تصميم واستخدام ومنخفضة التكلفة، الآلي Morbidostat عن التكيف تطور البكتيريا تحت المضادات الحيوية اختيار الدواء

الهدف العام من هذه التجربة هو توصيف المسار التطوري لمقاومة المضادات الحيوية باستخدام موربيدوستات التي تراقب باستمرار نمو البكتيريا وتضبط تركيز المضادات الحيوية ديناميكيا عندما تكتسب البكتيريا مقاومة للأدوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الإعداد مصنوع من مكونات إلكترونية منخفضة التكلفة متاحة بسهولة ويمكن إعادة تكوينها بسهولة لوسائل محددة. سيظهر الإجراءات Po Cheng Liu و Yi Tai Lee ، وكلاهما طلاب دراسات عليا في مختبري.

لتجميع Morbidostat ، ابدأ باستخدام إبرة قياس 18 لثقب ثلاثة ثقوب في غطاء قارورة الاستزراع. قطع ثلاث قطع من أنابيب البولي إيثيلين التي يبلغ طولها حوالي سبعة سنتيمترات وأدخلها في الفتحات الموجودة في الغطاء. استخدم شريطا لاصقا للف حافة الغطاء ليكون بمثابة قالب لخليط Polydimethylsiloxane أو PDMS.

ثم أضف خمسة جرامات من المكون A و 0.5 جرام من المكون B من PDMS في وعاء بلاستيكي سعة 150 مليلتر واستخدم عود أسنان لتقليبه يدويا. قم بتحميل الخليط في حقنة سعة 10 مل. ثم ، باستخدام المحقنة ، قم بحقن خليط PDMS على الغطاء.

اخبز الغطاء بالكامل على حرارة 70 درجة مئوية لمدة ثماني ساعات لعلاج PDMS. بعد ذلك ، باستخدام مكواة لحام ، قم بلحام أنود LED بسلك قياس 24 وكاثود LED بمقاوم الكربون. ثم قم بلحام مقاوم كربون 680 أوم بسلك قياس 24.

استخدم الشريط الكهربائي لعزل وصلة السلك. لحام مجمع كاشف الصور بسلك قياس 24 وباعث كاشف الصور بمقاوم كربون 100 أوم. ثم استخدم شريطا كهربائيا لعزل وصلة السلك.

ضع الصمام الثنائي الباعث للضوء في حامل قارورة الثقافة. باتباع مخطط الدائرة الموضح هنا ، قم بتوصيل الصمام الثنائي الباعث للضوء واستخدم مصدر طاقة بقوة خمسة فولت لتشغيله. تأكد من أن مؤشر LED يعمل باستخدام كاميرا رقمية يمكنها اكتشاف الأشعة تحت الحمراء. الآن ضع كاشف الصور في حامل قارورة الثقافة.

ثم باتباع الرسم التخطيطي ، قم بتوصيل كاشف الصور واستخدم مصدر طاقة بقوة خمسة فولت لتشغيله. قم بتوصيل السلك بجانبي مقاومات كاشف الصور لقياس الجهد عبر لوحة التحكم الإلكترونية. قم بلصق مغناطيس على عمود مروحة التبريد التي تعمل كوحدة التحريك المغناطيسي.

نظرا لأن وحدة التحريك المغناطيسية تتكون من المغناطيس ومروحة التبريد ، فمن الضروري محاذاة رف المروحة مع قارورة الاستزراع. كما أن المسافة بين قارورة الثقافة والمغناطيس أمر بالغ الأهمية لضمان التشغيل المستقر. قم بتوصيل كل قطعة من أنابيب البولي إيثيلين لقارورة الثقافة بالقطعة المقابلة من أنابيب السيليكون للمضخات الصغيرة والزجاجات المتوسطة وزجاجة النفايات.

قم بتشغيل المضخة لمدة ساعة واحدة وقم بقياس الحجم الإجمالي الذي يتم ضخه من الزجاجة المتوسطة إلى قارورة الاستزراع لتحديد معدل المضخة. يجب أن يكون معدل الضخ النموذجي حوالي أربعة ملليلتر في الساعة ، وهو ما يتوافق مع معدل التخفيف D يساوي 0.33 في الساعة لحجم عمل 12 مليلتر من قارورة الاستزراع. عند اكتمال الإعداد ، ضع المجموعة بأكملها على حاضنة اهتزاز متوسطة الحجم.

لاختبار Morbidostat مسبقا ، اضبط جهد مصدر الطاقة لمروحة التبريد على خمسة فولت لبدء تشغيل محركها لاختبار شريط التحريك المغناطيسي. بعد تحضير سلسلة من عينات الإشريكية القولونية ورسم منحنى المعايرة وفقا لبروتوكول النص ، قم بإعداد قارورة الاستزراع بثلاثة أطوال سبعة سنتيمترات من أنابيب Tygon شديدة المقاومة للمواد الكيميائية بقطر داخلي يبلغ 132 بوصة وقطر خارجي يبلغ 332 من البوصة للمداخل لتشكيل الجهاز. قم بإعداد الوسط الأدنى M9 مع 0.2٪ جلوكوز و M9 الذي يحتوي على عقار Trimethoprim أو TMP.

