogrammierung Medien 4,5. Diese Studien jedoch erzeugen keine klinisch sicher engraftable Zellen oder erlauben Studie der endgültigen Entwicklung Hämatopoese &quot;in einer Schale.&quot; Das neue Werk von Yamanaka etabliert und Kollegen pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) aus somatischen Fibroblasten p induziert zu erzeugen,rovides einen Rahmen für die Transkriptionsfaktor (TF) basierend Überexpression Strategien in Reprogrammierung des Zellschicksals 6,7. Diese Arbeit hat aufgefordert, die Ermittler in mehreren Bereichen Zelltypen der Wahl über TF Reprogrammierung von leicht zugänglichen somatischen Zellen zu erzeugen. Das Ziel der hier beschriebenen Umprogrammierung Strategie ist eine hemogenic Prozess von Maus somatischen Zellen zu induzieren , unter Verwendung eines TF basierend Umprogrammierung Ansatz mit dem Ziel , diese Erkenntnisse auf das menschliche System des Übersetzens patientenspezifischen Fibroblasten um umprogrammieren humanen Hämatopoese in vitro zu studieren und erzeugen patientenspezifische Blutprodukte für Krankheitsmodelle, Drogentests und Stammzelltransplantation. Der erste Schritt richtige Umprogrammierung in diesem Maus-System, um sicherzustellen, war ein Reporter Linie zu entwickeln, die als Auslese für CD34-Expression, ein bekannter Marker in endothelialen Vorläuferzellen und HSZ serviert. Dazu wurden die huCD34-tTA und TetO-H2BGFP transgene Mauslinien verwendet, um generate doppelt transgenen embryonalen Maus - Fibroblasten (MEF), bezeichnet nun 34 / H2BGFP, die 8 bei Aktivierung des CD34 - Promotors grün fluoreszieren. Dies erlaubt Screenen einer Vielzahl von TFs bekannt an verschiedenen Punkten während des hämatopoetischen Spezifikation und Entwicklung benötigt werden. Beginnend mit 18 TFs in pMX retrovial Vektoren (bestimmt durch die Literatur Bergbau und Profilierung von GFP etikettenhalt HSZ aus dem zuvor 34 beschrieben / H2BGFP Mäuse), 34 / H2BGFP MEFs wurden transduziert mit allen Faktoren und kultiviert auf AFT024 HSC tragende Stromazellen. Nach der Erkennung von 34 / H2BGFP Aktivierung wurde identifiziert TFs wurden anschließend von der Umprogrammierung Cocktail bis die optimale Menge von TFs für Reporter Aktivierung entfernt. Nach diesem ersten Bildschirm wurden die Faktoren, die zu einem DOX induzierbaren pFUW Vektorsystem übertragen steuerbaren Expression der TFs zu ermöglichen. Da diese beiden DOX steuerbare Systeme inkompatibel sind (die 34 / H2BGFP Zellen und die pFUW induzierbarer Vektoren), MEFs ausWildtyp C57BL / 6-Mäuse wurden erforderlich. Es war auch notwendig, eine geeignete Mikroumgebung zur Verfügung zu stellen hemogenesis fortzufahren und schaffen multilineage clonogene Vorläufern zu ermöglichen. Aktuelle Studien somatischen Zellen in hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) haben vielfältige Erfolgsstufen 9-11 erfüllt umprogrammieren versuchen. Bis heute ist die Erzeugung von Maus und Mensch transplantierbaren HSPCs mit langfristigen und sich selbst erneuernde repopulating Fähigkeit wurde mit dem gleichen Satz von TFs nicht erreicht. In diesem Protokoll stellen wir eine detaillierte Beschreibung der zuvor festgelegten Strategie zu reproduzierbar hemogenesis MEFs induzieren. Wir zeigen , dass die Einführung eines minimalen Satz von TFs (GATA2, Gfi1b, cFos und ETV6) ist in der Lage ein komplexes Entwicklungsprogramm in vitro angestiftet , die eine Plattform kann weiter durch die Entwicklung der Hämatopoese und klinische Anwendung von hämatopoetischen Neuprogrammierung bietet 12 untersucht werden.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; M Filter</td><td>Corning</td><td>430625</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Zentrifugalfilter</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini's Benchmark</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>18 G Nadeln</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>20 G Nadeln</td><td>BD</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>25 G Nadeln</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ I</td><td>Sigma</td><td>C0130-100MG</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Myelocult Medien</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>M5300</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>Forschung & Technik D Systems</td><td>455-MC</td><td></td></tr><tr><td>Flt3L</td><td>R & D Systems</td><td>427-FL</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>R & D Systems</td><td>403-ML</td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>R & D Systems</td><td>406-ML</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>R & D Systems</td><td>488-TO</td><td></td></tr><tr><td>Doxycyclin</td><td>Sigma</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Polybren (Hexadimethrinbromid)</td><td>Sigma</td><td>AL-118</td><td></td></tr><tr><td>Durapore 0,65 &mu; M Membranfilter</td><td>Millipore</td><td>DVPP14250</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose Medien</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>Methocult M3434</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>07904</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G-1890 100g</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #20321</td><td></td></tr><tr><td>Gata2</td><td>Origene</td><td>MR226728</td><td></td></tr><tr><td>Gfi1b</td><td>Origene</td><td>MR204861</td><td></td></tr><tr><td>cFos&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #19259</td><td></td></tr><tr><td>Etv6</td><td>Origene</td><td>MR207053</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12259</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670-100g</td><td></td></tr><tr><td>FUW-M2rtTA</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #20342</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Kultur Geschirr</td><td>Thermo Scientific</td><td>171099</td><td></td></tr></tbody></table>

