Arbeiten mit Auditory HEI-OC1-Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die grundlegenden Verfahren zur Arbeit mit HEI-OC1-Zellen zu beschreiben, die zur Untersuchung der Wirkungen pharmakologischer Arzneimittel auf Hörzellen verwendet werden können und bei der funktionellen Charakterisierung des Motorproteins Prestin helfen. HEI-OC1-Zellen werden von vielen Forschern auf der ganzen Welt in verschiedenen Experimenten mit unterschiedlichen Zielen und Techniken verwendet. Es bleibt zu hoffen, dass die hier beschriebenen Verfahren eine gemeinsame Grundlage bieten, um diese Studien vergleichbar zu machen.

Natürlich können diese experimentellen Verfahren noch verbessert werden. Aber die Unterschiede zu den hier beschriebenen könnten der Schlüssel sein, um möglicherweise widersprüchliche Ergebnisse zu verstehen und zu erklären. In dieser Demonstration beschreiben wir, wie mit HEI-OC1-Zellen gearbeitet wird, beginnend mit einem gefrorenen Aliquot bis hin zur Bereitstellung von Proben, um verschiedene Studien mit weit verbreiteten Techniken durchzuführen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, nehmen Sie ein Fläschchen mit kryokonservierten HEI-OC1-Zellen aus flüssigem Stickstoff und legen Sie es in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Tauchen Sie nur die untere Hälfte des Fläschchens unter und lassen Sie es auftauen, bis nur noch eine kleine Menge Eis im Fläschchen verbleibt. Wischen Sie in einer biologischen Sicherheitswerkbank die Außenseite des Fläschchens mit 70%igem Alkohol ab.

Pipettieren Sie dann die Zellen aus dem Fläschchen und geben Sie das gesamte Volumen Tropfen für Tropfen langsam in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern vorgewärmtem Wachstumsmedium wie DMEM, das mit 10 % FBS ergänzt ist. Entfernen Sie anschließend das DMSO, indem Sie das Röhrchen fünf Minuten lang zentrifugieren. Nach fünf Minuten entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen in neun Millilitern frischem Wachstumsmedium.

Disaggregieren Sie die Klumpen oder Zellschichten, indem Sie die suspendierten Zellen drei- bis viermal zwischen der Pipette und dem Medium fluss- und zurückfließen, wobei die Spitze der Pipette den Boden des Röhrchens berührt. Geben Sie dann das Gesamtvolumen der in Wachstumsmedium suspendierten Zellen in eine unbehandelte Kunststoff-Zellkulturschale mit einem Durchmesser von 100 Millimetern. Inkubieren Sie die Zellen bei 33 Grad Celsius mit 10% CO2.

Entfernen Sie in diesem Schritt das alte Medium und waschen Sie die Zellen mit zwei Millilitern PBS. Bedecken Sie dann die Zellmonoschicht mit 0,25 % Trypsin. Untersuchen Sie die Zellen mit einem inversen Mikroskop, wenn 40 % von ihnen abgelöst wurden.

Schütteln Sie die Kulturschale bei Bedarf vorsichtig, um verbleibende anhaftende Zellen freizusetzen. Resuspendieren Sie die Zellen und entfernen Sie das Trypsin, indem Sie das Röhrchen fünf Minuten lang zentrifugieren. Entsorgen Sie anschließend den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in neun Millilitern frischem Wachstumsmedium. Als nächstes disaggregieren Sie die Klumpen oder Zellschichten, indem Sie die suspendierten Zellen zwischen der Pipette und dem Medium drei- bis viermal flussen, wobei die Spitze der Pipette den Boden des Röhrchens berührt

Fahren Sie mit der Aussaat der Zellen in Zellkulturschalen mit einem Durchmesser von 100 Millimetern fort. Inkubieren Sie sie bei 33 Grad Celsius mit 10 % CO2 und teilen Sie sie so oft wie nötig für die geplanten Experimente oder zur Erzeugung eines neuen Bestands. Zur Differenzierung inkubieren Sie HEI-OC1-Zellen unter den permissiven Bedingungen, bis sie eine Konfluenz von etwa 80 % erreichen.

Inkubieren Sie die Zellen dann zwei bis drei Wochen lang bei 39 Grad Celsius mit 5 % CO2 und wechseln Sie das Medium alle zwei Tage, um abgestorbene Zellen zu entfernen. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Zellen entweder mit einem automatischen Zellzähler oder einem Hämozytometer zählen und die Zellkonzentration auf den gewünschten Wert einstellen. Als nächstes säen Sie die Zellen in eine durchsichtige 96-Well-Platte mit flachem Boden, eine weißwandige 96-Well-Platte oder eine Sechs-Well-Platte.

