Layered Alginate Konstrukten: Eine Plattform für Co-Kultur von heterogenen Zellpopulationen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, reproduzierbare zweischichtige Alginat-Hydrogel-Scheiben zu erzeugen, um die Beziehungen zwischen verschiedenen Zellpopulationen während der 3D-Co-Kultur zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen mehreren Zellpopulationen in räumlich heterogenen 3D-Kulturen, was zur Beantwortung wichtiger Fragen im Tissue Engineering und der Physiologie von tragenden Geweben beitragen kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine einfache, wirtschaftliche und reproduzierbare Möglichkeit bietet, zellgesäte, mehrschichtige Alginat-Hydrogele zu konstruieren, die strukturell für die mechanische Stimulation förderlich sind.

Poonam Sharma, eine Doktorandin aus meinem Labor, wird dieses Verfahren vorführen. Um die Alginatscheiben zu formen, stapeln Sie zuerst ein Stück dickes Filterpapier auf einer drei mal drei Zoll großen Endplatte, gefolgt von einer Zellmikrosiebmembran. Verwenden Sie einen sterilen Spatel, um die Membran zu glätten und das Papier zu filtern.

Drehen Sie dann den Stapel auf einen Stapel Papiertücher und komprimieren Sie die Materialien, um die überschüssige Kalziumchloridlösung zu entfernen. Platzieren Sie als Nächstes eine Gelbildungsform mit zylindrischen Vertiefungen auf der Mikrosiebmembran und befestigen Sie die Form mit Bindeklammern vorsichtig an der Endplatte links und rechts. Stapeln Sie nun ein Stück dickes Filterpapier auf eine kleine Endplatte, gefolgt von einem Stück Mikrosiebmembran, und drehen Sie den Stapel um, um überschüssiges Calciumchlorid zu entfernen, wie gerade gezeigt.

Wenn beide Formhälften fertig sind, re-suspendieren Sie eins mal 10 bis zur sechsten interessierenden Zellen pro Milliliter sterilem Alginatmedium. Das Gemisch erscheint homogen trüb, wenn die Zellen entsprechend dispergiert sind. Übertragen Sie dann 130 Mikroliter Zellen tropfenweise in einzelne Vertiefungen mit einem Durchmesser von sechs Millimetern und drei Millimetern Höhe in der unteren Hälfte des Formkonstrukts.

Über dem Rand jeder Vertiefung sollte ein leicht konvexer Meniskus sichtbar sein. Wenn alle Zellen ausgesät sind, glätten Sie die obere Hälfte des Formkonstrukts vorsichtig mit einem sterilen Spatel. Drehen Sie dann die Form um, so dass sich die Mikrosiebmembran auf den Vertiefungen befindet, und platzieren Sie die Form auf den Vertiefungen, wobei Sie darauf achten, dass die Vertiefungen, die die Zell- und Alginatmischungen enthalten, vollständig abgedeckt sind.

Wenn die Form an Ort und Stelle ist, heben Sie die geladene Formkonstruktion an, drücken Sie fest auf die Mitte und platzieren Sie Bindeklammern an den verbleibenden beiden Seiten der Konstruktion, um die obere und untere Hälfte der Form zu befestigen. Die Zellalginatlösungen sollten sicher in den Vertiefungen eingebettet sein. Tauchen Sie anschließend das gesamte Formkonstrukt 90 Minuten lang in ein 102 millimolares Calciumchloridbad in einer Zellkulturhaube bei Raumtemperatur.

Übertragen Sie das Konstrukt am Ende der Inkubation auf einen Stapel Papiertücher und entfernen Sie die beiden Bindeklammern, mit denen die obere Endplatte an der Form befestigt ist. Trennen Sie die beiden Hälften des Konstrukts. Die in den Vertiefungen gebildeten Hydrogele sollten keine Blasen aufweisen und die Vertiefungen vollständig füllen.

Entfernen Sie die restlichen zwei Bindemittelklammern und trennen Sie die hydrogelhaltige Form von der restlichen Endplatte. Zeichnen Sie mit einem Spatel vorsichtig den Rand der Vertiefungen mit den Hydrogelen nach, um die Gele vorsichtig zu lösen. Übertragen Sie dann die Hydrogele direkt in ein Bad aus DPBS mit Calciumchlorid und Magnesiumchlorid

Nach ein bis fünf Minuten werden die Hydrogele in einzelne Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte überführt, die genügend Basilikum-Wachstumsmediumlösung enthalten, um die Gele mindestens eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2 vollständig einzutauchen. Verwenden Sie in den letzten 30 Minuten der Inkubation Bindeklammern, um die Form mit Vertiefungen zu befestigen, die die Hälfte der Höhe der Gelbildungsform betragen, an der drei x drei Zoll großen oder drei x 1,5 Zoll großen Aluminium-Endplatte auf der linken und rechten Seite, um eine Schneidform zu erstellen. Erstellen Sie dann den Glühmodus, indem Sie die Form mit Vertiefungen mit einem drei Millimeter größeren Durchmesser als die Gelbildungsform auf drei x drei Zoll große Aluminiumplatten-Endplatten auf der linken und rechten Seite zuschneiden.