ثم قم بتعقيم الزجاجة المتوسطة والمتوسطة والزجاجة المتوسطة للدواء وزجاجة النفايات وقارورة الثقافة في الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية. في اليوم الأول من التجربة ، قم بإذابة مليلتر واحد من خلايا E-coli MG1655 من النوع البري المجمد في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ونقل 120 ميكرولترا من الخلايا إلى قارورة مزرعة تحتوي على ما يقرب من 12 مل من وسط نمو M9. قم بتشغيل حاضنة الاهتزاز واضبط درجة الحرارة على 30 درجة مئوية دون اهتزاز.

ابدأ عملية Morbidostat عن طريق تشغيل المضخة الدقيقة ووحدة التحريك المغناطيسية وقياس الكثافة البصرية. بعد حوالي 23 ساعة ، أوقف المضخة الصغيرة عن طريق إيقاف تشغيل جهد الإمداد الخاص بها وإخراج قارورة الاستزراع. أضف 15٪ جلسرين إلى قارورة المزرعة وقم بتجميد العينات عند سالب 80 درجة مئوية للتخزين.

التحول إلى قارورة ثقافة جديدة في بداية كل من هذه التجارب أمرا مهما أيضا لتجنب تكوينات البيوتين. خلاف ذلك ، يمكن أن يحدث تكوين البيوتين في غضون يومين أو ثلاثة أيام. بعد إذابة العينة المجمدة اليومية في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، قم بتلقيح أنبوب اختبار جديد بوسط M9 الطازج.

ضع العينة في حاضنة اهتزاز عند 37 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، استخدم وسيط M9 لتخفيف العينة الميكروبية عشرة أضعاف وتحميلها في جهاز الموائع الدقيقة عن طريق الضغط على حاوية العينة الميكروبية عند خمسة رطل لكل بوصة مربعة. ثم قم بتحميل الوسيط المحتوي على TMP في الرقاقة عن طريق الضغط على M9 بحاوية TMP عند خمسة رطل لكل بوصة مربعة.

قم بإجراء الخلط بين الميكروب والدواء عن طريق تشغيل الصمام الميكانيكي الدقيق بين الغرفتين على شريحة الموائع الدقيقة لمدة 15 دقيقة. أخيرا ، ضع شريحة الموائع الدقيقة في حاضنة المجهر المثبتة على المجهر المقلوب. باستخدام كاميرا CCD ، احصل على صور خلوية في غرفة النمو كل ساعة لمدة ثماني ساعات.

احسب بيانات رقم الخلية وفقا لبروتوكول النص. تم إبطال عمليات Morbidostat الشائعة بما في ذلك التطور التجريبي واختبار الحساسية للمضادات الحيوية وفحص مورفولوجيا الخلية باستخدام ثقافة E-coli MG1655 المعرضة للمضاد الحيوي TMP ، مما يؤدي إلى زيادة مميزة في مقاومة الأدوية مع الطفرات المتجمعة حول جين اختزال ثنائي هيدروفولات ، أو DHFR. كل يوم ، من المتوقع أن ينمو الميكروب فوق عتبة الكثافة البصرية المحددة مسبقا ويؤدي إلى حقن الدواء كما هو موضح هنا.

من المتوقع أن يمنع حقن الدواء النمو ، ونتيجة لذلك ، يقلل من الكثافة البصرية. توضح هذه المؤامرة الزيادة الزمنية في مقاومة المضادات الحيوية للأدوية في تجربة لتحديد IC50. زادت مقاومة الدواء بمقدار 1500 ضعف تقريبا إلى 1000 ميكروغرام لكل مليلتر على مدى حوالي 12 يوما.

بما يتفق مع النتائج السابقة. تم قياس طفرات نقطة DHFR في اليوم الأخير المتحولة بواسطة تسلسل Sanger وهي مدرجة في هذا الجدول. يثبت اكتساب مقاومة الأدوية مع طفرات متعددة فائدة موربيدوستات.

نظرا لأن اختيار الدواء الذي يحتوي على ألواح أجار يميل إلى منح الطفرة الفردية فقط. يعرض هذا الشكل منحنيات نمو الرقاقة بتركيزات مختلفة من TMP. تظهر العينات الطافرة زيادة كبيرة في مقاومة الأدوية بالمضادات الحيوية.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لدراسة موضع مقاومة الأدوية بالمضادات الحيوية في بيئة مختبرية تحكم حقيقية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء تدابير أخرى مثل قياس الخلية المفردة للموائع الدقيقة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل التشكل الذي لا يزال يتغير بسبب التعرض لأدوية المضادات الحيوية. بمجرد إتقانه ، يمكن إعادة تكوين هذا الجهاز بسهولة لجميع تجارب الثقافة البكتيرية مثل زراعة علامة على البكتيريا أو زيادة مستوى تحمل التكلفة للسلالة البكتيرية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية دراسة اكتساب مقاومة الأدوية بالمضادات الحيوية في تجربة تطورية مختبرية تكيفية حقيقية. لا تنس التعامل مع البكتيريا المقاومة للأدوية وفقا لقواعد السلامة الحيوية للممارسة الميكروبيولوجية. قد تكون هناك حاجة إلى إذن خاص لتجربة تتضمن التدريب الأساسي للبكتيريا.