Falls für den jeweiligen Assay erforderlich, inkubieren Sie die Zellen über Nacht, um das Substrat zu binden, bevor Sie sie mit den interessierenden Arzneimitteln behandeln. Messen Sie dann das Ergebnis der Behandlung durch Durchflusszytometrie oder eine andere geeignete Technik. Um die Zellen zu ernten, waschen Sie sie zweimal mit 10 Millilitern kalzium- und magnesiumfreiem PBS.

Geben Sie zwei Milliliter der enzymfreien Ablöselösung hinzu und inkubieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2. Verwenden Sie ein inverses Mikroskop, um die Ablösung der Zellen zu überprüfen. Bewegen Sie die Zellkulturschale bei Bedarf vorsichtig, um weitere Zellen zu lösen, und achten Sie darauf, sie nicht zu schütteln.

Fügen Sie dann 10 Milliliter DMEM plus 10 % FBS hinzu und pipettieren Sie die Zellen vorsichtig fünfmal auf und ab. Schauen Sie sich danach die Zellen unter dem Mikroskop an. Sind bereits mehr als 80 % der Zellen getrennt, ist kein weiteres Pipettieren erforderlich.

Wenn sich die Zellen noch in Clustern befinden, fahren Sie mit dem vorsichtigen Pipettieren fort, bis mehr als 80 % der Zellen nicht mehr in Clustern sind. Eine optische Kontrolle der Zellen sollte viele einzelne Rundzellen mit glatten Membrankanten zeigen. Fahren Sie anschließend mit Patch-Clamp- und NLC-Messungen fort, wie im Textprotokoll beschrieben.

HEI-OC1-Zellen, die unter nicht-permissiven Bedingungen kultiviert wurden, zeigten eine hochsignifikante Abnahme der Zellviabilität und eine ebenso signifikante Zunahme des Zelltods im Vergleich zu Zellkulturen unter permissiven Bedingungen. Da die Wirkungen des Arzneimittels auf Zellen, die bereits absterben oder eine verminderte Lebensfähigkeit aufweisen, anders sein können als die Wirkungen desselben Arzneimittels auf gesunde Zellen, sollten erhebliche Anstrengungen unternommen werden, um in einer Zytotoxizitätsstudie, die an NP-HEI-OC1-Zellen durchgeführt wird, Arzneimittelwirkungen von den Auswirkungen der Kulturbedingungen zu unterscheiden. Daher empfehlen wir die Verwendung von HEI-OC1-Zellen, die unter permissiven Bedingungen kultiviert wurden, für Experimente, die keine spezifisch differenzierten Zellen erfordern.

Die hier gezeigten konfokalen Bilder bestätigen die Expression des auditorischen Motorproteins Prestin in HEI-OC1-Zellen, die bei 33 Grad Celsius und 39 Grad Celsius kultiviert wurden. Es ist zu beachten, dass Prestin hauptsächlich im Zytoplasma von HEI-OC1-Zellen immunlokalisiert ist, die unter permissiven Bedingungen wachsen, und in den differenzierteren Zellen stärker an der Plasmamembran konzentriert ist. Durchflusszytometrische Studien zeigten einen deutlichen Anstieg der Prestin-Expression unter beiden Bedingungen, was darauf hindeutet, dass die Translokation von der Synthese von mehr Prestin-Molekülen begleitet wurde.

Auf der anderen Seite zeigten die elektrophysiologischen Studien eine robuste NLC in HEI-OC1-Zellen, die bei 33 Grad Celsius wuchsen, mit einem Spitzenwert, der abnahm, und einer Spannung bei Spitzenkapazität, die sich auf die stärker depolarisierten Werte verlagerte, als die Zellen für ein und zwei Wochen in die nicht-permissiven Bedingungen gebracht wurden. Interessanterweise deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die motorische Funktion beeinträchtigt werden könnte, wenn die Dichte der Prestin-Moleküle in der Plasmamembran zu hoch ist. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die hier beschriebenen Protokolle die korrekte Anwendung etablierter Zellkulturtechniken erfordern.

Denken Sie auch daran, den Einsatz von Antibiotika zu vermeiden. Denken Sie außerdem daran, dass der Phänotyp und die Reaktion von HEI-OC1-Zellen stark von den Kulturparametern abhängen.