Übertragen Sie nun die Hydrogele in die Vertiefungen der Schneidform. Jedes Gel sollte genau in die Vertiefung passen, wobei die Hälfte des Gels über die Form hinausragt. Und schneiden Sie mit einem Skalpell entlang der Oberfläche der Form, um das Hydrogel in zwei Hälften zu schneiden.

Drehen Sie die obere Hälfte des Gels um und geben Sie es in eine offene Form. Das Gelstück sollte genau in die Vertiefung passen, aber jetzt sollten beide Hälften auf der Höhe der Form sein, wobei die geschnittene Innenfläche sichtbar sein sollte. Legen Sie anschließend ein Stück Trockenzellen-Mikrosiebmembran über die Vertiefungen, stellen Sie sicher, dass die Membran mit allen zu glühenden Gelhälften in Kontakt kommt, und decken Sie die Membran mit einem Stück dickem Filterpapier ab.

Wenn die Gele vollständig bedeckt sind, tränken Sie das Filterpapier mit Natriumcitrat, das mit EDTA zugesetzt ist, und inkubieren Sie die Gele bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie nach einer Minute die Zellmikrosiebmembran und das dicke Filterpapier und entfernen Sie die Bindeklammern. Öffnen Sie dann die Form und geben Sie eine Gelhälfte mit der Schnittfläche nach oben in eine vorbereitete Glühform.

Übertragen Sie mit einem Spachtel ein zweites behandeltes Halbgel auf das erste Gel, so dass die Schnittfläche mit der Schnittfläche des ersten Gels in Kontakt kommt. Wenn alle Gele platziert sind, drücken Sie mit einem Spatel vorsichtig auf die Gele, um alle Blasen zu entfernen, und tauchen Sie die Glühform vorsichtig in das Kalziumchloridbad. Nach 30 Minuten die Glühform auf einen Stapel Papiertücher übertragen und die Bindeklammern entfernen.

Trennen Sie dann die Form von der Endplatte und überführen Sie die Gele kurz in ein DPBS-Bad, gefolgt von ihrem Eintauchen in das entsprechende Zellkulturmedium. Fertige Doppelschichtgele zeigen eine vollständige anfängliche Trennung der Zellpopulationen, wie in diesem Bild von 293 FT-Zellen zu sehen ist, die mit grünen oder roten Zell-Tracker-Farbstoffen markiert sind. Die Lebensfähigkeit von humanen mesenchymalen Stammzellen, die nach dem Annealing eingebettet sind, ist in geschichteten Hydrogelen hoch, ähnlich wie bei der Zellviabilität, die in Bulk-Hydrogelen beobachtet wird.

Nach der Isolierung der Spitzenspannung aus jedem Zyklus über eine vierstündige uneingeschränkte zyklische Kompression zeigen zellfreie geschichtete Hydrogele eine Stressreaktion auf die zyklische Kompression, die im Vergleich zu nicht geschichteten zellfreien Hydrogelen signifikant geringer ist, obwohl beide Arten von Hydrogelen nach sieben Tagen in Kultur noch intakt sind. Einmal gemeistert, kann diese Technik, einschließlich der Vorbereitung aller Materialien, in weniger als viereinhalb Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, bewusst und langsam zu arbeiten, um Fehler zu vermeiden und den Überblick über die verschiedenen Proben zu behalten.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie mechanische Stimulation und Immunfärbung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Zellpopulationen in den extrazellulären Matrizen, die sich bilden können, zu beantworten. Diese Technik wird es Forschern auf dem Gebiet der Mechanobiologie und des Tissue Engineering ermöglichen, die Beziehung zwischen verschiedenen Zellpopulationen wie mesenchymalen Stammzellen, Chondrozyten und Nucleus pulposus-Zellen leichter zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit scharfen Gegenständen, biologischen Materialien und insbesondere menschlichen Zellen äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter persönlicher Schutzkleidung getroffen werden sollten.