Name: Arbeiten mit Auditory HEI-OC1-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Lernen Sie die Handhabung von HEI-OC1-Zellen zur Untersuchung pharmakologischer Wirkungen auf auditorische Zellen und zur Charakterisierung des Motorproteins Prestin. Diese standardisierte Methode ermöglicht vergleichbare Studien.

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Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R01-DC010146 und R01-DC010397 unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar.

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<li>Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cochlear+cell+line+as+an+in+vitro+system+for+drug+ototoxicity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Audiol.+Neurootol%22%5BJournal%5D)">A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening.</a> Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).</li>
<li>Devarajan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin-induced+apoptosis+in+auditory+cells%3A+role+of+death+receptor+and+mitochondrial+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways.</a> Hear Res. 174, 45-54 (2002).</li>
<li>Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+apoptotic+pathways+in+the+absence+of+cell+death+in+an+inner-ear+immortomouse+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line.</a> Hear Res. 284, 33-41 (2012).</li>
<li>Hayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagy+pathway+maintained+signaling+crosstalk+with+the+Keap1-Nrf2+system+through+p62+in+auditory+cells+under+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress.</a> Cell Signal. 27, 382-393 (2015).</li>
<li>Tsuchihashi, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+through+4EBP1+and+AMPK+regulates+oxidative+stress-induced+premature+senescence+in+auditory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells.</a> Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).</li>
<li>Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+autophagy+in+cisplatin-induced+ototoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pediatr+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity.</a> Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).</li>
<li>Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+drug+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity.</a> Hear Res. 335, 105-117 (2016).</li>
<li>Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+prestin+function%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function.</a> Hear Res. 335, 9-17 (2016).</li>
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<li>Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+conditionally+immortalized+organ+of+corti+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines.</a> Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).</li>
<li>Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+two+immortalized+cell+lines+derived+from+the+stria+vascularis+of+a+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%2221st+Midwinter+Meeting+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse.</a> 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).</li>
<li>Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strial+marginal+cells+play+a+role+in+basement+membrane+homeostasis%3A+in+vitro+and+in+vivo+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence.</a> Hear Res. 163, 27-36 (2002).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).</li>
<li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+inhibition+of+voltage-dependent+outer+hair+cell+motility+and+capacitance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance.</a> J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).</li>
<li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+pyroptosis%2C+and+necrosis%3A+mechanistic+description+of+dead+and+dying+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells.</a> Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).</li>
<li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+oncosis%2C+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).</li>
<li>Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+necrosis%3A+the+expanding+network+of+non-apoptotic+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).</li>
<li>Sun, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+kind+of+cell+suicide%3A+mechanisms+and+functions+of+programmed+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis.</a> Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).</li>
<li>Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+necrosis+in+the+cross+talk+of+cell+death+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation.</a> Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).</li>
<li>Vercammen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+signaling+of+the+Fas+receptor%3A+initiation+of+both+apoptotic+and+necrotic+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways.</a> J Exp Med. 188, 919-930 (1998).</li>
<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cellular+senescence%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Aging, cellular senescence, and cancer.</a> Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).</li>
<li>Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+expressing+Tet-inducible+cell+line+recapitulates+in+situ+developmental+changes+in+prestin%27s+Boltzmann+characteristics+and+reveals+early+maturational+events%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li>
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<li>Tsunoo, M., Perlman, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+Oxygen+Tension%3A+Relation+to+Blood+Flow+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function.</a> Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass kein bestehender oder potenzieller Interessenkonflikt besteht.

In diesem Bericht beschreiben wir, wie sie zur Kultur HEI-OC1-Zellen und verwenden Mechanismen der medikamenteninduzierten Zytotoxizität zu bewerten und funktionellen Eigenschaften von Prestin, der molekulare Motor der Cochlea-OHC zu untersuchen. Die technischen Verfahren sind jedoch allgemein genug, um leicht an verschiedene Studien anzupassen. Alle Protokolle hier beschrieben sind, erfordern die korrekte Verwendung von gut etablierten Zellkulturtechniken 10. Genau wie bei jedem ...

