Messung der Laktase enzymatische Aktivität in das Lehrlabor
6. August 2018
Die enzymatische Aktivität der Laktase ist essentiell für die katabolen Verarbeitung von Disaccharid Laktose. Hier ist die Aktivität der Laktase in Nahrungsergänzungsmitteln gefunden untersucht mit Hilfe eines kolorimetrischen Assays. Dies bietet Studenten eine experimentelle Plattform für die Aktivität der Laktase und Enzym Kinetik zu verstehen.
Diese Methode ist ein nützliches Werkzeug, um die Schülerinnen und Schüler in die Konzepte von Enzymreaktionen einzuführen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie für Studenten mit sehr wenig Erfahrung im Nasslabor geeignet ist und den Studenten robuste Ergebnisse zum Beobachten und Interpretieren liefert. Um das Protokoll zu starten, beschriften Sie eine 15-Milliliter-Tubensuspension.
Eine Laktasetablette mit 200 mg Enzym mit einem Mörser und Stößel zu einem gleichmäßigen Pulver zerkleinern. Geben Sie das resultierende Pulver in das markierte Röhrchen und suspendieren Sie es in 10 Millilitern 100 Millimolar Phosphat gepufferter Kochsalzlösung oder PBS. Die Lösung eine Minute lang vortexen, um die Enzymextraktion zu maximieren.
Übertragen Sie anschließend einen Milliliter aus der Suspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und drehen Sie die Probe eine Minute lang bei 10.000 G, um die Feststoffpartikel zu sedimentieren. Übertragen Sie 500 Mikroliter des Überstands in ein sauberes 1,5-Milliliter-Röhrchen mit der Aufschrift Laktaseextrakt. Geben Sie 390 Mikroliter 100 Millimolar PBS in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit der Beschriftung Reaktion A. Fügen Sie dann 100 Mikroliter Fünf-Millimolar-ONPG-Lösung hinzu und mischen Sie es gut durch Vortexen.
Geben Sie 10 Mikroliter Extrakt in das Reaktions-A-Röhrchen und wirbeln Sie den Inhalt ein. Beobachten Sie das Reaktionsgemisch häufig fünf Minuten lang und notieren Sie alle kolorimetrischen Veränderungen der Lösung. Richten Sie zwei 1,5-Milliliter-Röhrchen ein, eines mit der Beschriftung der Reaktion B, eines mit der Beschriftung der Kontrolle.
Geben Sie 390 Mikroliter 100 Millimolar PBS in das Reaktionsröhrchen B, 400 Mikroliter 100 Millimolar PBS in das Kontrollröhrchen und geben Sie dann 100 Mikroliter Fünf Millimolar ONPG in jedes Röhrchen. Mischen Sie den Inhalt durch Vortexen. Geben Sie 10 Mikroliter Laktaseextrakt in das Reaktionsröhrchen B, mischen Sie es durch Vortexen und lassen Sie die Reaktion eine Minute lang bei Raumtemperatur ablaufen.
Nach Ablauf einer Minute geben Sie 500 Mikroliter eines molaren Natriumcarbonats in beide Röhrchen, um das Laktaseenzym durch Erhöhung des pH-Werts zu hemmen und die Reaktion zu stoppen. Übertragen Sie 500 Mikroliter aus jedem Röhrchen in saubere Spektralphotometer-Küvetten und messen Sie die Extinktion bei 420 Nanometern. Richten Sie drei Kontrollröhrchen und drei Reaktionsröhrchen ein und beschriften Sie sie mit vier Grad Celsius, Raumtemperatur und 37 Grad Celsius.
Nach der Zugabe des Enzymextrakts inkubieren Sie ein Röhrchen auf Eis, eines bei Raumtemperatur und eines bei 37 Grad Celsius in einem vorgewärmten Wasserbad für eine Minute. Stoppen Sie dann die Reaktion, indem Sie 500 Mikroliter eines molaren Natriumcarbonats in jedes Röhrchen geben. Messen Sie die Extinktion bei 420 Nanometern für jedes Röhrchen.
Notieren Sie die Werte, wobei der Kontrollwert jeweils vom Reaktionswert subtrahiert wird. Unter Verwendung des Protokolls bleibt die Kontrolle klar, während die Reaktionslösung, die Extrakt aus der Laktasetablette enthält, gelb wird, wenn ONPG hydrolysiert wird und ortho-Nitrophenol freigesetzt wird. Nach der Analyse der Proben mit dem Spektralphotometer ist die Produktion von ortho-Nitrophenol am geringsten, wenn die Reaktion auf Eis inkubiert wird, und am höchsten, wenn die Reaktion bei 37 Grad Celsius durchgeführt wird.
Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass die Reaktionen vor der Zugabe des Enzymextrakts die richtige Temperatur haben.
Übersicht
Dieser Artikel stellt einen kolorimetrischen Assay zur Messung der enzymatischen Aktivität von Lactase vor, die für die Lactoseverdauung entscheidend ist. Die Methode ist für Studierende mit minimaler Erfahrung in der nassen Laborarbeit konzipiert und ermöglicht es ihnen, die Enzymkinetik effektiv zu beobachten und zu interpretieren.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biochemie
- Enzymkinetik
- Ausbildung in Laborverfahren
Hintergrund
- Lactase ist ein Enzym, das Laktose in Glukose und Galactose abbaut.
- Das Verständnis der Enzymaktivität ist grundlegend in der Biochemie und verwandten Fachgebieten.
- Farbmessassays liefern eine visuelle Darstellung enzymatischer Reaktionen.
- Diese Methode ist für Studierende mit begrenzter Laborerfahrung zugänglich.
Zweck der Studie
- Die Studierenden sollen mithilfe eines praktischen Experiments in die Enzymkinetik eingeführt werden.
- Es soll eine zuverlässige Methode zur Messung der Lactase-Aktivität bereitgestellt werden.
- Das Verständnis der Faktoren, die enzymatische Reaktionen beeinflussen, soll vertieft werden.
Verwendete Methoden
- Herstellung eines Lactase-Extrakts aus Nahrungsergänzungsmitteln.
- Farbmessung der Produktion von ortho-Nitrophenol.
- Vergleich der Enzymaktivität bei verschiedenen Temperaturen.
- Verwendung der Spektrophotometrie zur Quantifizierung von Extinktionsänderungen.
Hauptergebnisse
- Die Reaktionsmischung färbt sich gelb, da ONPG durch Lactase hydrolysiert wird.
- Die Enzymaktivität ist bei 37 Grad Celsius am höchsten und auf Eis am niedrigsten.
- Die Kontrollproben bleiben klar, was die Spezifität des Assays bestätigt.
- Die Ergebnisse zeigen den Einfluss der Temperatur auf die Enzymkinetik.
Schlussfolgerungen
- Der farbmetrische Test veranschaulicht die Lactase-Aktivität wirksam.
- Diese Methode eignet sich für pädagogische Zwecke in der Biochemie.
- Das Verständnis der Enzymkinetik ist entscheidend für zukünftige Studien zu Stoffwechselprozessen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses pädagogische Protokoll demonstriert einen grundlegenden Enzymaktivitätstest unter Verwendung von Lactase, einem therapeutisch relevanten Ziel bei gastrointestinalen Erkrankungen. Die farbmetrische Methode bietet einen skalierbaren und reproduzierbaren Ansatz zur Vermittlung von Prinzipien der Enzymkinetik, die für die frühe Zielvalidierung und die Assay-Entwicklung in der biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung anwendbar sind. Indem die enzymatische Funktion mit einem klinisch signifikanten Substrat (ONPG) verknüpft wird, unterstützt der Test die mechanistische Risikominderung und schafft Vorhersagevertrauen in enzymzielgerichtete therapeutische Strategien.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Lactase-Enzymfunktion und Substratspezifität und unterstützt die Überprüfung von Hypothesen in Modellen gastrointestinaler Erkrankungen.
- Operationaler Wert: Verwendet kommerziell erhältliche Lactase aus Nahrungsergänzungsmitteln und bietet somit ein kostengünstiges, leicht zugängliches System für vorläufige Untersuchungen zur Zielinteraktion.
- Predictiver Wert: Quantitative Absorptionsmessungen bei 420 nm ermöglichen die Beurteilung der Enzymaktivität unter verschiedenen Bedingungen und liefern Hinweise auf Struktur-Wirkungs-Beziehungen sowie zur Auswahl von Leitverbindungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Eignung: Die auf ONPG basierende colorimetrische Reaktion erzeugt ein quantifizierbares gelbes Produkt (ortho-Nitrophenol), das Auslesemethoden mit hoher Durchsatzkapazität für die Untersuchung von Enzymhemmung oder -aktivierung ermöglicht.