maus umprogrammieren embryonale fibroblasten mit transkriptionsfaktoren ein hemogenic programm zu induzieren

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Dieses Protokoll beschreibt die Induktion eines hämogenen Programms in embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus durch Überexpression von Transkriptionsfaktoren (TFs). Wir haben zunächst einen Reporter-Screen mit MEFs von humanen CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) doppeltransgenen Mäusen entwickelt. CD34+-Zellen dieser Mäuse markieren H2B-Histone mit GFP und hören nach Zugabe von Doxycyclin (DOX) auf zu markieren. MEFS wurden mit Kandidaten-TFs transduziert und dann auf das Auftreten von GFP+-Zellen beobachtet, die auf den Erwerb eines hämatopoetischen oder endothelialen Zellschicksals hinweisen würden. Ausgehend von 18 Kandidaten-TFs und durch einen Prozess der kombinatorischen Eliminierung erhielten wir eine minimale Anzahl von Faktoren, die den höchsten Prozentsatz an GFP+-Zellen induzieren würden. Wir stellten fest, dass Gata2, Gfi1b und cFos notwendig waren und die Zugabe von Etv6 die optimale Induktion lieferte. Eine Reihe von Genexpressionsanalysen, die zu verschiedenen Zeitpunkten während des Reprogrammierungsprozesses durchgeführt wurden, zeigten, dass diese Zellen eine Vorläuferzelle zu durchlaufen schienen, die einen endothelialen zu hämatopoetischen Übergang (EHT) durchlief. Als solcher ahmt dieser Reprogrammierungsprozess die Entwicklungshämatopoese "in einer Schale" nach und ermöglicht die Untersuchung der Hämatopoese in vitro und eine Plattform, um die Mechanismen zu identifizieren, die dieser Spezifikation zugrunde liegen. Diese Methodik bietet auch einen Rahmen für die Translation dieser Arbeit in das menschliche System in der Hoffnung, eine alternative Quelle für patientenspezifische hämatopoetische Stammzellen (HSCs) für eine Reihe von Anwendungen in der Behandlung und Erforschung hämatologischer Erkrankungen zu generieren.

