Hochdurchsatz-Identifizierung von Bakterien abstoßenden Polymere für medizinische Geräte

Das übergeordnete Ziel dieser Polymer-Microarray-Technik ist es, synthetische Polymere zu identifizieren, die in der Lage sind, die Anheftung von Bakterien an abiotische Oberflächen zu modulieren. Diese Methode kann dazu beitragen, den Fortschritt bei der Entdeckung einfacher, kostengünstiger Biomaterialien zu beschleunigen, die die Anheftung von Bakterien an medizinische Geräte hemmen. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zur herkömmlichen Biomaterialforschung, bei der jeweils ein Material getestet wird, besteht darin, dass Hunderte von Polymeren gleichzeitig in einem einzigen Asset gescreent werden können.

Bereiten Sie zunächst Polymerlösungen vor und geben Sie sie gemäß dem Textprotokoll in die Vertiefungen einer 384-Well-Platte. Erstellen Sie eine Routine zum Drucken von Polymeren in vierfacher Ausfertigung, bestehend aus 1536 Punkten, die in 48 Reihen und 32 Spalten angeordnet sind, und drucken Sie jeweils 32 Polymerlösungen, so dass der Drucker nach dem Drucken jedes Abschnitts gestoppt werden kann, um die Reinigung der Stifte zu ermöglichen. Legen Sie nun die agarosebeschichteten Objektträger auf die Plattform und sorgen Sie für eine gute Vakuumdichtung, um die Objektträger in Position zu halten.

Um den Druckkopf so einzustellen, dass sich alle Stifte auf der gleichen Höhe befinden, senken Sie den Kopf manuell auf einen Glasschlitten und vergewissern Sie sich, dass sich die Stifte gleichzeitig nach oben bewegen. Platzieren Sie die Well-Platte auf dem Plattenhalter mit der Vertiefung A1 oben rechts am Halter und stellen Sie sicher, dass die Vertiefungsplatte fest sitzt. Vergewissern Sie sich, dass der Objektträger und die Vertiefungsplatte in Position sind, wenn Sie dazu aufgefordert werden.

Drucken Sie jeweils einen Abschnitt, sodass die Stifte zwischen den Abschnitten gereinigt werden können. Verwenden Sie dann ein in Aceton getauchtes Papiertuch, um die Stecknadeln gründlich zu reinigen. Gefolgt von trockenem Seidenpapier, um sicherzustellen, dass die Stecknadeln vollständig trocken sind.

Wenn die Microarrays vollständig gedruckt sind, legen Sie sie in einen Objektträgerhalter und übertragen Sie sie in einen Vakuumofen, der auf 40 Grad Celsius zum Trocknen eingestellt ist, um das N&P in den Polymerflecken zu entfernen. Anschließend werden die Platten mit UV-Licht 30 Minuten lang sterilisiert. Bevor Sie Objektträger mit Bakterien beimpfen, nehmen Sie eine Messung der Hintergrundfluoreszenz gemäß dem Textprotokoll vor.

Nach der Kultivierung und Vorbereitung der Inokula für die Microarrays gemäß dem Textprotokoll werden die UV-sterilisierten Polymer-Microarrays in rechteckige Vier-Well-Platten gelegt und sechs Milliliter gemischte Bakterienkulturen hinzugefügt. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius unter leichtem Rühren fünf Tage lang. Verwenden Sie nach der Inkubation PBS, um die Microarrays zweimal vorsichtig zu spülen.

Fügen Sie dann ein Mikrogramm pro Milliliter DAPI in PBS hinzu und inkubieren Sie es 30 Minuten lang. Übertragen Sie als Nächstes die Microarrays auf eine frische Vier-Well-Platte, bedecken Sie die Microarrays mit PBS und schwenken Sie sie vorsichtig. Wechseln Sie dann das PBS einmal und wiederholen Sie den Waschgang.

Trocknen Sie die Microarrays nach dem Spülen unter einem Luftstrom, tragen Sie dann eine Siegelfolie auf und kleben Sie Glasabdeckfolien auf die Microarray-Objektträger. Wenn der Kleber trocken ist, verwenden Sie 70% Ethanol, um die Außenfläche zu sterilisieren. Mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem 20-fach subjektiven Mikroskop ausgestattet ist, werden Einzelbilder für jeden Polymerfleck in Hellfeld- und Riemchenkanälen aufgenommen.

Um Deckgläser mit Polymeren zu beschichten, bereiten Sie Lösungen von HIT-Polymeren in Tetrahydrofuran oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel vor. Mit einem Spin-Coater werden kreisförmige Glasdeckgläser geeigneter Größe zehn Sekunden lang mit den Polymerlösungen bei 2000 U/min geschleudert. Trocknen Sie die beschichteten Deckgläser über Nacht im Heißluftofen bei 40 Grad Celsius.

Und verwenden Sie UV-Licht, um die Deckgläser 30 Minuten lang zu sterilisieren, bevor Sie sie mit Bakterien impfen. Legen Sie die UV-sterilisierten Deckgläser in eine Standardplatte mit 12 oder 24 Vertiefungen und inkubieren Sie sie mit Bakterien, wie weiter oben in diesem Video gezeigt. Nach der Inkubation werden die beschichteten Deckgläser mit 0,1 molaren Cacodylatpuffern zweimal gewaschen und dann mit 2,5 % Gew.-% Glutaraldehyd und 0,1 molaren Cacodylatpuffer zwei Stunden lang fixiert.

