Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

Das übergeordnete Ziel dieses hämogenen Induktionsprotokolls besteht darin, einen Entwicklungsprozess in murinen Fibroblasten durch die Überexpression von Transkriptionsfaktoren in vitro einzuleiten, um hämatopoetische Vorläuferzellen zu erzeugen, die bei längerer Kultivierung hämatopoetische Zellen hervorbringen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der hämatopoetischen Programmierung zu beantworten, beispielsweise, ob ein Protokoll entwickelt werden kann, um echte HSCs de novo zu erhalten, die zu Multilinien-Differenzierung und Transplantationseingliederung fähig sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass durch die Überexpression einer minimalen Anzahl von Transkriptionsfaktoren der Entwicklungsprozess in reprogrammierten Zellen initiiert werden kann, ohne dass ein pluripotenter Zwischenzustand durchlaufen werden muss.

Nach der Kultivierung von embryonalen Mausfibroblasten oder MEFS und der Herstellung des Virus gemäß dem schriftlichen Protokoll, verwenden Sie 0,1 Prozent Gelatine in PBS, um 6-Well-Platten vorzubehandeln. Stellen Sie sicher, dass die Gelatine die gesamte Fläche des Wells bedeckt. Inkubieren Sie die Platten mindestens 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Entfernen Sie anschließend die Platten und aspirieren Sie die Gelatine. Säen Sie die MEFs mit standardmäßigem DMEM bei einer Dichte von 25.000 Zellen pro Vertiefung aus und lassen Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius anschwellen. Bereiten Sie ein 100-Mikroliter-Viruscocktail durch Mischen von 50 Mikrolitern M2RTTA und jeweils 12,5 Mikrolitern GATA2, GFI1B, CFOS und ETV6 vor.

Entfernen Sie das Medium von den MEFs und geben Sie zwei Milliliter standardmäßiges DMEM mit 8 Mikrogramm pro Milliliter Hexadimethrinbromid hinzu. Transduzieren Sie dann jede Vertiefung mit 15 Mikroliter der Viruscocktails und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Nach einer Inkubation von 16 bis 20 Stunden ersetzen Sie das Medium in jeder Vertiefung durch zwei Milliliter frisches standardmäßiges DMEM, ergänzt mit einem Mikrogramm pro Milliliter DOX.

Bei 37 Grad Celsius drei Tage lang inkubieren. Am vierten Tag hämatopoetisches Kulturmedium ansetzen, das mit Hydrocortison, Stammzellfaktor, Ligand für die mit MFS verwandte Tyrosinkinase drei, Interleukin drei, Interleukin sechs und DOX ergänzt wurde. Danach das Medium von den MEFs abpipettieren und die Zellen mit einem Milliliter PBS waschen.

Danach, nachdem das PBS abgesaugt wurde, je Brunnen ein Milliliter 0,05-prozentiges Trypsin hinzufügen, um die Zellen zu lösen und zu sammeln. Mit dem Hämozytometer die Zellen zählen, anschließend fünf Minuten lang mit 300 × g zentrifugieren und 12 Milliliter des gerade hergestellten hämatopoetischen Mediums verwenden, um die Zellen erneut in Suspension zu bringen. Danach 10.000 Zellen pro Brunnen auf mit Gelatine beschichteten Sechs-Well-Platten aussäen.

Ersetzen Sie alle sechs Tage das Medium durch frisches, supplementiertes hämatopoetisches Kulturmedium für die gesamte Dauer der Kultur. Analysieren Sie die Zellen gemäß dem Textprotokoll. Nach der Präparation von Plazenten aus trächtigen Mäusen gemäß dem Textprotokoll waschen Sie das Gewebe mit zwei bis fünf Milliliter 0,2-prozentigem Kollagenase Typ eins in PBS mit 20 Prozent FBS und dissoziieren das Gewebe mechanisch in der PBS-Lösung unter Verwendung einer mit einer 18-Gauge-Nadel ausgestatteten Fünf-Milliliter-Spritze.

Die Plazentazellen in zwei bis fünf Milliliter Kollagenase-Lösung bei 37 Grad Celsius für 1,5 Stunden inkubieren. Anschließend die Zellen mehrmals durch Nadeln mit einer Größe von 20 bis 25 Gauge, die an 5-Milliliter-Spritzen befestigt sind, passieren, um sie weiter mechanisch zu dissoziieren. Danach die Einzelzell-Suspensionen durch 70-Mikron-Zellseparatoren filtrieren.

Verwenden Sie anschließend ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen, und bestrahlen Sie sie mit 2.000 Zentigray-Volt zur mitotischen Inaktivierung. Geben Sie zehn Milliliter hämatopoetisches Kulturmedium, das mit folgenden Zusätzen angereichert ist, in eine zehn Zentimeter große Petrischale. Legen Sie den 0,65-Mikron-Filter direkt auf das Kulturmedium in der Schale, lassen Sie ihn schwimmen, um eine Flüssigkeits-Gas-Grenzfläche zu erzeugen, und stellen Sie die Schale beiseite.