Hämatopoese ist ein komplexer Entwicklungsprozess, in verschiedenen embryonalen Standorten beginnt. Hemogenic Endothelzellen befinden sich in diesen Seiten und führen zu HSZ über Zelle 23 Knospung. Dieser Prozess derzeit nicht durch das Platzieren HSZ oder hämatopoetische Vorläufer in Kultur reproduziert werden, wobei eine Methode erforderlich , diese Zellen in vitro , um irgendwie zu erhalten, entweder durch HSPC Expansion ex vivo oder Generation de novo...

Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Induktion eines hämogenen Programms in embryonalen Fibroblasten der Maus durch Überexpression eines minimalen Satzes von Transkriptionsfaktoren. Diese Technologie kann auf das menschliche System übertragen werden, um Plattformen für zukünftige Studien zur Hämatopoese, zu hämatologischen Erkrankungen und hämatopoetischen Stammzelltransplantationen bereitzustellen.

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Das übergeordnete Ziel dieses hämogenen Induktionsprotokolls besteht darin, einen Entwicklungsprozess in murinen Fibroblasten durch die Überexpression von Transkriptionsfaktoren in vitro einzuleiten, um hämatopoetische Vorläuferzellen zu erzeugen, die bei längerer Kultivierung hämatopoetische Zellen hervorbringen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der hämatopoetischen Programmierung zu beantworten, beispielsweise, ob ein Protokoll entwickelt werden kann, um echte HSCs de novo zu erhalten, die zu Multilinien-Differenzierung und Transplantationseingliederung fähig sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass durch die Überexpression einer minimalen Anzahl von Transkriptionsfaktoren der Entwicklungsprozess in reprogrammierten Zellen initiiert werden kann, ohne dass ein pluripotenter Zwischenzustand durchlaufen werden muss.Nach der Kultivierung von embryonalen Mausfibroblasten oder MEFS und der Herstellung des Virus gemäß dem schriftlichen Protokoll, verwenden Sie 0,1 Prozent Gelatine in PBS, um 6-Well-Platten vorzubehandeln. Stellen Sie sicher, dass die Gelatine die gesamte Fläche des Wells bedeckt. Inkubieren Sie die Platten mindestens 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Entfernen Sie anschließend die Platten und aspirieren Sie die Gelatine. Säen Sie die MEFs mit standardmäßigem DMEM bei einer Dichte von 25.000 Zellen pro Vertiefung aus und lassen Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius anschwellen. Bereiten Sie ein 100-Mikroliter-Viruscocktail durch Mischen von 50 Mikrolitern M2RTTA und jeweils 12,5 Mikrolitern GATA2, GFI1B, CFOS und ETV6 vor.Entfernen Sie das Medium von den MEFs und geben Sie zwei Milliliter standardmäßiges DMEM mit 8 Mikrogramm pro Milliliter Hexadimethrinbromid hinzu. Transduzieren Sie dann jede Vertiefung mit 15 Mikroliter der Viruscocktails und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Nach einer Inkubation von 16 bis 20 Stunden ersetzen Sie das Medium in jeder Vertiefung durch zwei Milliliter frisches standardmäßiges DMEM, ergänzt mit einem Mikrogramm pro Milliliter DOX.Bei 37 Grad Celsius drei Tage lang inkubieren. Am vierten Tag hämatopoetisches Kulturmedium ansetzen, das mit Hydrocortison, Stammzellfaktor, Ligand für die mit MFS verwandte Tyrosinkinase drei, Interleukin drei, Interleukin sechs und DOX ergänzt wurde. Danach das Medium von den MEFs abpipettieren und die Zellen mit einem Milliliter PBS waschen.Danach, nachdem das PBS abgesaugt wurde, je Brunnen ein Milliliter 0,05-prozentiges Trypsin hinzufügen, um die Zellen zu lösen und zu sammeln. Mit dem Hämozytometer die Zellen zählen, anschließend fünf Minuten lang mit 300 × g zentrifugieren und 12 Milliliter des gerade hergestellten hämatopoetischen Mediums verwenden, um die Zellen erneut in Suspension zu bringen. Danach 10.000 Zellen pro Brunnen auf mit Gelatine beschichteten Sechs-Well-Platten aussäen.Ersetzen Sie alle sechs Tage das Medium durch frisches, supplementiertes hämatopoetisches Kulturmedium für die gesamte Dauer der Kultur. Analysieren Sie die Zellen gemäß dem Textprotokoll. Nach der Präparation von Plazenten aus trächtigen Mäusen gemäß dem Textprotokoll waschen Sie das Gewebe mit zwei bis fünf Milliliter 0,2-prozentigem Kollagenase Typ eins in PBS mit 20 Prozent FBS und dissoziieren das Gewebe mechanisch in der PBS-Lösung unter Verwendung einer mit einer 18-Gauge-Nadel ausgestatteten Fünf-Milliliter-Spritze.Die Plazentazellen in zwei bis fünf Milliliter Kollagenase-Lösung bei 37 Grad Celsius für 1,5 Stunden inkubieren. Anschließend die Zellen mehrmals durch Nadeln mit einer Größe von 20 bis 25 Gauge, die an 5-Milliliter-Spritzen befestigt sind, passieren, um sie weiter mechanisch zu dissoziieren. Danach die Einzelzell-Suspensionen durch 70-Mikron-Zellseparatoren filtrieren.Verwenden Sie anschließend ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen, und bestrahlen Sie sie mit 2.000 Zentigray-Volt zur mitotischen Inaktivierung. Geben Sie zehn Milliliter hämatopoetisches Kulturmedium, das mit folgenden Zusätzen angereichert ist, in eine zehn Zentimeter große Petrischale. Legen Sie den 0,65-Mikron-Filter direkt auf das Kulturmedium in der Schale, lassen Sie ihn schwimmen, um eine Flüssigkeits-Gas-Grenzfläche zu erzeugen, und stellen Sie die Schale beiseite.Lösen Sie die am Tag 25 transduzierten MEFs wie zuvor in diesem Video gezeigt auf und mischen Sie 33.000 der transduzierten MEFs mit 167.000 Zellen der mitotisch inaktivierten Plazenta-Aggregate. Um ein Aggregat zu erzeugen, zentrifugieren Sie die Mischung aus MEFs und Plazentazellen bei 300 × g für fünf Minuten. Aspirieren Sie das Medium und verwenden Sie 30 bis 50 Mikroliter Standard-DMEM, um die Zellen im Pellet erneut in Suspension zu bringen, wobei Sie die Einzelzell-Suspension in eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze ohne Abschrägung aufziehen.Danach verschließen Sie die Pipettenspitze mit Paraffinfolie. Anschließend setzen Sie die verschlossene Spitze in ein 15-Milliliter-Zentrifalenröhrchen und zentrifugieren sie 5 Minuten lang bei 300 × g, sodass sich ein Pellet am abgedeckten Ende der Spitze bildet. Entfernen Sie die Spitze vorsichtig aus dem 15-Milliliter-Röhrchen und setzen sie auf das Ende einer P200-Pipette auf.Entfernen Sie den Paraffin-Film und pressen Sie das Zellpellet auf den Filter, der in der Schale mit Kulturmedium schwimmt. Kultivieren Sie die Aggregate auf den schwimmenden Filtern bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid für vier bis fünf Tage. Sammeln Sie die Aggregate mithilfe eines Zellabstreifers, kombinieren Sie sie und verdauen Sie sie mit 0,5 Prozent Kollagenase.Nach der Dissoziation zwei bis fünf Milliliter PBS mit fünf Prozent FBS verwenden, um die Aggregate zu waschen, und bei 300 × g für fünf Minuten zentrifugieren. Die Aggregate in 500 Mikrolitern DMEM ohne FBS, Pen-Strep oder L-Glutamin resuspendieren. Die gesamte Suspension zu drei Millilitern eines einprozentigen Methylcellulose-Mediums hinzufügen, das mit zehn Nanogramm pro Milliliter Tepo ergänzt ist, und dabei sorgfältig die Bildung von Blasen vermeiden.Plattieren Sie gleiche Volumina dieser Mischung in drei nicht behandelten Kulturgefäßen mit einer Größe von 35 mal 10 Millimetern für CFU-Assays. Als Kontrolle kultivieren Sie bestrahlte Plazenta-Aggregate. Zählen Sie hämatopoetische Kolonien abschließend manuell unter dem Mikroskop nach zehn bis 14 Tagen Kultivierung bei 37 Grad Celsius mit 5 Prozent Kohlendioxid.Während des Reprogrammierungsprozesses von MEFs zu HSCs werden die Zellen wie hier gezeigt mit Transkriptionsfaktoren transduziert. Nach drei Tagen der Expansion und Exposition gegenüber DOX zur Initiierung der Transgenaktivierung werden die Zellen dissoziiert, aufgeteilt und auf mit Gelatine beschichteten Platten in ergänztem hämatopoetischem Medium kultiviert. Am Tag 20 der Kultur nach der Transduktion mit Reprogrammiermedium zeigen die 34/H2BGFP-MEFs deutliche morphologische Veränderungen, einschließlich einer endothelialen Morphologie, die sich von der der MEFs unterscheidet.Weitere Kultivierung bis zum Tag 35 führt zur Bildung mehrerer runder, blutbildenden Zellen, die aus endothelialen Intermediaten hervorgehen, die GFP-positiv sind und für die hämatopoetischen Marker Sca1 und CD45 positiv färben. Eine weitere Kultivierung führt zu Zellen, die CD45 exprimieren, während sie gleichzeitig die Expression des humanen CD34-Reporters aufrechterhalten. Nach plazentarer Aggregation entwickeln die Kulturzellen ein klonogenes Potenzial und bilden Kolonien in Methylcellulose, die verschiedene hämatopoetische Morphologien sowie blastenähnliche Zellen enthalten.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, jeden Abschnitt langsam auszuführen, um Verwechslungen zu vermeiden. Fehler werden erst Wochen nach Beginn der Reprogrammierung auffallen. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Cobblestone-bildende Zelltests und Langzeitkultur-initiierende Zelltests durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise ob die gewonnenen Zellen tatsächlich hämatopoetische Funktion besitzen, wie in den Funktionsanalysen gezeigt.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der hämatopoetischen Stammzellprogrammierung den Weg, um andere Reprogrammierungsstrategien und Optimierungsprotokolle in Blut-, endothelialen und anderen Zelltypen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein hämogenes Programm in murinen Fibroblasten induziert, wie man Transkriptionsfaktoren überexprimiert und wie man die gewonnenen Zellen funktionell untersucht. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