House Ear Institute-Corti - Organ 1 (HEI-OC1) Zellen werden aus dem Hörorgan einer transgenen Maus 1,2 abgeleitet. Inkubation einer beliebigen Zelle aus dieser transgenen Maus , bei 33 ° C / 10% CO 2 (permissive Bedingungen) induziert die Expression eines Gens , das Immortalisieren Entdifferenzierung und beschleunigter Proliferation auslöst; Bewegen der Zellen auf 39 ° C / 5% CO 2 (nicht-permissive Bedingungen) führen zu einer verminderten Proliferation, Differenzierung und zumindest im Fall von HEI-OC1, Zelltod 2,3. HEI-OC1-Zellen wurden in unserem Labor vor über einem Jahrzehnt kloniert und charakterisiert, und die anfängliche Studien gezeigt, dass sie spezifische Marker der Cochlea-Haarzellen, wie prestin, Myosin 7a, Atoh1, BDNF, Calbindin und Calmodulin exprimieren, sondern auch Marker der Stütz Zellen wie Connexin 26 und Fibroblasten - Wachstumsfaktor - Rezeptor (FGF-R) 2. Daher wurde vorgeschlagen, dass HEI-OC1 eine commo darstellen könnten Vorläufer für sensorische und Stützzellen des Corti - Organ 2. Parallel Studien lieferten starke Hinweise darauf , dass ototoxic Medikamente wie Cisplatin, Gentamicin und Streptomycin induzierte Caspase-3 - Aktivierung in diesen Zellen archetypischen, während Medikamente als nicht-ototoxische, wie Penicillin, nicht 2,3. Daher wurde diese Zelllinie als ein in vitro - System vorgeschlagen , um die zellulären und molekularen Mechanismen in Ototoxizität beteiligt zu untersuchen , und für das Screening des potentiellen Ototoxizität oder otoprotektiven Eigenschaften neuer pharmakologischer Wirkstoffe. Es wird geschätzt, dass HEI-OC1-Zellen wurden in mehr als einhundertfünfzig Untersuchungen in den letzten zehn Jahren veröffentlicht verwendet. Während der Suche das Hauptziel der meisten Studien war auf dem Potential pro-apoptotische Wirkung verschiedener Medikamente beteiligt diese Zelllinie, andere wichtige Zellprozesse wie Autophagie und Seneszenz haben gerade erst begonnen 4-7 in HEI-OC1 - Zellen untersucht werden. ichna aktuelle Studie aus unserem Labor 8 verwendeten wir HEI-OC1 - Zellen einen umfassenden Satz von Daten über den Zelltod, Überleben, Proliferation, Seneszenz und durch unterschiedliche pharmakologische Wirkstoffe in der Klinik verwendet häufig induzierten Autophagie zu sammeln. Wir verglichen auch einige der Antworten von HEI-OC1-Zellen mit denen aus HEK-293 (menschliche embryonale Nierenzellen) und HeLa (humane Epithelzellen) Empfangen identische Behandlung. Unsere Ergebnisse zeigten, dass HEI-OC1 Zellen an die jedes Medikament in einer charakteristischen Art und Weise, mit einem unverwechselbaren dosis- und zeitabhängige Empfindlichkeit auf mindestens einer der Mechanismen zu untersuch reagieren. Wir betonten auch in dieser Studie , dass eine korrekte Interpretation der experimentellen Ergebnisse erfordern parallel Studien mit mehr als eine Technik 8 durchgeführt wird . In einer anderen Studie untersuchten wir die Verwendung von HEI-OC1 - Zellen die funktionelle Reaktion von Prestin, das Motorprotein von Cochlea äußeren Haarzellen (OHC) 9 zu bewerten </sup&gt;. Wir berichteten Durchflusszytometrie und der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie Studien über die Muster von Prestin Ausdruck, sowie nichtlineare Kapazität (NLC) und Ganzzell-Patch-Clamp-Untersuchungen in HEI-OC1-Zellen, die in permissiven (P-HEI-OC1) und nicht permissive (NP-HEI-OC1) Bedingungen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass sowohl die Gesamt prestin Expression und Plasmamembran-Lokalisations Anstieg in einer zeitabhängigen Weise in NP-HEI-OC1-Zellen. Interessanterweise fanden wir auch , dass der Anstieg in prestin Lokalisierung in der Plasmamembran von NP-HEI-OC1 - Zellen mit einer Abnahme korreliert in Na + K + ATPase, welche von der Plasmamembran zum Zytoplasma ohne wesentliche Änderungen in Gesamtzellexpressions transloziert. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass P-HEI-OC1-Zellen haben eine robuste NLC Motorfunktion prestin verbunden, die abnimmt, wenn die Dichte der prestin Moleküle, die an der Plasmamembran erhöht. Insgesamt stark diese Ergebnisse die Nützlichkeit von HEI-OC unterstützen1-Zellen auditorischen Proteine ​​zu untersuchen. In diesem Video-Artikel beschreiben wir, wie HEI-OC1-Zellen zu Kultur, warum es bequem ist, Zellen zu verwenden, die an der permissiven Bedingungen (P-HEI-OC1) für Zytotoxizitätsuntersuchungen, wie der Mechanismus / s von arzneimittelinduzierten Zytotoxizität zu bewerten und wie elektro~~POS=TRUNC Untersuchungen (zB Patch-clamp, nicht-lineare Kapazität (NLC)) durchzuführen funktionellen Eigenschaften von prestin, der molekularen Motor Cochlea OHCs zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>HEI-OC1-Zellen</td><td></td><td></td><td>ALLE ASSAY-KITS, AUSRÜSTUNGEN&nbsp;</td></tr><tr><td>Klasse II Biologische Sicherheitswerkbank</td><td>Die Baker Company</td><td>Sterilgard III</td><td>UND DIE IN DER</td></tr><tr><td>Kühlzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>VORHERIGEN 2 SÄULEN ANGEGEBENEN UNTERNEHMEN SIND NUR</td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25</td><td>BEISPIELE, UND JEDES ANDERE ÄHNLICHE</td></tr><tr><td>WASSERBAD</td><td>Stovall</td><td>HWB115</td><td>PRODUKT KÖNNTE VERWENDET WERDEN.</td></tr><tr><td>Zellzähler</td><td>Nexcelom</td><td>Cellometer Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Zwei (2) Zellinkubatoren, einer bei 33 > C/10% CO2 und andere bei 39 &deg; C/5% CO2</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschalen, PS, 100 mm x 20 mm mit Belüftungsöffnungen</td><td>Greinier Bio-One</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschalen, PS, 60 mm x 15 mm mit Belüftungsöffnungen&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar Gewebekulturflaschen&nbsp; 250 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658-175</td> Cellstar Gewebekultur&nbsp&nbsp&�&r Greiner Bio-One 660-175<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>&<td>nbsp</td></tr><tr><td>; 6 Well Zellkulturplatte, mit Deckel-Cellstar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>Microtest Gewebekulturplatte, 96 Well, flacher Boden mit Deckel</td><td>Becton Dickinson</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96 Well weiß, klarer Boden</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Polypropylen konisches Röhrchen mit Kappe Cellstars</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konische Gefäße aus Polypropylen mit Verschluss-Cellstars</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 (1x)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH10073.1</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, kein Phenolrot</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, 0,25%&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>TACS MTT Zellproliferations-Assay-Kit</td><td>Trevigen</td><td>4890-25-K</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 Assay&nbsp; Kit</td><td>Promega</td><td>&nbsp; G8091&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BrdU-Zellproliferations-Assay-Kit&nbsp;</td><td>Zell-Signalweg</td><td>6813</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-enzymatische Zelldissoziationslösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tox Green Zytotoxizitäts-Assay-Kit</td><td>Promega</td><td>&nbsp; Nr. G8741&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaIII Instrument&nbsp;</td><td>BD Biowissenschaften</td><td>&nbsp; FACSAriaIII</td><td>mit 488 nm Anregung (blauer Laser)</td></tr><tr><td>Digital Blot Scanner</td><td>LI-COR</td><td>C-DiGit</td><td></td></tr><tr><td>Elektrophorese und Blotting Unit</td><td>Hoefer</td><td>SE300 miniVE</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Max 5 Plate Reader mit Soft Max Pro 5.2 Software</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 5</td><td></td></tr><tr><td>Patch-Clamp Verstärker</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Puller zur Vorbereitung Patch-Elektroden</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr></tbody></table>

