Die anionische Polymerisation eines amphiphilen Copolymer zur Herstellung von Blockcopolymermicellen Stabilisiert durch π-π-Stapelwechselwirkungen

Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist es, die kritischen Schritte zu demonstrieren, die für die Synthese von Blockcopolymermaterialien durch ringöffnende anionische Polymerisation erforderlich sind, und den notwendigen Ablauf von Studien für die Formulierung von Blockcopolymer-Mizellen eines hydrophoben Arzneimittels aufzuzeigen. Dieses Protokoll demonstriert die ordnungsgemäße Ausführung der notwendigen Schritte und Verfahren für die Synthese von Blockcopolymeren durch anionische Polymerisation. Der große Vorteil der Ringöffnung bei einer anionischen Polymerisation ist die Synthese von Materialien mit guter Ausbeute und geringer Schadstoffdispersität.

Sowie die Skalierbarkeit des Prozesses. Dies ist eine aufregende Zeit für die Verabreichung von Polymerarzneimitteln. Mit einer Reihe von Medikamenten, die auf Formulierungs- und Blockcopolymer-Mizellen beruhen und sich derzeit in der späten Phase der präklinischen oder klinischen Entwicklung befinden.

Bereiten Sie die Reagenzien und die Materialien für den Transfer vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Methoxypolyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 5.000 wiegen. Geben Sie das mPEG in einen getrockneten Kolben, der einen Rührstab enthält, und verschließen Sie den Spüladapter mit einem Septum an der Oberseite.

Verbinden Sie den Kolben mit dem Verteiler und setzen Sie den Kolben zwei bis drei Minuten lang mit Argon auf. Drehen Sie das Ventil in die Vakuumposition, um den Kolben aufzusetzen. Der Kolben wird manuell gedreht und das Reaktionsgefäß mit einem Föhn oder einer Heißluftpistole gleichmäßig getrocknet, bis das mPEG schmilzt.

Nach einer Minute wird das Vakuum unterbrochen, indem das Ventil am Verteiler mit mehreren schnellen Schnappbewegungen in die Argonstellung gedreht wird, um den Kolben abzukühlen. Halten Sie den polymeren Makroinitiator etwa zwei Stunden lang unter Vakuum und dann unter Argon, bevor die Reaktion beginnt. Anschließend werden zwei Hochvakuum-Destillationsapparate, die zuvor in einem Ofen getrocknet wurden, unter der Haube montiert.

Eine Vorrichtung ist für die Destillation von DMSO und eine Vorrichtung für die Destillation des Monomers Phenylglycerinether bestimmt. Die getrennten Kolben werden an die beiden Geräte angeschlossen und jeweils auf einem halbkugelförmigen Heizmantel oder in einem Ölbad installiert. Schließen Sie kaltes Wasser an die Oberseite jedes Geräts und an den Verteiler an.

Stellen Sie sicher, dass jedes Gerät sicher und gut abgedichtet ist. Aktivieren Sie das Vakuum über das Ventil. Stellen Sie die Heizung über einen Temperaturregler ein und beginnen Sie mit dem Rühren der Lösungen.

Nach zweistündiger Zirkulationsdestillation von DMSO schließen Sie das Hochvakuumventil, um etwa 20 Milliliter Lösung aufzufangen. Anschließend wird die Fraktion in den Kolben gegeben und der Vorgang noch einmal wiederholt, um die Reinheit der gewünschten Fraktion zu gewährleisten, die später aufgefangen wird. Der Kolben mit dem mPEG wird unter Vakuum mit der Heißluftpistole erhitzt, bis das Polymer schmilzt, und dann wieder mit Argon aufgesetzt.

Schließen Sie nach zwei Stunden das Hochvakuumventil und sammeln Sie das Lösungsmittelvolumen. Stoppen Sie die Heizung und unterbrechen Sie das Vakuum vom Verteiler. Geben Sie Argon in die Kammer ab, wie zuvor beschrieben.