Fixieren Sie die Deckgläser eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit 1%Osmiumtetroxid. Bevor Sie sie in einer Ethanolserie für 30 Minuten bei jeder Konzentration dehydrieren. Anschließend werden die Proben mit einem Sputterbeschichter und einem Gemisch aus einer Gold-Platin-Legierung von 60 bis 40 % mit einem Strom von 30 Milliampere und einem Vakuum von 0,75 Torr beschichtet.

Vergleichen Sie nach der Aufnahme mit dem REM die Bilder der unbeschichteten Deckgläser visuell mit denen, die mit Agarose oder den HIT-Polymeren beschichtet sind, um die bakterielle Bindung oder Abstoßung der Polymere zu bestätigen. Um verschiedene Lösungsmittel auf ihre Kompatibilität mit dem Endwellenteil des Katheters sowie auf ihre Fähigkeit, das HIT-Polymer aufzulösen, zu bewerten, tauchen Sie die Katheterstücke in die Lösungsmittel und inkubieren Sie sie 12 Stunden lang, bevor Sie die Integrität des Katheters und die Klarheit des Lösungsmittels visuell bewerten. Um die bakterielle Anheftung an Kathetern mittels REM zu analysieren, bereiten Sie eine 10%ige Polymerlösung in Aceton vor.

Drücken Sie eine 200-Mikroliter-Mikropipettenspitze in den mittleren Teil des geschnittenen Stücks des Katheters, um es zu halten, und stecken Sie das Stück für ca. 30 Sekunden in die Polymerlösung. Trocknen Sie das beschichtete Stück 30 Minuten lang unter Umgebungsbedingungen, tragen Sie dann eine zweite Beschichtung auf, indem Sie das Katheterstück erneut in die Polymerlösung eintauchen und über Nacht unter Umgebungsbedingungen trocknen. Nach der Inkubation von beschichteten und unbeschichteten Katheterstücken in inokuliertem LB gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie einen Milliliter PBS, um die Katheter zu waschen.

Verwenden Sie dann 10% Paraformaldehyd in PBS, um die Bakterien 30 Minuten lang zu fixieren. Nach einer Reinigung mit PBS verwenden Sie DAPI, um die Bakterien auf den Katheterstücken 20 Minuten lang zu färben. Vor dem Waschen mit einem Milliliter PBS.

Beobachten Sie die Anordnung der Proben in der Kammer. Nehmen Sie mit den folgenden Einstellungen konfokale Bilder der Katheterstücke auf. Vervollständigen Sie die konfokale Bildgebung durch Z-Stacking von 50 Bildern über eine Länge von 100 Mikrometern des Katheters.

Nach der UV-Behandlung und Inkubation mit Bakterien waschen Sie die Stücke mit einem Milliliter PBS zweimal und füllen Sie sie 30 Minuten lang in 48-Well-Platten mit 10 % Formaldehyd in PBS um. Führen Sie nach dem Fixieren der Proben eine weitere Wäsche mit PBS durch und trocknen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur. Montieren Sie dann Stummel mit leitfähigen Kohlenstoffscheiben und verwenden Sie einen Sputter-Coater, um die Goldbeschichtung durchzuführen.

Vor der Bildgebung mit einem Rasterelektronenmikroskop. Diese Abbildung zeigt die bakterielle Bindung an eine Reihe von Polymeren, wie sie durch Microarray-Analyse bestimmt wurde. Spots, die ohne Polymer gedruckt werden, fungieren als Negativkontrolle, da Agarose der bakteriellen Bindung stark widersteht und daher die Fluoreszenz sehr gering ist.

Die gezeigten Polymere sind legierungsbindend, obwohl die abweisenden Eigenschaften eines Polymers in den meisten Fällen zwischen den getesteten Bakterienarten erheblich variieren. Dies spiegelt die großen Unterschiede zwischen den Bindungsmechanismen zwischen den verschiedenen Arten wider. Die niedrig bindenden Polymere sind im Vergleich zu Agarose leicht zu identifizieren.

Hochbindende Polymere werden wahrscheinlich in einem Array identifiziert und können als Positivkontrollen für nachfolgende Experimente verwendet werden. Für Polymere, die keine Autofluoreszenz im DAPI-Kanal zeigen, kann ein qualitativer Vergleich der Spotbilder visuell durchgeführt werden. Es wurden Scale-up-Experimente durchgeführt, um die Beschichtung größerer Flächen zu testen, um die bakterienabweisenden Eigenschaften von 22 geeigneten Polymeren zu bestätigen.

Hier sind die leistungsstärksten Proben zu sehen, die zur Beschichtung von Glasdeckgläsern verwendet werden, die mittels REM analysiert wurden. Diese Abbildungen zeigen Katheterschnitte, die mittels konfokaler Mikroskopie und REM analysiert wurden. Beide mikroskopischen Methoden haben den Vorteil, dass sie direkte Zellzählungen auf der Oberfläche ermöglichen und eindeutige Daten liefern, da eine Verringerung der Zelladhäsion leicht sichtbar ist.

Im Anschluss an dieses Verfahren könnten Serum- oder Blutbestandteile getestet werden, um ihren Einfluss auf die bakterielle Bindung zu bestimmen. Ein Tiermodell könnte verwendet werden, um das Potenzial der Polymerbeschichtungen für den klinischen Einsatz zu bewerten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Chemikalien und pathogenen Organismen gefährlich sein kann.

Und während der Handhabung und Entsorgung sollten die notwendigen Kontrollen vorhanden sein, um persönliche und Umweltrisiken zu mindern.