Layered Alginate Konstrukten: Eine Plattform für Co-Kultur von heterogenen Zellpopulationen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, reproduzierbar zweischichtige Alginate-Hydrogeldisken herzustellen, um die Beziehungen zwischen verschiedenen Zellpopulationen während einer 3D-Kokultur zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen mehreren Zellpopulationen in räumlich heterogenen 3D-Kulturen, was zur Beantwortung zentraler Fragen im Bereich des Gewebeengineerings und der Physiologie belasteter Gewebe beitragen kann. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine einfache, kostengünstige und reproduzierbare Möglichkeit bietet, mehrschichtige Alginate-Hydrogels mit eingeschlossenen Zellen herzustellen, die strukturell für mechanische Stimulation geeignet sind.

Die Demonstration dieses Verfahrens wird Poonam Sharma, eine Doktorandin aus meinem Labor, durchführen. Um die Alginate-Scheiben herzustellen, stapeln Sie zuerst ein Stück dickes Filterpapier auf einer 3 × 3 Zoll großen Endplatte, gefolgt von einer Zell-Mikrosieb-Membran. Glätten Sie die Membran und das Filterpapier mit einem sterilen Spatel.

Danach das Stapel auf einen Haufen Papiertücher stürzen und die Materialien zusammendrücken, um die überschüssige Calciumchloridlösung zu entfernen. Als Nächstes eine Gel-Formungsform mit zylindrischen Vertiefungen auf die Mikrosiebmembran setzen und Büroklammern verwenden, um die Form vorsichtig an den linken und rechten Seiten mit der Endplatte zu befestigen. Nun eine dicke Filterpapierscheibe auf eine kleine Endplatte legen, gefolgt von einer Mikrosiebmembran, und das Stapel umdrehen, um überschüssiges Calciumchlorid wie gerade gezeigt zu entfernen.

Wenn beide Formhälften bereit sind, resuspendieren Sie eine Million Zellen der gewünschten Art pro Milliliter sterilem Alginate-Medium. Die Mischung erscheint homogen trüb, wenn die Zellen gleichmäßig verteilt sind. Anschließend werden 130 Mikroliter der Zellsuspension tropfenweise in einzelne Vertiefungen mit einem Durchmesser von sechs Millimetern und einer Höhe von drei Millimetern in der unteren Hälfte des Formkörpers überführt.

Über dem Rand jedes Wells sollte ein leicht konvexer Meniskus sichtbar sein. Sobald alle Zellen ausgesät wurden, glätten Sie mit einem sterilen Spatel vorsichtig die obere Hälfte des Formlings. Drehen Sie dann die Form um, sodass die Mikrosiebmembran sich über den Wells befindet, und setzen Sie die Form auf die Wells auf, wobei darauf zu achten ist, dass die Wells mit der Zell- und Alginate-Mischung vollständig abgedeckt sind.

Wenn die Form platziert ist, heben Sie die beladene Formkonstruktion an und setzen Sie, während Sie fest in der Mitte andrücken, Klammern an den verbleibenden beiden Seiten der Konstruktion an, um die obere und untere Hälfte der Form zu befestigen. Die Zell-Alginatlösungen sollten sicher in den Vertiefungen liegen. Tauchen Sie anschließend die gesamte Formkonstruktion für 90 Minuten in ein Bad aus 102 Millimolar Calciumchlorid in einer Zellkulturschutzhaube bei Raumtemperatur ein.

Am Ende der Inkubation das Konstrukt auf einen Stapel Papiertücher übertragen und die beiden Büroklammern entfernen, die die obere Endplatte an der Form befestigen. Die beiden Hälften des Konstrukts voneinander trennen. Die in den Vertiefungen gebildeten Hydrogele sollten keine Blasen enthalten und die Vertiefungen vollständig ausfüllen.

Entfernen Sie die verbleibenden beiden Klemmen und trennen Sie die die Hydrogel enthaltende Form von der verbleibenden Endplatte. Verfolgen Sie mit einem Spatel vorsichtig den Rand der Vertiefungen, die die Hydrogels enthalten, um die Gele vorsichtig zu lösen. Überführen Sie die Hydrogels anschließend direkt in ein Bad aus DPBS mit Calciumchlorid und Magnesiumchlorid.