Unter einem Überdruck von Argon wird eine Seite der Kanüle mit einem Messzylinder oder direkt mit dem Kolben mit dem mPEG, ebenfalls unter Argon, verbunden und das andere Ende vorsichtig in die frisch destillierte Fraktion getaucht. Schließen Sie einen zusätzlichen Bubbler an den Kolben an, schließen Sie den Argonstrom und verwenden Sie nur den Argondruck aus dem Destillationsgerät. Um Unfälle durch Argondruck zu vermeiden, öffnen Sie den Glashahn für ein bis zwei Sekunden und schließen Sie ihn wieder, um den DMSO-Fluss fortzusetzen, bis die vollständige Übertragung abgeschlossen ist.

Als nächstes verbinden Sie unter Argon eine Seite der Kanüle aus dem getrockneten Messzylinder, die durch ein Septum verschlossen ist, mit einer Stammlösung von 0,3 molaren Naphthalinkalium. Geben Sie dann einen zusätzlichen Bubbler in den Messzylinder, schließen Sie den Argonfluss zum Zylinder und übertragen Sie unter positivem Argondruck fünf Milliliter 0,3 molare Naphthalinkalium durch Kanulation aus der Stammlösung in den Messzylinder. Führen Sie eine weitere Nadel aus dem Verteiler in den Zylinder ein und entfernen Sie den zusätzlichen Bubbler.

Entfernen Sie die mit der Stammlösung verbundene Kanüle vorsichtig, setzen Sie sie rasch in den Reaktionskolben ein und schließen Sie einen zusätzlichen Sprudler an. Als nächstes fügen Sie, wie zuvor beschrieben, die Basis Tropfen für Tropfen hinzu, bis die Lösung dunkel wird. Fügen Sie nach dem langsamen Verschwinden der Farbe eine weitere Portion hinzu, bis die dunkle Farbe wieder erscheint, und wiederholen Sie den Vorgang bis zur vollständigen Übertragung.

Wie zuvor beschrieben, überträgt man das gewünschte Volumen des Monomers auf die Reaktion, um einen Polymerisationsgrad von Polyphenolglykolether von etwa 18 bis 20 Einheiten zu erreichen. Lassen Sie die Reaktion 48 Stunden lang bei 80 Grad Celsius unter Argonatmosphäre unter ständigem Rühren, um eine vollständige Polymerisation zu gewährleisten. Die Reaktion wird durch Zugabe von Tropfen einer normalen Salzsäure und Methanol gestillt, was durch ein Verschwinden der Farbe beobachtet wird.

Extrahieren Sie das Naphthalin aus der DMSO-Lösung mit Hexan. Etwa 70 Milliliter des DMSO werden durch Destillation unter Vakuum entfernt. Kühlen Sie die Güllelösung ab und fügen Sie 15 Milliliter THF hinzu.

Entfernen Sie das Salz aus der Güllelösung, indem Sie zehn Minuten lang bei 5.000 g zentrifugieren. Den Überstand überträuben und einen Tropfen auf 500 Milliliter kalten Diethylether geben. Sammeln Sie den Niederschlag durch Filtration oder Zentrifugation.

Nachdem Sie die Fällung zweimal wiederholt haben, trocknen Sie den Niederschlag bei Raumtemperatur unter der Haube, über Nacht und dann unter Vakuum bei 30 Grad Celsius für 24 bis 48 Stunden, für eine Ausbeute von 85 %Das Copolymer ist nun bereit für die Charakterisierung, wie im Textprotokoll beschrieben. Lösen Sie 12 Milligramm Doxorubicin in einem Milliliter Acetonitril. Fügen Sie 10 Mikroliter Triethylamin hinzu und lassen Sie die Lösung zwei Stunden lang im Dunkeln rühren.

45 Milligramm Copolymer in einem Milliliter THF auflösen und für die gleiche Zeit umrühren. Geben Sie die Copolymerlösung in die Doxorubicin-Lösung und spülen Sie das Vile, das das restliche Copolymer enthält, mit einem zusätzlichen Volumen THF ab. Als nächstes geben Sie das Copolymer-Wirkstoff-Gemisch tropfenweise unter Rühren in ein 20-Milliliter-Vile mit 15 Millilitern 0,9%iger Kochsalzlösung.