Lösen Sie die am Tag 25 transduzierten MEFs wie zuvor in diesem Video gezeigt auf und mischen Sie 33.000 der transduzierten MEFs mit 167.000 Zellen der mitotisch inaktivierten Plazenta-Aggregate. Um ein Aggregat zu erzeugen, zentrifugieren Sie die Mischung aus MEFs und Plazentazellen bei 300 × g für fünf Minuten. Aspirieren Sie das Medium und verwenden Sie 30 bis 50 Mikroliter Standard-DMEM, um die Zellen im Pellet erneut in Suspension zu bringen, wobei Sie die Einzelzell-Suspension in eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze ohne Abschrägung aufziehen.

Danach verschließen Sie die Pipettenspitze mit Paraffinfolie. Anschließend setzen Sie die verschlossene Spitze in ein 15-Milliliter-Zentrifalenröhrchen und zentrifugieren sie 5 Minuten lang bei 300 × g, sodass sich ein Pellet am abgedeckten Ende der Spitze bildet. Entfernen Sie die Spitze vorsichtig aus dem 15-Milliliter-Röhrchen und setzen sie auf das Ende einer P200-Pipette auf.

Entfernen Sie den Paraffin-Film und pressen Sie das Zellpellet auf den Filter, der in der Schale mit Kulturmedium schwimmt. Kultivieren Sie die Aggregate auf den schwimmenden Filtern bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid für vier bis fünf Tage. Sammeln Sie die Aggregate mithilfe eines Zellabstreifers, kombinieren Sie sie und verdauen Sie sie mit 0,5 Prozent Kollagenase.

Nach der Dissoziation zwei bis fünf Milliliter PBS mit fünf Prozent FBS verwenden, um die Aggregate zu waschen, und bei 300 × g für fünf Minuten zentrifugieren. Die Aggregate in 500 Mikrolitern DMEM ohne FBS, Pen-Strep oder L-Glutamin resuspendieren. Die gesamte Suspension zu drei Millilitern eines einprozentigen Methylcellulose-Mediums hinzufügen, das mit zehn Nanogramm pro Milliliter Tepo ergänzt ist, und dabei sorgfältig die Bildung von Blasen vermeiden.

Plattieren Sie gleiche Volumina dieser Mischung in drei nicht behandelten Kulturgefäßen mit einer Größe von 35 mal 10 Millimetern für CFU-Assays. Als Kontrolle kultivieren Sie bestrahlte Plazenta-Aggregate. Zählen Sie hämatopoetische Kolonien abschließend manuell unter dem Mikroskop nach zehn bis 14 Tagen Kultivierung bei 37 Grad Celsius mit 5 Prozent Kohlendioxid.

Während des Reprogrammierungsprozesses von MEFs zu HSCs werden die Zellen wie hier gezeigt mit Transkriptionsfaktoren transduziert. Nach drei Tagen der Expansion und Exposition gegenüber DOX zur Initiierung der Transgenaktivierung werden die Zellen dissoziiert, aufgeteilt und auf mit Gelatine beschichteten Platten in ergänztem hämatopoetischem Medium kultiviert. Am Tag 20 der Kultur nach der Transduktion mit Reprogrammiermedium zeigen die 34/H2BGFP-MEFs deutliche morphologische Veränderungen, einschließlich einer endothelialen Morphologie, die sich von der der MEFs unterscheidet.

Weitere Kultivierung bis zum Tag 35 führt zur Bildung mehrerer runder, blutbildenden Zellen, die aus endothelialen Intermediaten hervorgehen, die GFP-positiv sind und für die hämatopoetischen Marker Sca1 und CD45 positiv färben. Eine weitere Kultivierung führt zu Zellen, die CD45 exprimieren, während sie gleichzeitig die Expression des humanen CD34-Reporters aufrechterhalten. Nach plazentarer Aggregation entwickeln die Kulturzellen ein klonogenes Potenzial und bilden Kolonien in Methylcellulose, die verschiedene hämatopoetische Morphologien sowie blastenähnliche Zellen enthalten.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, jeden Abschnitt langsam auszuführen, um Verwechslungen zu vermeiden. Fehler werden erst Wochen nach Beginn der Reprogrammierung auffallen. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Cobblestone-bildende Zelltests und Langzeitkultur-initiierende Zelltests durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise ob die gewonnenen Zellen tatsächlich hämatopoetische Funktion besitzen, wie in den Funktionsanalysen gezeigt.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der hämatopoetischen Stammzellprogrammierung den Weg, um andere Reprogrammierungsstrategien und Optimierungsprotokolle in Blut-, endothelialen und anderen Zelltypen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein hämogenes Programm in murinen Fibroblasten induziert, wie man Transkriptionsfaktoren überexprimiert und wie man die gewonnenen Zellen funktionell untersucht. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.