Nach ein bis fünf Minuten überführen Sie die Hydrogels in einzelne Vertiefungen einer sechswelligen Platte, die mit ausreichend Basilikum-Wachstumsmediumlösung gefüllt ist, um die Gele mindestens eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2 vollständig zu benetzen. Verwenden Sie während der letzten 30 Minuten der Inkubation Büroklammern, um die Form mit Vertiefungen, deren Höhe der halben Höhe der Gel-Formungsform entspricht, an den linken und rechten Seiten mit einer drei mal drei Zoll oder drei mal 1,5 Zoll großen Aluminium-Endplatte zu befestigen, um eine Schneidform zu erzeugen. Erstellen Sie anschließend die Glühform, indem Sie die Form mit Vertiefungen, die einen Durchmesser um drei Millimeter größer als die der Gel-Formungsform aufweisen, an den linken und rechten Seiten mit drei mal drei Zoll großen Aluminium-Endplatten verbinden.

Überführen Sie nun die Hydrogels in die Vertiefungen der Schneidform. Jedes Gel sollte passgenau in die Vertiefung passen, wobei die Hälfte des Gels über die Form hinausragen sollte. Schneiden Sie dann mit einem Skalpell entlang der Oberfläche der Form, um das Hydrogel zu halbieren.

Drehen Sie die obere Hälfte des Gels um und legen Sie sie in eine offene Mulde der Form. Das Gelpiece sollte fest in der Mulde sitzen, wobei nun beide Hälften die Höhe der Form erreichen sollten und die geschnittene innere Oberfläche sichtbar ist. Legen Sie danach ein Stück trockene Mikrosiebmembran für Zellen über die Mulden, wobei sichergestellt werden muss, dass die Membran mit allen zu verbindenden Gelhälften in Kontakt steht, und bedecken Sie die Membran mit einem Stück dickem Filterpapier.

Wenn die Gele vollständig bedeckt sind, die Filterpapier mit Natriumcitrat ergänzt durch EDTA durchnässen und die Gele bei Raumtemperatur inkubieren. Nach einer Minute die Zell-Mikrosieb-Membran und das dicke Filterpapier entsorgen und die Schellen entfernen. Anschließend die Form öffnen und eine Gelhälfte in eine vorbereitete Annealing-Form überführen, wobei die Schnittfläche nach oben zeigt.

Übertragen Sie mit einem Spatel eine zweite behandelte halbe Gelplatte auf die erste Gelplatte, sodass die Schnittfläche mit der Schnittfläche der ersten Gelplatte in Kontakt kommt. Wenn alle Gelplatten platziert sind, drücken Sie vorsichtig mit einem Spatel auf die Gelplatten, um eventuelle Blasen zu entfernen, und tauchen Sie die Annealing-Form vorsichtig in das Calciumchlorid-Bad ein. Nach 30 Minuten stellen Sie die Annealing-Form auf einen Stapel Papiertücher und entfernen Sie die Bindeklammern.

Anschließend die Form von der Endplatte trennen und die Gele kurz in ein DPBS-Bad überführen, gefolgt von ihrer Einbringung in das geeignete Zellkulturmedium. Fertige Bilayer-Gele weisen eine vollständige anfängliche Trennung der Zellpopulationen auf, wie in diesem Bild von 293 FT-Zellen, die mit grünen oder roten Zelltracern markiert wurden, zu beobachten ist. Die Vitalität von humanen mesenchymalen Stammzellen, die nach dem Ausheizen in geschichteten Hydrogelen eingebettet wurden, ist hoch und vergleichbar mit der Zellvitalität in massiven Hydrogelen.

Nach der Isolierung der Maximalspannung aus jedem Zyklus über eine vierstündige unbelastete zyklische Kompression zeigen zellfreie geschichtete Hydrogele eine deutlich geringere Spannungsantwort auf die zyklische Kompression im Vergleich zu massiven, nicht geschichteten zellfreien Hydrogelen, obwohl beide Hydrogeltypen nach sieben Tagen in Kultur intakt bleiben. Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie einschließlich der Vorbereitung aller Materialien bei sachgemäßer Durchführung in weniger als viereinhalb Stunden abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sorgfältig und langsam vorzugehen, um Fehler zu vermeiden und die verschiedenen Proben leichter verfolgen zu können.

Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie mechanische Stimulation und Immunfärbung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Zellpopulationen in den möglicherweise gebildeten extrazellulären Matrizen zu beantworten. Diese Technik ermöglicht es Forschern auf den Gebieten der Mechanobiologie und des Gewebeengineerings, die Beziehung zwischen verschiedenen Zellpopulationen – wie mesenchymalen Stammzellen, Chondrozyten und Zellen des Nucleus pulposus – leichter zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit scharfen Gegenständen, biologischem Material und insbesondere menschlichen Zellen äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.