arbeiten mit auditory hei-oc1-zellen

Working with Auditory HEI-OC1 Cells

HEI-OC1 ist eine der wenigen Maus-Hörzelllinien, die für Forschungszwecke zur Verfügung stehen. Ursprünglich als In-vitro-System für das Screening ototoxischer Arzneimittel vorgeschlagen, wurden diese Zellen verwendet, um arzneimittelaktivierte apoptotische Signalwege, Autophagie, Seneszenz, den Mechanismus des Zellschutzes, Entzündungsreaktionen, Zelldifferenzierung, genetische und epigenetische Wirkungen pharmakologischer Arzneimittel, Wirkungen von Hypoxie, oxidativen und endoplasmatischen Retikulumstress und die Expression molekularer Kanäle und Rezeptoren zu untersuchen. Neben anderen wichtigen Markern der Cochlea-Haarzellen exprimieren HEI-OC1-Zellen endogen Prestin, das paradigmatische Motorprotein der äußeren Haarzellen. Daher können sie sehr nützlich sein, um neue funktionelle Aspekte dieses wichtigen auditorischen Proteins aufzuklären. HEI-OC1-Zellen sind sehr robust, und ihre Kultur weist in der Regel keine großen Komplikationen auf. Sie erfordern jedoch einige besondere Bedingungen, wie z. B. die Vermeidung der Verwendung gängiger antibakterieller Cocktails, die Streptomycin oder andere Antibiotika enthalten, sowie die Inkubation bei 33 °C, um die Zellproliferation zu stimulieren, und die Inkubation bei 39 °C, um die Zelldifferenzierung auszulösen. Hier beschreiben wir, wie HEI-OC1-Zellen kultiviert und in einigen typischen Assays verwendet werden, wie z. B. Zellproliferation, Lebensfähigkeit, Tod, Autophagie und Seneszenz, sowie wie Patch-Clamp- und nichtlineare Kapazitätsmessungen durchgeführt werden.

In ein paar jüngsten Veröffentlichungen berichteten wir eine umfassende Reihe von Studien zur Bewertung der Reaktion von dem Ziel HEI-OC1 - Zellen auf mehrere häufig verwendete pharmakologische Wirkstoffe sowie die Untersuchung prestin Funktion 8,9. In diesen Studien haben wir die Verwendung aller Protokolle in den vorhergehenden Abschnitten beschrieben. Eines der Ergebnisse dieser früheren Studien war , dass HEI-OC...

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) ist eine der wenigen Maus-Hörzelllinien, die derzeit für Forschungszwecke verfügbar sind. Dieses Protokoll beschreibt, wie mit HEI-OC1-Zellen gearbeitet werden kann, um die zytotoxischen Wirkungen von pharmakologischen Arzneimitteln sowie die funktionellen Eigenschaften von Innenohrproteinen zu untersuchen.

