Hochdurchsatz-Identifizierung von Bakterien abstoßenden Polymere für medizinische Geräte

Das übergeordnete Ziel dieser Polymer-Mikroarray-Technik besteht darin, synthetische Polymere zu identifizieren, die in der Lage sind, die Anheftung von Bakterien an abiotische Oberflächen zu beeinflussen. Diese Methode kann dazu beitragen, die Entwicklung einfacher und kostengünstiger Biomaterialien, die die Anheftung von Bakterien an medizinische Geräte verhindern, zu beschleunigen. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zur herkömmlichen Biomaterialforschung, bei der jeweils nur ein Material einzeln getestet wird, liegt in der Möglichkeit, Hunderte von Polymeren gleichzeitig in einem einzigen Experimentsschritt zu untersuchen.

Bereiten Sie zunächst Polymerlösungen vor und geben Sie diese gemäß dem Textprotokoll in die Vertiefungen einer 384-Loch-Platte. Erstellen Sie eine Routine zum Bedrucken von Polymeren in vierfacher Wiederholung, bestehend aus 1536 Spot-Anordnungen in 48 Reihen und 32 Spalten, wobei jeweils 32 Polymerlösungen gleichzeitig aufgedruckt werden, sodass der Drucker nach jedem Abschnitt angehalten werden kann, um eine Reinigung der Pins zu ermöglichen. Bringen Sie nun die mit Agarose beschichteten Objektträger auf die Plattform an und stellen Sie eine gute Vakuumabdichtung sicher, um die Träger in Position zu halten.

Um den Druckkopf so einzustellen, dass alle Nadeln auf gleicher Höhe sind, senken Sie den Kopf manuell auf einen Objektträger ab und vergewissern Sie sich, dass sich die Nadeln gleichzeitig nach oben bewegen. Setzen Sie die Mikrotiterplatte mit Vertiefung A1 oben rechts im Plattenhalter ein und stellen Sie sicher, dass die Mikrotiterplatte fest befestigt ist. Bestätigen Sie, sobald dazu aufgefordert wird, dass der Objektträger und die Mikrotiterplatte korrekt positioniert sind.

Drucken Sie jeweils einen Abschnitt einzeln aus, um die Reinigung der Nadeln zwischen den Abschnitten zu ermöglichen. Reinigen Sie die Nadeln anschließend gründlich mit einem in Aceton getränkten Papiertuch, gefolgt von trockenem Papiertuch, um sicherzustellen, dass die Nadeln vollständig trocken sind.

Wenn die Mikroarrays vollständig bedruckt sind, legen Sie sie in einen Objektträgerhalter und überführen Sie sie in einen Vakuumofen, der auf 40 Grad Celsius eingestellt ist, um sie zum Trocknen zu belüften und das N&P in den Polymerpunkten zu entfernen. Anschließend sterilisieren Sie die Platten 30 Minuten lang mit UV-Licht. Messen Sie vor der Inokulation der Objektträger mit Bakterien gemäß dem Textprotokoll die Hintergrundfluoreszenz.

Nach der Kultivierung und Vorbereitung der Inokula für die Mikroarrays gemäß dem Textprotokoll werden die mit UV-Licht sterilisierten polymeren Mikroarrays in rechteckige Vier-Vertiefungs-Platten gegeben und mit sechs Milliliter gemischten Bakterienkulturen versetzt. Die Platten werden fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius mit sanfter Agitation inkubiert. Nach der Inkubation werden die Mikroarrays zweimal vorsichtig mit PBS gespült.

Dann fügen Sie ein Mikrogramm pro Milliliter DAPI in PBS hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang. Danach überführen Sie die Mikroarrays in eine frische Vier-Well-Platte, bedecken die Mikroarrays mit PBS und schwenken vorsichtig. Wechseln Sie anschließend das PBS einmal und wiederholen Sie die Wäsche.

Nach dem Spülen trocknen Sie die Mikroarrays unter Luftstrom ab, bringen Sie dann Versiegelungsfolie auf und befestigen Sie Deckgläser auf den Mikroarray-Objektträgern. Sobald der Kleber trocken ist, desinfizieren Sie die Außenfläche mit 70 %igem Ethanol. Erfassen Sie mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops, das mit einem 20x-Objektiv ausgestattet ist, jeweils ein Einzelbild für jeden Polymerfleck im Hellfeld und in den strappy-Kanälen.

Um Deckgläser mit Polymeren zu beschichten, stellen Sie Lösungen der HIT-Polymere in Tetrahydrofuran oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel her. Beschichten Sie mit einem Spin-Beschichter kreisförmige Glasdeckgläser geeigneter Größe mit den Polymerlösungen bei 2000 U/min für zehn Sekunden. Trocknen Sie die beschichteten Deckgläser über Nacht in einem Umluftofen bei 40 Grad Celsius.

Und verwenden Sie UV-Licht, um die Deckgläser 30 Minuten lang vor der Inokulation mit Bakterien zu sterilisieren. Legen Sie die mit UV-Licht sterilisierten Deckgläser in eine Standard-12- oder 24-Loch-Platte und inkubieren Sie sie mit Bakterien, wie zuvor in diesem Video gezeigt. Verwenden Sie nach der Inkubation 0,1 molares Cacodylatpuffer, um die beschichteten Deckgläser zweimal zu waschen, und fixieren Sie die Proben anschließend zwei Stunden lang mit 2,5 % (Gewicht pro Volumen) Glutaraldehyd in 0,1 molarem Cacodylatpuffer.