- Reproduzierbarkeit: Standardisierte Extraktion aus Tabletten und kontrollierte Inkubationsbedingungen (Eis, Raumtemperatur, 37 °C) gewährleisten konsistente Ergebnisse über alle Wiederholungen hinweg und stützen die Robustheit des Assays.
- Skalierbarkeit: Das einfache, röhrchenbasierte Format mit spektrophotometrischer Detektion erlaubt die Anpassung an Mehrlochplattformen zur Untersuchung von Substanzbibliotheken.
Translationale und präklinische Forschung
- Klinische Relevanz: Ein Laktasemangel ist direkt mit der Laktoseintoleranz verknüpft, wodurch dieser Assay ein relevantes Werkzeug zur Bewertung von Enzymersatztherapien oder diätetischen Interventionen darstellt.
- Translationale Kontinuität: Die temperaturabhängige Aktivitätsprofilerstellung (niedrigste Aktivität auf Eis, höchste bei 37 °C) spiegelt physiologische Bedingungen wider und unterstützt die Vorhersage des in-vivo-Enzymverhaltens.
- Mechanistische Ent风险bewertung: Die klare Unterscheidung zwischen Reaktions- und Kontrollröhren bestätigt die Spezifität des Assays und verringert das Risiko falsch-positiver Ergebnisse bei der nachfolgenden therapeutischen Validierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Lactase-Aktivitäts-Assay fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein, unterstützt die Target-Validierung durch funktionelle Enzymmessung und ermöglicht die Assay-Entwicklung für Screening-Kampagnen, die auf gastrointestinale Targets ausgerichtet sind.
- Entdeckungsbiochemie: Misst die Lactase-vermittelte Hydrolyse von ONPG zur Beurteilung der Enzymfunktion und unterstützt die biologische Entlastung von Lactase als therapeutisches Ziel.
- Screening: Erzeugt quantitative, kolorimetrische Ergebnisse, die zur Bewertung der Wirkung von Modulatoren in auf Enzyme ausgerichteten Screening-Workflows geeignet sind.
- Analytik: Die spektrophotometrische Messung bei 420 nm liefert objektive Daten zum Vergleich der enzymatischen Aktivität unter verschiedenen Bedingungen und ermöglicht eine datengestützte Auswahl von Hits.
- Translationale Forschung: Verknüpft die enzymatische Aktivität mit dem Lactosestoffwechsel und verbindet so in-vitro-Ergebnisse mit klinischer Relevanz bei Malabsorptionsstörungen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Das Protokoll nutzt Standardlaborgeräte (Vortex, Zentrifuge, Spektrophotometer) und ermöglicht eine breite Anwendung in Entdeckungs- und präklinischen Teams.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert Einblicke in die Mechanismen der Enzym-Substrat-Wechselwirkungen und erhöht so die Zielvalidität sowie verringert Unsicherheiten bei der frühen Zielidentifizierung.
- Operationaler Wert: Verwendet robuste, standardisierte Schritte (Tablettenextraktion, Zentrifugation, temperaturgesteuerte Inkubation), die Reproduzierbarkeit gewährleisten und die Variabilität minimieren.
- Strategischer Wert: Unterstützt fundierte Go/No-Go-Entscheidungen, indem klare, quantitative Aktivitätsdaten bereitgestellt werden, wodurch die Abhängigkeit von indirekten oder surrogate Markern verringert wird.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von laktasezielgerichteten Interventionen basierend auf empirischen Aktivitätsprofilen unter physiologisch relevanten Bedingungen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert grundlegende biochemische Kenntnisse im Umgang mit Enzymen, in der Spektrophotometrie und bei der Zubereitung von Lösungen.
- Setzt den Zugang zu einem Spektrophotometer, das Absorptionsmessungen bei 420 nm ermöglicht, sowie zu einer Zentrifuge zur Klärung des Überstandes voraus.
- Erfordert eine Standardisierung der Extraktpräparation und der Reaktionszeiten, um konsistente Ergebnisse über verschiedene Anwender und Chargen hinweg sicherzustellen.
- Die Anpassung auf andere Enzyme kann eine Optimierung von Substrat und Puffer erfordern, da die Spezifität von ONPG auf die Galactosidase-Aktivität beschränkt ist.
- Die pH-Verschiebung durch Zugabe von Natriumcarbonat ist entscheidend für die Beendigung der Reaktion; eine unvollständige Stopplung kann die Genauigkeit der Absorptionsmessung beeinträchtigen.