Arbeiten mit Auditory HEI-OC1-Zellen

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die grundlegenden Verfahren für die Arbeit mit HEI-OC1-Zellen zu beschreiben, die zur Untersuchung der Wirkungen pharmakologischer Substanzen auf auditorische Zellen sowie zur Unterstützung der funktionellen Charakterisierung des Motorproteins Prestin verwendet werden können. HEI-OC1-Zellen werden von zahlreichen Forschern weltweit in unterschiedlichen Experimenten mit verschiedenen Zielsetzungen und unter Anwendung verschiedener Techniken eingesetzt. Die hier beschriebenen Verfahren sollen hoffentlich eine gemeinsame Grundlage schaffen, um diese Studien miteinander vergleichbar zu machen.Selbstverständlich können diese experimentellen Verfahren weiter verbessert werden. Doch die Unterschiede zu den hier beschriebenen könnten entscheidend sein, um möglicherweise widersprüchliche Ergebnisse zu verstehen und zu erklären. In dieser Demonstration beschreiben wir, wie man mit HEI-OC1-Zellen arbeitet, beginnend mit einer gefrorenen Aliquotprobe, bis die Proben für verschiedene Studien mit weit verbreiteten Methoden bereitstehen.Um dieses Verfahren zu beginnen, entnehmen Sie ein Gefäß mit kryokonservierten HEI-OC1-Zellen aus flüssigem Stickstoff und geben es in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Tauchen Sie nur die untere Hälfte des Gefäßes ein und lassen Sie es auftauen, bis nur noch eine geringe Menge Eis im Gefäß verbleibt. Wischen Sie im biologischen Sicherheitswerkbank die Außenseite des Gefäßes mit 70 %igem Alkohol ab.Danach pipettieren Sie die Zellen aus dem Vial und geben die gesamte Menge tropfenweise langsam in ein 15-Milliliter-Konischgefäß, das 10 Milliliter vorgewärmtes Wachstumsmedium wie DMEM ergänzt durch 10 % FBS enthält. Entfernen Sie anschließend das DMSO durch Zentrifugation des Gefäßes für fünf Minuten. Nach fünf Minuten verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen in neun Millilitern frischem Wachstumsmedium.Lösen Sie die Zellklumpen oder -schichten auf, indem Sie die suspendierten Zellen drei- bis viermal zwischen der Pipette und dem Medium hin und her pipettieren, wobei die Pipettenspitze den Boden des Reaktionsgefäßes berührt. Anschließend geben Sie das gesamte Volumen der in Wachstumsmedium suspendierten Zellen in eine unbehandelte, 100 Millimeter durchmessende Kunststoffkulturschale. Inkubieren Sie die Zellen bei 33 Grad Celsius mit 10 % CO₂.In diesem Schritt entfernen Sie das alte Medium und waschen die Zellen mit zwei Millilitern PBS. Anschließend bedecken Sie die Zellmonolayer mit 0,25 % Trypsin. Untersuchen Sie die Zellen unter einem invertierten Mikroskop, sobald 40 % von ihnen abgelöst wurden.Falls erforderlich, die Kulturschale vorsichtig schwenken, um eventuell noch anhaftende Zellen freizugeben. Die Zellen resuspendieren und die Trypsin-Lösung durch Zentrifugation des Reaktionsgefäßes für fünf Minuten abtrennen. Danach das Überstand entfernen und die Zellen in neun Milliliter frischem Wachstumsmedium resuspendieren. Anschließend Zellklumpen oder Zellverbände durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren der Zellsuspension zwischen Pipette und Medium drei bis viermal lösen, wobei die Pipettenspitze den Boden des Reaktionsgefäßes berühren sollte.Die Zellen in Zellkulturschalen mit einem Durchmesser von 100 Millimetern ansäen. Inkubieren Sie sie bei 33 Grad Celsius mit 10 % CO2 und teilen Sie sie so oft wie für die geplanten Experimente erforderlich oder zur Erzeugung einer neuen Zelllinie notwendig. Für die Differenzierung werden die HEI-OC1-Zellen unter permissiven Bedingungen inkubiert, bis sie eine Konfluenz von etwa 80 % erreichen.Anschießend inkubieren Sie die Zellen bei 39 Grad Celsius mit 5 % CO2 für zwei bis drei Wochen und wechseln alle zwei Tage das Medium, um tote Zellen zu entfernen. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Zellen entweder mit einem automatischen Zellzähler oder einem Hämozytometer zählen und die Zellkonzentration auf den erforderlichen Wert einstellen. Anschließend säen Sie die Zellen in eine 96-Loch-Klar-Kulturplatte mit flachem Boden, eine 96-Loch-Platte mit weißen Wänden oder eine 6-Loch-Platte aus.Falls dies der spezielle Test erfordert, inkubieren Sie die Zellen über Nacht, um die Anheftung an das Substrat zu ermöglichen, bevor Sie sie mit den gewünschten Wirkstoffen behandeln. Anschließend messen Sie das Behandlungsergebnis mittels Durchflusszytometrie oder einer anderen geeigneten Methode. Zum Sammeln der Zellen waschen Sie diese zweimal mit 10 Milliliter kalzium- und magnesiumfreier PBS.Geben Sie zwei Milliliter der enzymfreien Detachierungslösung hinzu und inkubieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2. Überprüfen Sie die Detachierung der Zellen mit einem umgekehrten Mikroskop. Falls erforderlich, bewegen Sie die Zellkulturschale vorsichtig, um weitere Zellen zu lösen, und achten Sie darauf, sie nicht zu schütteln.Fügen Sie danach 10 Milliliter DMEM mit 10 % FBS hinzu und pipettieren Sie die Zellen vorsichtig fünfmal auf und ab. Untersuchen Sie anschließend die Zellen unter dem Mikroskop. Wenn bereits mehr als 80 % der Zellen dissoziiert sind, ist kein weiteres Pipettieren erforderlich.Wenn sich die Zellen noch in Aggregaten befinden, pipettieren Sie vorsichtig weiter, bis mehr als 80 % der Zellen nicht mehr in Aggregaten vorliegen. Eine optische Kontrolle der Zellen sollte zahlreiche einzelne, runde Zellen mit glatten Membranrändern zeigen. Danach fahren Sie mit der Patch-Clamp- und NLC-Messung wie im Textprotokoll beschrieben fort.HEI-OC1-Zellen, die unter nicht-permissiven Bedingungen kultiviert wurden, zeigten eine hochsignifikante Abnahme der Zellviabilität sowie einen gleichzeitig signifikanten Anstieg des Zelltods im Vergleich zu Zellkulturen unter permissiven Bedingungen. Da die Wirkungen von Wirkstoffen auf Zellen, die bereits im Sterben begriffen sind oder eine verminderte Viabilität aufweisen, von den Wirkungen desselben Wirkstoffs auf gesunde Zellen abweichen können, sollte in jeder auf NP-HEI-OC1-Zellen durchgeführten Zytotoxizitätsstudie großer Aufwand betrieben werden, um Wirkstoffeffekte von den Effekten der Kulturbedingungen zu unterscheiden. Daher empfehlen wir, für Experimente, die nicht ausdrücklich differenzierte Zellen erfordern, HEI-OC1-Zellen zu verwenden, die unter permissiven Bedingungen kultiviert wurden.Die hier gezeigten konfokalen Aufnahmen bestätigen die Expression des auditorischen Motorproteins Prestin in HEI-OC1-Zellen, die bei 33 Grad Celsius und 39 Grad Celsius kultiviert wurden. Beachten Sie, dass Prestin in HEI-OC1-Zellen, die unter permissiven Bedingungen wachsen, vorwiegend im Zytoplasma immunlokalisiert, während es in stärker differenzierten Zellen stärker an der Plasmamembran angereichert ist. Durchflusszytometrische Untersuchungen zeigten in beiden Bedingungen einen deutlichen Anstieg der Prestin-Expression, was darauf hindeutet, dass die Translokation mit einer vermehrten Synthese von Prestin-Molekülen einherging.Andererseits zeigten die elektrophysiologischen Untersuchungen eine starke nichtlineare Kapazität (NLC) in HEI-OC1-Zellen, die bei 33 Grad Celsius wuchsen, wobei der Spitzenwert abnahm und die Spannung bei maximaler Kapazität zu stärker depolarisierten Werten verschob, als die Zellen eine und zwei Wochen lang unter nicht-permissiven Bedingungen gehalten wurden. Interessanterweise legen diese Ergebnisse nahe, dass die motorische Funktion beeinträchtigt sein könnte, wenn die Dichte der Prestin-Moleküle in der Plasmamembran zu hoch ist. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die hier beschriebenen Protokolle eine korrekte Anwendung bewährter Zellkultivierungstechniken erfordern.Denken Sie außerdem daran, Antibiotika zu vermeiden. Außerdem ist zu beachten, dass das Phänotyp und die Reaktion von HEI-OC1-Zellen stark von den Kulturbedingungen abhängen.

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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