reprogramming-mouse-embryonic-fibroblasts-with-transcription-factors

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen mit induzierbaren Lentivirus, dass ausdrückliche Oct4, Sox2, c-Myc und Klf4.

Generieren von iPS-Zellen aus MEFS durch Forced Expression von Sox-2, Oct-4, c-Myc und Klf4

Die Stemgent Dox Inducible Maus TF Lentivirus Set kann embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs), um induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) neu zu programmieren. Hier haben wir das Protokoll für DOX-induzierbare Expression von Maus Umprogrammierung Transkriptionsfaktoren Oct4 zu demonstrieren, Sox2, Klf4 und c-Myc iPS Kolonien, die ausdrückliche gemeinsamen mES Pluripotenz Marker zu generieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung embryonalen Maus-Fibroblasten mit einem Vier Transcription Factor, induzierbare Doxycycline Lentivirale Transduktionssystems

Embryonale Fibroblasten der Maus können durch die erzwungene Expression der Transkriptionsfaktoren Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc mit geringer Effizienz in induzierte pluripotente Stammzellen reprogrammiert werden. Die seltenen Zwischenprodukte der Reprogrammierungsreaktion sind FACS-isoliert durch Markierung mit Antikörpern gegen die Zelloberflächenhersteller Thy-1.2, Ssea-1 und Epcam.