Füllen Sie die Lösung in einen Dialysebeutel und dialysieren Sie gegen 500 Milliliter 0,9%ige Kochsalzlösung. Das Dialysat in ein 15-Milliliter-Röhrchen umfüllen und 15 Minuten lang bei 5.000 g zentrifugieren. Übertragen Sie dann den Überstand in ein Ultrafiltrationssystem, das eine Dialysemembran enthält.

Setzen Sie den Rühradapter in das Ultrafiltrationssystem ein, schließen Sie den Deckel und öffnen Sie ihn für einen Stickstoffstrom. Konzentrieren Sie die Blockcopolymer-Mizellenlösung auf ein Volumen von vier Millilitern und fügen Sie sechs Milliliter frische Kochsalzlösung hinzu. Konzentrieren Sie dann die Blockcopolymer-Mizellen-Lösung erneut auf 4 Milliliter, spülen Sie die Kammer mit 0,5 Millilitern Kochsalzlösung und geben Sie sie zur Lösung.

Lagern Sie die resultierende Lösung vor der weiteren Verwendung in braunen Schalen bei Raumtemperatur im Dunkeln. Die ringöffnende anionische Polymerisation von Phenylglycerinether auf dem mPEG-Makroinitiator wurde verwendet, um das amphiphile Diblock-Copolymer durch die tiefe Protonierung der Hydroxylgruppe von mPEG herzustellen. Verwendung von Naphthalinkalium als radikalisches Anion, gefolgt von der Polymerisation des Phenylglycerinethermonomers.

Die Charakterisierung des Blockcopolymers durch Gelpermeationschromatographie und Protonen-NMR-Spektroskopie bestätigte eine enge Molekulargewichtsverteilung mit einem Polymerisationsgrad von Phenylglycerinether von 15 Einheiten. In Acquis-Medien lagern sich die amphiphilen Blockcopolymere zu Mizellen zusammen, die aus einem hydrophoben Kern bestehen, der von einer hydrophilen Hülle umgeben ist. Die Transmissionselektronenmikroskopie bestätigte eine sphärische Morphologie und die dynamische Lichtstreuung zeigte einen hydrodynamischen Durchmesser von 25 Nanometern an.

Doxorubicin wurde erfolgreich in den Blockcopolymer-Mizellen verkapselt. Im Vergleich zum freien protonierten Wirkstoff in Lösung bestätigte die Selbstabschreckung des Doxorubicins, die mittels Fluoreszenzspektroskopie beobachtet wurde, den Einbau des Wirkstoffs in die polymeren Mizellen mit einer Wirkstoffbeladungskapazität von bis zu 14 %Das Freisetzungsprofil von Doxorubicin aus den Blockcopolymer-Mizellen zeigte eine gute Stabilität für diese Formulierung bei neutralem pH-Wert. Und eine anhaltende Freisetzung des Medikaments über vier Tage unter physiologisch relevanten Bedingungen.

Sobald diese Technik beherrscht wird, kann sie Auszubildenden in pharmazeutischen Wissenschaften helfen, die Synthese-Diblock-Copolymere für die Anwendung in der Arzneimittelverabreichung vorzubereiten. Dieses hierin beschriebene Verfahren kann für die Synthese einer breiten Palette von Copolymeren mit PEG als Initiator angewendet werden. Hier wurde Wert auf die Gewährleistung guter Laborpraktiken gelegt, die wasserfreie Bedingungen bieten und zu qualitativ hochwertigen Materialien führen.

Nachdem ich dieses Video gesehen habe, sollte ich ein gutes Verständnis dafür haben, wie man unter wasserfreien Bedingungen arbeitet, und ich sollte in der Lage sein, diese Schritte für die Synthese von PEG-Polyester oder PEG-Polyestermaterialien anzuwenden. Bei der Durchführung der beschriebenen Forschung ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Sie unter kontrollierten Bedingungen, mit potenziell gefährlichen organischen Lösungsmitteln und anderen Mitteln arbeiten. Darüber hinaus sind alle Medikamente giftig und müssen mit den notwendigen Vorsichtsmaßnahmen gehandhabt werden.

Zum Beispiel das Tragen von Handschuhen, einem Laborkittel, engen Schuhen sowie das Tragen einer Maske, wenn Sie die Medikamente wiegen möchten.