Fixieren Sie die Deckgläser nach der Fixierung mit 1 % Osmiumtetroxid eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Danach dehydrieren Sie sie in einer Ethanol-Serie, wobei jede Konzentration 30 Minuten lang wirkt. Anschließend beschichten Sie die Proben mit einem Sputter-Coater und einer Legierung aus 60 zu 40 % Gold zu Platin bei einem Strom von 30 Milliampere und einem Vakuum von 0,75 Torr.

Nach der Aufnahme von Bildern mit dem REM visuell die Bilder der unbeschichteten Deckgläser und der mit Agarose oder den HIT-Polymeren beschichteten Deckgläser vergleichen, um die Fähigkeit der Polymere zur Bindung oder Abstoßung von Bakterien zu bestätigen. Um verschiedene Lösungsmittel hinsichtlich ihrer Verträglichkeit mit dem Endbereich des Katheters sowie ihrer Fähigkeit, das HIT-Polymer zu lösen, zu bewerten, die Katheterstücke in die Lösungsmittel eintauchen und 12 Stunden lang inkubieren, bevor die Integrität des Katheters und die Klarheit des Lösungsmittels visuell beurteilt werden. Zur Analyse der bakteriellen Anheftung an Kathetern mittels REM eine 10 %ige Polymerslösung in Aceton herstellen.

Drücken Sie eine 200-Mikroliter-Mikropipettenspitze in den mittleren Abschnitt des abgeschnittenen Katheterstücks, um es zu halten, und tauchen Sie das Stück etwa 30 Sekunden lang in die Polymelösung ein. Trocknen Sie das beschichtete Stück unter Umgebungsbedingungen 30 Minuten lang, dann tragen Sie eine zweite Beschichtung auf, indem Sie das Katheterstück erneut in die Polymelösung eintauchen, und trocknen Sie es über Nacht unter Umgebungsbedingungen. Nach der Inkubation beschichteter und unbeschichteter Katheterstücke in inokuliertem LB gemäß dem Textprotokoll waschen Sie die Katheter mit einem Milliliter PBS.

Fixieren Sie die Bakterien anschließend mit 10 % Paraformaldehyd in PBS für 30 Minuten. Nach einem Waschschritt mit PBS färben Sie die Bakterien auf den Katheterstücken 20 Minuten lang mit DAPI. Vor dem Waschen mit einem Milliliter PBS.

Beobachten Sie die Anordnung der Proben in der Kammer. Nehmen Sie mit den folgenden Einstellungen konfokale Bilder der Katheterstücke auf. Schließen Sie die konfokale Bildgebung durch z-Stapelung von 50 Bildern über eine Länge von 100 Mikrometern des Katheters ab.

Nach der UV-Behandlung und Inkubation mit Bakterien verwenden Sie ein Milliliter PBS, um die Stücke zwei Mal zu waschen, und überführen Sie sie in 48-Well-Platten, die 10 % Formaldehyd in PBS enthalten, für 30 Minuten. Nach der Fixierung der Proben führen Sie eine weitere Wäsche mit PBS durch und trocknen sie über Nacht bei Raumtemperatur. Anschließend montieren Sie sie auf Stubs mit leitfähigen Kohlenstoffplättchen und beschichten sie mittels eines Sputter-Coaters mit Gold.

Vor der Bildgebung unter Verwendung eines Rasterelektronenmikroskops. Diese Abbildung zeigt die Anheftung von Bakterien an eine Reihe von Polymeren, wie sie mittels Mikroarray-Analyse bestimmt wurde. Spots, die ohne Polymer aufgebracht wurden, dienen als Negativkontrolle, da Agarose einer bakteriellen Bindung stark entgegenwirkt und somit die Fluoreszenz sehr gering ist.

Die dargestellten Polymere zeigen eine Legierungsbindung, obwohl in den meisten Fällen die abweisenden Eigenschaften eines Polymers zwischen den getesteten Bakterienarten erheblich variieren. Dies spiegelt die großen Unterschiede zwischen den Anheftungsmechanismen verschiedener Arten wider. Die Polymere mit geringer Bindung lassen sich durch Vergleich mit Agarose leicht identifizieren.

Polymere mit hoher Bindungskapazität werden wahrscheinlich in einem Array identifiziert und können als positive Kontrollen für nachfolgende Experimente verwendet werden. Bei Polymeren, die keine Auto-Fluoreszenz im DAPI-Kanal zeigen, kann ein qualitativer Vergleich der Spot-Bilder visuell durchgeführt werden. Hochskalierungsexperimente zur Überprüfung der Beschichtung größerer Oberflächen wurden durchgeführt, um die bakterienabstoßenden Eigenschaften der 22 geeigneten identifizierten Polymere zu bestätigen.

Hier gezeigt sind die am besten abschneidenden Proben, die zum Beschichten von Glasdeckgläsern verwendet wurden, analysiert mittels REM. Diese Abbildungen zeigen Katheterschnitte, analysiert mittels konfokaler Mikroskopie und REM. Beide mikroskopischen Methoden bieten den Vorteil, direkte Zellzählungen an der Oberfläche zu ermöglichen und liefern somit eindeutige Daten, da eine Verringerung der Zelladhäsion leicht sichtbar ist.

Nach diesem Verfahren könnten Serum- oder Blutbestandteile daraufhin untersucht werden, welchen Einfluss sie auf die bakterielle Bindung haben. Ein Tiermodell könnte verwendet werden, um das Potenzial der Polymerbeschichtungen für die klinische Anwendung zu bewerten. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Chemikalien und pathogenen Organismen gefährlich sein kann.

Während der Handhabung und Entsorgung sollten zudem erforderliche Kontrollmaßnahmen getroffen werden, um persönliche und umweltbezogene Risiken zu verringern.