Zelloberflächenmarker vermittelte Reinigung von iPS-Zellen aus einer Zwischen Reprogrammierbare Maus-Modell

Dieses Protokoll beschreibt die effiziente Induktion von hämogenem Endothel und multipotenten hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen durch die erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren.

Direkte Induktion von Hemogenic Endothel und das Blut durch die Überexpression von Transkriptionsfaktoren in der Personal pluripotenten Stammzellen

Dieses Manuskript beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Generierung und Quantifizierung verschiedener reprogrammierter kardialer Subtypen unter Verwendung einer Retrovirus-vermittelten Verabreichung von Gata4, Hand2, Mef2c und Tbx5.

Die Beurteilung Cardiomyocyte Subtypes Nach Transcription Factor-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Maus-Fibroblasten

Hier präsentieren wir eine robuste Methode zur primären embryonale Fibroblasten in funktionellen Herzmuskelzellen durch Überexpression des GATA4, Hand2, Mef2c und Tbx5, MiR-1 und MiR-133 (GHMT2m) neben Hemmung der TGF-β-Signal neu zu programmieren. Unser Protokoll generiert schlagende Herzzellen bereits 7 Tage nach Transduktion mit bis zu 60 % Wirkungsgrad.

Unterdrückung der Pro-fibrotische Signalisierung potenziert Faktor-vermittelten Reprogrammierung von Maus embryonalen Fibroblasten in induzierte Kardiomyozyten

Hier stellen wir Ihnen unser Protokoll für Herstellung von induzierten erythroiden Vorläuferzellen (iEPs) von Maus Erwachsenen Fibroblasten mit Transkription Faktor-driven direkte Abstammung Neuprogrammierung (DLR).

Direkte Linie Reprogrammierung von adulten Maus-Fibroblasten zu erythroiden Vorläuferzellen

Dieses Protokoll demonstriert die Induktion eines hämogen Programms in humanen dermalen Fibroblasten durch erzwungene Expression der Transkriptionsfaktoren GATA2, GFI1B und FOS zur Erzeugung hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen.

Hämogene Reprogrammierung menschlicher Fibroblasten durch erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren

Die experimentelle Validierung der Enhancer-Aktivität erfolgt am besten durch eine Funktionsverlustanalyse. Hier wird ein effizientes Protokoll vorgestellt, das die CRISPR/Cas9-vermittelte Deletion verwendet, um die allelspezifische Regulation der Gentranskription in F1-ES-Zellen zu untersuchen, die ein Hybridgenom (Mus musculus129 x Mus castaneus) enthalten.

Generieren von CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic Löschungen Enhancer-Funktion in embryonalen Stammzellen der Maus zu studieren

Hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) leiten sich von spezialisierten (hemogenic) Endothelzellen während der Entwicklung, noch wenig über das Verfahren bekannt, von denen einige Endothelzellen angeben zu werden Blut bilden. Wir zeigen eine Durchflusszytometrie basierende Methode ermöglicht die gleichzeitige Isolierung von hemogenic Endothelzellen und HSPC aus murinen embryonalen Geweben.

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

Lernen Sie die Umprogrammierung von Maus-Embryonalfibroblasten durch Überexpression von Transkriptionsfaktoren zur Induktion eines hämogenen Programms. Diese Methode ermöglicht die direkte Generierung hämatopoietischer Vorläuferzellen ohne pluripotente Zwischenstufe.

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

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